La infección por VIH causa disfunción inmune incluso en individuos sometidos a terapia antirretroviral sin virus detectable. Este método permite el estudio de la función monocitos que son reguladores clave de la respuesta inmune. Hemos optimizado esta técnica para el aislamiento, la cultura y la transfección de monocitos primarios humanos.
Utilizamos este método para entender los mecanismos moleculares de la disfunción inmune en individuos infectados por el VIH, pero se puede aplicar a cualquier otro estudio inmunológico que involucre monocitos. Si es la primera vez que trabaja con sangre humana, recuerde seguir los protocolos de bioseguridad adecuados y tratar todas las muestras como material posiblemente infeccioso. Después de recolectar 40 mililitros de sangre entera humana fresca en cuatro tubos de vacío EDTA de 10 mililitros, utilice una técnica estéril para transferir toda la sangre a un solo tubo de propileno cónico de 50 mililitros en un gabinete de bioseguridad.
Siguiendo las instrucciones del fabricante de un kit de aislamiento de monocitos humanos seleccionado, agregue dos mililitros de cóctel de aislamiento monocito del kit al tubo de sangre y vórtice las perlas magnéticas del kit durante 30 segundos. Añadir dos mililitros de cuentas a la sangre y utilizar una pipeta serológica de 25 mililitros para mezclar cuidadosamente las cuentas con la sangre. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, dividir la sangre por igual entre cuatro tubos de 50 mililitros y añadir 30 mililitros de PBS estéril suplementado con un EDTA mililolar a cada tubo.
Mezcle de nuevo con una pipeta serológica de plástico de 25 mililitros y coloque los tubos en soportes magnéticos. Después de 10 minutos, utilice una pipeta para extraer el contenido del centro de cada tubo teniendo cuidado de no aspirar más de un mililitro de glóbulos rojos y dispensar el contenido del tubo en uno de los cuatro nuevos tubos de 50 mililitros. Agregue 500 microlitros adicionales de las perlas magnéticas con vórtices a cada tubo y mezcle suavemente la solución celular.
Vuelva a colocar los tubos en los soportes magnéticos durante cinco minutos antes de transferir cuidadosamente el contenido desde el centro de cada tubo a uno de los cuatro nuevos tubos de 50 mililitros. Cuando se hayan transferido todas las suspensiones celulares, coloque cada nuevo tubo de 50 mililitros en los soportes de imán durante cinco minutos antes de transferir cuidadosamente el contenido del tubo a un tercer conjunto de cuatro nuevos tubos de 50 mililitros. Luego recoger las células por centrifugación y resuspender los cuatro pellets celulares en un total de 10 mililitros de PBS estéril para el conteo.
Después de contar, resuspender los monocitos aislados en un uno por 10 a las sextas células por mililitro de 37 grados Celsius sin suero RPMI 1640 medio complementado con antibióticos y placa un mililitro de células resuspendadas en placas de 35 milímetros en un gabinete de bioseguridad. Luego coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante 30 a 60 minutos para permitir que las células se adhieran a los fondos de los pozos. Para preparar los macrófagos con un fenotipo similar a M1, agregue 100 microlitros de suero bovino fetal que contengan 25 nanogramos por mililitro de GM-CSF a cada plato.
Para preparar los macrófagos con un fenotipo similar a M2, agregue 100 microlitros de bovino fetal que contengan 50 nanogramos por mililitro de M-CSF a cada plato. Para la transfección de monocitos con microRNA imitación, inhibidores o un pequeño ARN interferente, siguiendo el protocolo del fabricante para el kit de transfección, diluya los ARN seleccionados en el tampón a una concentración final de 1,83 micromolares en 10 microlitros de mímica o inhibidor diluido por transfección de un por 10 a las células del quinto volumen. Para preparar el reactivo de transfección, añada un microlitro del polímero proporcionado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y añada inmediatamente 90 microlitros del tampón proporcionado por el kit para obtener un total de 91 microlitros de reactivo por transfección.
Vórtice el regente durante tres a cinco segundos y pipetear 90 microlitros de la solución de transfección en el tubo que contiene 10 microlitros de ARN diluido. Después de una mezcla suave, incubar la solución durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de añadir 100 microlitros de complejo de transfección a un pozo de células. Después de cuatro horas a 37 grados centígrados, sustituya el medio por tres mililitros de medio completo que contengan el factor de crecimiento adecuado.
En el sexto día de cultivo, reemplazar los sobrenadantes de cultivo de los cultivos M1 con tres mililitros de medio complementados con suero bovino fetal, antibióticos, lipopolisacárido e interferón gamma y reemplazar los sobrenadantes de los cultivos M2 con medio complementado con suero bovino fetal, antibióticos, M-CSF e interleucina-4. Después de 24 horas de cultivo, lave cada plato de macrófagos activados dos veces con PBS fresco por lavado. Para análisis de ARN y proteínas, lice las células adheridas directamente en las placas para permitir la recolección del contenido celular liberado para su análisis.
Para el análisis citométrico de flujo, desensabrar las células con dos EDTA milimotoras en PBS durante 10 minutos a 37 grados Celsius antes de raspar suavemente las células de los fondos de las placas para permitir su recolección en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para su análisis. Aquí se muestran histogramas representativos de control activado por M1 y células derivadas del paciente con niveles aumentados de células activadas por CD80 y CD83 y M2 con niveles aumentados de CD163 y CD209 en comparación con las células T0 no activadas. Curiosamente, CD80 y CD83 parecían estar más expresados en células derivadas del control en comparación con las células derivadas del VIH.
La transfección de monocitos recién recogidos con un microARRRO de radiofón cercano revuelto da como resultado una eficiencia superior al 90% de la transfección determinada por la citometría de flujo y la microscopía confocal. Además, la transfección no reduce significativamente la viabilidad de las células derivadas del paciente o de control, independientemente de la etapa de maduración celular o de las condiciones de transfección. La transfección da lugar a una regulación efectiva del gen objetivo tras la transfección con el pequeño ARN interferente específico en el primer día y el cuarto día después del aislamiento.
Además, las células transfectados con imitación de microARN demuestran un aumento de 48 a 72 veces en la expresión de microARN sobre las células no traficadas, mientras que todos los controles de transfección no muestran cambios apreciables. El número de células chapadas es fundamental para la supervivencia. Recomendamos un millón de células por plato de 35 milímetros.
El revestimiento en medio libre de suero también mejorará en gran medida la fijación celular. Las células obtenidas con este método pueden tratarse con citoquinas o factores de crecimiento para estudiar las respuestas diferenciales en pacientes de interés y controles saludables.
