Genotyping es el proceso de detectar la presencia o ausencia de ADN específico de las secuencias en el genoma de un organismo particular.
Puesto que los genes pueden influir el fenotipo del ratón, pudiendo sondeo genético un ratón individual o "genotipo" es crítico para atribuir un fenotipo a un gen específico. Este video explora genética del ratón, demostrar pasos claves del procedimiento de genotipado y explicar cómo interpretar resultados de genotipificación basada en PCR.
Para entender lo que los investigadores buscan cuando ellos ratones de genotipo, vamos a repasar algunas manipulaciones comunes a la genética del ratón.
Para estudiar un gen, los científicos con frecuencia interrumpen su función mediante la alteración de su secuencia genética. Sin embargo, los ratones son diploides, por lo que tienen dos copias de cualquier gen dado. Puesto que la mayoría de los genes necesita una única copia normal a la función, los ratones deben ser criados para producir un animal con ambos genes interrumpidos antes de estudiar el fenotipo de.
Este genotipo se llama un "knockout homocigótica", o más comunmente apenas "knockout" para el cortocircuito. Por el contrario, un ratón normal con dos copias funcionales se llama un "homocigótica tipo salvaje" o simplemente "wildtype". Por último, ratones con una sola copia funcional se denominan "heterocigoto", o "hets."
En vez de quitar el material genético, algunos experimentos requieren la introducción de secuencias de ADN en el genoma del ratón. Estos fragmentos de ADN insertados son llamados "transgenes" y los ratones que llevan son "transgénicos". "Transgén" más común en ratones es el que conduce la expresión de la proteína verde fluorescente o GFP, de medusas. Mediante el uso de un promotor específico de tejido (una secuencia reguladora que "promueve" la actividad de un gen) a unidad de producción de GFP, las células de un tipo de tejido específico pueden identificarse fácilmente por fluorescencia verde.
Porque muchos cambios genéticos no conducen a un fenotipo fácilmente observable, como la expresión de GFP, ratones necesitan ser genotipados para determinar qué animal específico debe ser utilizado en los experimentos. Antes de genotipado, ratones deben ser etiquetados cuidadosamente para que puedan ser identificados más tarde. No, usted necesitará algo más permanente que el. Un método común es hacer muescas en la oreja, tal que la posición y el número de muescas corresponde a un número de identificación.
Una vez que el ratón esté etiquetado, recoger un pedazo pequeño de tejido (normalmente 2, 5 mm de la cola, con un razorblade o tijeras) desde la que extraer ADN. Si estás recopilando tejido de más de un ratón, marcar los segmentos utilizados de la hoja para que no utilizar la misma parte en el siguiente animal, que podría dar lugar a contaminación cruzada en sus muestras.
Para iniciar el proceso de separar el material genético de otros componentes del tejido, se digiere la muestra en tampón de lisis que contienen la proteinasa K. de la enzima Después de una digestión durante la noche, la muestra se centrifuga a pellet de pelo y cualquier otro material sin digerir. Para aislar el ADN de la digerida lisado, un método simple y eficaz es añadir alcohol para precipitar los ácidos nucleicos. Después de una breve incubación, la muestra se centrifuga otra vez para recoger el ADN en una pelotilla.
Después de lavar con etanol al 70% para eliminar el exceso de sales, el pellet de ADN se resuspendió en agua o tampón y está listo para su genotipado.
Son muchas las estrategias para determinar si una secuencia de ADN específica está presente en sus ratones. La mayoría de ellos requieren ampliar primero la región genética de interés utilizando la reacción en cadena de polimerasa, o PCR. Para más información sobre cómo configurar la polimerización en cadena, por favor revise la enseñanza de las Ciencias JoVE "Guía PCR."
Un método para distinguir genotipos es para detectar cambios en el tamaño del fragmento amplificado por PCR. Digamos que usted está detección de ratones con una inserción genética de 700 pares de bases. Después de la polimerización en cadena, bandas de tipo salvaje son 200 pares de bases, y bandas de transgen debe 900 pares de bases.
Después de ejecutar su PCR, separar los productos de reacción en un gel de agarosa del porcentaje correspondiente, por lo que se pueden distinguir los tamaños de sus fragmentos. El control de tipo salvaje sólo debe tener la base par wildtype banda 200; el control de transgénico sólo debe tener el 900 pares, banda del transgen; y el control de het debe tener ambas bandas. Finalmente, un control "sin plantilla" se incluye sin duda los reactivos no contienen ninguna DNA contaminante y por lo tanto no deberían generar algún grupo.
Ahora que estamos seguros de que los controles trabajados como se esperaba, vamos a ver los ratones desconocidos. Ya que ratones 1 y 2 cada una, banda de tipo salvaje, son tipo salvaje homocigótico. Ratones cada 4 y 6 tienen solamente uno, transgén banda y son por lo tanto homocigótica transgénicos.
Y ratones 3 y 5 disponen de dos bandas y por lo tanto hets.
Por último, cuando vuelvas a encontrar los ratones con el genotipo que desee, basta hacer coincidir el patrón de las muescas de la oreja con número de identificación del ratón.
Después de ganar una comprensión de Genotipado de qué es y cómo se hace, vamos a ver algunos ejemplos de por qué es útil.
En algunos casos, modificaciones genéticas más complejos son necesarios para producir el fenotipo deseado. Por ejemplo, para establecer este modelo de cáncer de piel en ratones, se requieren dos transgenes. Uno lleva un "oncogén" inducible o un gen que puede causar cáncer, y el segundo lleva el recombinase de Cre de enzima, que sólo se expresa en las células cutáneas y accisas una secuencia que impide la transcripción del oncogen, lo que permite la expresión del oncogene. Para producir descendencia con ambos los transgenes, se aparearon ratones heterocigotos para cada uno. Genotipificación se utiliza para identificar la descendencia deseada.
A veces no puede ser posible a los ratones de genotipo antes de un experimento. Por ejemplo, en este estudio de la frecuencia cardíaca embrionaria, no es factible recolectar tejido para la genotipificación de los embriones sin alterar su comportamiento. Por lo tanto, la posición del embrión dentro de la madre primero se etiqueta cuidadosamente, y luego se registran las mediciones de ultrasonido. Finalmente, se recogen las biopsias de la cola para determinar el efecto del genotipo sobre la frecuencia cardiaca.
Este video ha demostrado un método de extracción de ADN, pero hay muchas variaciones. Por ejemplo, el sistema de PCR directa requiere menos de cinco minutos de digestión de tejido. Además, después del centrifugado materia no digerida, el sobrenadante está listo para PCR, eliminando la necesidad de purificación de DNA.
Sólo ha visto a Guía de Zeus a los ratones de genotipificación. En este video, hemos analizado los conceptos básicos de la genética del ratón, para preparar y analizar ADN de ratón muestras, así como algunas aplicaciones prácticas de esta técnica. ¡Gracias por ver!
