Este trabajo fue apoyado por un programa de H &amp; H Lee Investigación Residente Quirúrgico Eruditos (a JAN), una Fundación AO Start-Up subvención S-12-03M (a LSM) y los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01-AI078910 (a LSM) .

<ol>
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JAM, BNT, EL, NZ, KPF se pagan los empleados de PerkinElmer, que fabrica los instrumentos de imagen, siempre que el Xen29 bioluminiscente S. aureus cepa, y pagó por los gastos de publicación de este video-artículo. El resto de los autores no tienen nada que revelar.

La multimodalidad de imágenes tales como las técnicas de imagen que utilizan en imágenes ópticas vivo en conjunción con las imágenes μCT proporciona un nuevo enfoque tecnológico que permite la visualización 3D, la cuantificación y el seguimiento longitudinal de los procesos biológicos en un contexto anatómico 1-4. Los protocolos en el presente estudio proporcionan información detallada de cómo in vivo bioluminiscente y fluorescente de imágenes pueden ser combinadas con imágenes μCT en un modelo de infección ortopédica protésica del implante en ratones para monitorizar la carga bacteriana, inflamación neutrofílica y cambios anatómicos en el hueso de forma no invasiva y longitudinalmente más tiempo. En su conjunto, la información obtenida mediante la combinación de imágenes ópticas y estructural representa un importante avance tecnológico, que puede ser especialmente adecuado para estudiar los procesos biológicos y las condiciones patológicas que afectan al sistema músculo-esquelético. Un interéshallazgo ción que debe señalarse es que se observó que las señales fluorescentes-EGFP neutrófilos disminuyó a los niveles de fondo por 14 a 21 días y se mantuvo en los niveles de base para la duración del experimento a pesar de la presencia de bacterias bioluminiscentes. Es poco probable que la irradiación de rayos X afectado la supervivencia de neutrófilos como se observó una cinética similar de las señales de neutrófilos en ratones no irradiados 19. En nuestro trabajo anterior que implica un modelo de S. heridas infectadas aureus, la infiltración de neutrófilos participan una combinación robusta de reclutamiento de neutrófilos de la circulación, la supervivencia prolongada de los neutrófilos en el sitio de infección y el homing de las células progenitoras KIT + para el absceso, donde localmente dan lugar a madurar neutrófilos 23. Es probable que los procesos similares contribuyeron a la infiltración de neutrófilos en el implante ortopédico S. modelo de infección aureus. Aunque se desconoce por qué las señales de neutrófilos disminuyó en el orthopmodelo de infección aédico, podría ser que la respuesta inmune cambió con el tiempo como esta infección progresó de una infección aguda a crónica y este es un tema de investigación futura. Existen limitaciones con este modelo de ratón de infección articular protésica ortopédica y el vivo de imágenes multimodalidad en que debe señalarse. En primer lugar, este modelo de ratón es una simplificación de los procedimientos reales y los materiales utilizados en cirugía ortopédica en seres humanos 24. Sin embargo, este modelo hace recapitular la infección crónica y la inflamación resultante en el hueso y tejido de las articulaciones que se ve en las infecciones de implantes ortopédicos humanos 8,9. Además, para obtener las imágenes μCT, se utilizaron dosis relativamente bajas de irradiación de rayos X para minimizar los efectos adversos sobre la salud de los animales durante el curso de la infección. Para mejorar la resolución de hueso, dosis más altas de radiación de rayos X podría ser utilizado para obtener imágenes de μCT en un sacrificadosnimals. Sin embargo, esto eliminaría la capacidad de supervisar de forma no invasiva y longitudinalmente los cambios en el hueso largo de la duración de los experimentos. En conclusión, las imágenes multimodalidad que implica la combinación de imágenes ópticas animal completamente en vivo con imágenes μCT anatómica ha permitido obtener información más completa sobre la infección y la respuesta inflamatoria. Además, estas técnicas han permitido la evaluación de las consecuencias de la infección y la inflamación en el hueso y tejido de las articulaciones. El trabajo futuro podría aprovecharse de formación de imágenes multimodalidad para evaluar la eficacia de las terapias antimicrobianas, las respuestas inmunes, la patogénesis de la enfermedad y los cambios reactivos en el hueso como hemos comenzado a investigar 14-18. Además, las imágenes multimodalidad podría evaluar sondas y marcadores para diagnosticar la presencia de una infección como se describió previamente en modelos animales de una infección del muslo, endocarditis, Infect pulmonariones y las infecciones de biomateriales 25-28. Por último, el uso de la proyección de imagen multimodalidad podría expandirse más allá de las enfermedades infecciosas y se utiliza en todas las disciplinas, incluyendo ortopedia, reumatología y oncología, para investigar otras condiciones que impactan el sistema músculo-esquelético, como el cáncer óseo, enfermedad metastásica, las fracturas y la artritis 5-7 .

Multimodalidad técnicas de imagen preclínica que implican la combinación de información óptica y anatómica permiten la visualización y monitoreo de los fenómenos biológicos en 3D 1-4. Desde μCT de imágenes permite la exquisita visualización de la anatomía del hueso, el uso de imágenes μCT en conjunción con de formación de imágenes ópticas representa una combinación única que podría ser especialmente útil para la investigación de procesos que involucran la biología ósea 5-7. Un ejemplo sería el uso de estas técnicas para estudiar infecciones de implantes ortopédicos, que representan una complicación desastrosa después de procedimientos quirúrgicos ortopédicos 8,9. Bacterias biopelículas se forman en los objetos extraños implantados que promueven la supervivencia de las bacterias al servir como una barrera física que evita que las células inmunes de la detección de la infección y bloquea el acceso a los antibióticos a las bacterias 10,11. La infección crónica y persistente del tejido de las articulaciones (artritis séptica) und hueso (osteomielitis) induce la resorción ósea que conduce al aflojamiento de la prótesis y 8,9 eventual falla. Esta osteolisis periprotésica resultante se asocia con una mayor morbilidad y mortalidad 12,13. En nuestro trabajo anterior, se utilizó in vivo bioluminiscente y fluorescente de imágenes, junto con los rayos X y tomografía micro-computarizada (μCT) en un modelo de infección de la articulación protésica ortopédica en ratones 14-19. Este modelo implicó la colocación de un alambre de titanio Kirschner-(K-hilos) de una manera tal que el extremo cortado del implante extendida en la articulación de la rodilla de los fémures de ratones 14-19. A continuación, un inóculo de Staphylococcus aureus (cepa bioluminiscente Xen29 o Xen36) se pipeteó sobre la superficie del implante en la articulación de la rodilla antes de la zona quirúrgica se cerró 14-19. In vivo de imágenes ópticas se utilizó para detectar y cuantificar las señales bioluminiscentes, que correspondió a la number de bacterias en el tejido de las articulaciones y el hueso infectado 14-19. Además, in vivo de fluorescencia de imágenes de los ratones LysEGFP, que poseen los neutrófilos fluorescentes 20, se utilizó para cuantificar el número de neutrófilos que emigraron a las articulaciones de la rodilla infectadas que contienen los implantes K-alambre 14,19. Por último, las modalidades de imágenes anatómicas, incluyendo imágenes de alta resolución de rayos X e imágenes μCT, permite respectiva 2D y 3D la imagen anatómica del hueso afectado por toda la duración de la infección crónica, que nos arbitrariamente terminar normalmente entre 2 y 6 semanas postoperatorias 16 , 18. Utilizando este modelo, la eficacia de la terapia antimicrobiana local y sistémico, las respuestas inmunes protectoras y cambios anatómicos patológicos en el hueso podría evaluarse 14-18. En este manuscrito, los protocolos de detalle de las modalidades de imágenes ópticas y μCT en este modelo de infección articulación protésica ortopédica fueron proporcionados como Representatisistema para estudiar los procesos biológicos en el contexto anatómico del hueso ve. Estos incluyen los procedimientos quirúrgicos para modelar una infección articulación protésica ortopédica en ratones, 2D y 3D en los procedimientos de imagen óptica in vivo (para detectar señales bioluminiscentes bacterianas y señales fluorescentes neutrófilos), adquisición y análisis de imágenes μCT y co-registro de imágenes ópticas en 3D con la imágenes μCT.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Soy Agar</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysEGFP knockin mouse strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue Products, Stamford, CT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter)</td>
			<td>Synthes, West Chester, PA</td>
			<td>492.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire Cutter - Duracut T.C.</td>
			<td>H&#38;H Company, Ontario, Canada</td>
			<td>83-7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL</td>
			<td>118718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting)</td>
			<td>Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International.</td>
			<td>95056-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml)</td>
			<td>Zoopharm, Windsor, CO</td>
			<td></td>
			<td>analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/IVISSPE?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">IVIS Spectrum Imaging System</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>optical in vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Quantum%20FX%20%20microCT?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">Quantum FX in vivo &#956;CT system</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>&#956;CT in vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Living%20Image%20Software?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">IVIS SpectrumCT Imaging System</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>combined optical and &#956;CT in vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/119240?utm_source=JoVE&amp;utm_medium=display&amp;utm_content=LST-IDT2014-GLO-Q414-JoVE&amp;utm_campaign=LST-IDT2014-GLO">Living Image Software</a></td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software for in vivo optical imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined in vivo optical and &#181;ct imaging to monitor infection, inflammation, and bone anatomy in an orthopaedic implant infection in mice

Formación de imágenes multimodalidad ha surgido como un enfoque tecnológico común utilizado tanto en la investigación preclínica y clínica. Las técnicas avanzadas que combinan en imágenes ópticas y μCT vivo permiten la visualización de los fenómenos biológicos en un contexto anatómico. Estas técnicas de imagen pueden ser especialmente útiles para estudiar las condiciones que el hueso impacto. En particular, las infecciones de implantes ortopédicos son un problema importante en la cirugía ortopédica clínica. Estas infecciones son difíciles de tratar debido a las biopelículas bacterianas se forman en los materiales implantados quirúrgicamente extranjeras, lo que lleva a la inflamación persistente, la osteomielitis y la eventual osteolisis del hueso que rodea el implante, que finalmente resulta en el aflojamiento del implante y el fracaso. Aquí, se utilizó un modelo de ratón de un implante de prótesis ortopédica infectado que implicó la colocación quirúrgica de un implante de Kirschner hilos en un canal intramedular en el fémur de tal manera que el extremo del implante eXtended en la articulación de la rodilla. En este modelo, los ratones LysEGFP, una cepa de ratón que tiene los neutrófilos EGFP fluorescentes, fueron empleados en conjunción con un bioluminiscente cepa de Staphylococcus aureus, que emite luz natural. Las bacterias se inocularon en las articulaciones de las rodillas de los ratones antes de cerrar el sitio quirúrgico. In vivo bioluminiscente y fluorescente de formación de imágenes se utilizó para cuantificar la carga bacteriana y la respuesta inflamatoria de neutrófilos, respectivamente. Además, las imágenes μCT se realizó en los mismos ratones para que la ubicación 3D de las señales ópticas fluorescentes bioluminiscente y podría ser co-registrado con las imágenes anatómicas μCT. Para cuantificar los cambios en el hueso con el tiempo, el volumen de hueso exterior de los fémures distales se midió en puntos de tiempo específicos utilizando un proceso de segmentación basado contorno semi-automatizado. Tomados en conjunto, la combinación de formación de imágenes in vivo bioluminiscente / fluorescente con imágenes μCT puede ser especialmente útil fo la monitorización no invasiva de la infección, respuesta inflamatoria y los cambios anatómicos en el hueso a través del tiempo.

En bioluminiscente vivo e imágenes fluorescentes En el presente estudio, el protocolo se describe para este modelo publicado previamente de una infección conjunta de prótesis ortopédica en ratones 14-19, que implica la colocación quirúrgica de un implante de K-alambre de titanio que se extiende desde un canal intramedular en el fémur en la articulación espacio de 14 a 19. S. aureus cepa bioluminiscente Xen29 (1 x 10 3 UFC en 2 l de PBS) se pipeteó directamente en la parte superior del implante de titanio fin en la articulación de la rodilla antes de cerrar el sitio quirúrgico 16. Para visualizar y cuantificar la carga bacteriana y neutrófilos afluencia de forma no invasiva en ratones anestesiados LysEGFP, se realizó de imágenes ópticas animal completamente en vivo secuencialmente imagen las señales bioluminiscentes de las bacterias y las señales fluorescentes EGFP de los neutrófilos que infiltran utilizando el animal completamente óptica IVIS Spectrum en vivosistema de imágenes en tres días del postoperatorio (es decir, días 2, 14 y 28). Las señales bioluminiscentes de ratones infectados por Xen29 mantuvieron por encima de las señales de fondo de ratones sham-infectados durante la duración del experimento (Figura 1 A, C) 16. Nuestro trabajo anterior demostró que las señales bioluminiscentes in vivo aproximadas estrechamente el número de CFU ex vivo aislados del / tejido óseo conjunta y adherente a los implantes 17,18. Además, las señales fluorescentes EGFP fueron mayores que los ratones de simulacro infectadas en los puntos de tiempo tempranos, pero se acercaron a los niveles de fondo durante el curso de la infección (Figura 2B, C) ​​16. Co-registro 3D de las señales ópticas en vivo con imágenes μCT Para visualizar las señales ópticas (señales es decir, bioluminiscentes bacteriana y fluorescentes EGFP) en el contexto anatómica de las articulaciones de la rodilla post-quirúrgicas in 3D, las imágenes ópticas generadas utilizando el sistema de imágenes IVIS Spectrum fueron co-registradas con imágenes μCT generados usando el sistema de imágenes de Quantum FX μCT. Esta co-registro podría lograrse porque la cámara de imágenes de ratón podría ser insertado en cualquiera de las máquinas para asegurar que los ratones estaban en la misma orientación exacta. Para verificar esta precisión, los resultados se compararon con una adquisición de imágenes realizado mediante el CT Spectrum-in vivo del sistema de formación de imágenes IVIS que integra ambas modalidades en un instrumento sin requerir reubicación física del animal. Para asignar los datos óptica sobre las imágenes μCT en 3D, se utilizó una tomografía óptica difusa algoritmo de reconstrucción 16. La reconstrucción 3D resultante se muestra (Película 1). Además, las imágenes μCT permite la visualización y cuantificación de los consiguientes cambios en la calidad y dimensiones de los huesos que se produjo durantela infección (Figura 2) 16. Como se informó anteriormente, el volumen de hueso exterior del fémur distal aumentó considerablemente con el tiempo (Figura 2A) 16. Para cuantificar estos cambios, se realizó análisis de imagen volumétrica 3D en el distal 25% de la superficie ósea de fémur y los cambios en el volumen de hueso con el tiempo se normalizaron al volumen inicial del hueso. El volumen de hueso exterior aumentó considerablemente en los ratones infectados en comparación con ratones infectados de manera simulada (Figura 2B) 16. El aumento en el volumen de hueso fémur distal exterior era probablemente debido a daño óseo causada por la infección del tejido y el hueso articular, que se observaron utilizando μCT de formación de imágenes y el análisis histológico 16. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51612/51612fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. 2D in vivo </strong&gt; señales fluorescentes y bioluminiscentes. S. aureus Xen29 o no bacterias (no infectados) se inocularon en la articulación de la rodilla después de la colocación de Kirschner y ratones LysEGFP fueron imágenes utilizando el sistema de imágenes IVIS Spectrum 16. (A) Media in vivo señales bioluminiscentes medida por flujo total (fotones / seg) ± sem. (B) La media in vivo EGFP señales fluorescentes, medido por el total de la eficiencia radiante (fotones / s) / (mW / cm 2) ± sem. (C) Representación en vivo bioluminiscente y señales fluorescentes superpuestos en una fotografía en blanco y negro imagen de los ratones. El límite de detección de la carga bacteriana in vivo usando bioluminiscente de imágenes es de entre 1 x 10 2 y 1 x 10 3 UFC. * P &lt;0,05, † p &lt;0,01, ‡ p &lt;0,001 ratones infectados Xen29 frente a los ratones sham-infectados (prueba t de Student [dos colas]). Por favor,en cuenta que es una figura representativa que incluya los datos publicados previamente generados usando Xen29 y fotografiados con el sistema de imágenes IVIS Lumina XR 16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51612/51612fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51612/51612fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. 3D μCT imágenes. S. aureus Xen29 o no bacterias (no infectados) se inocularon en la articulación de la rodilla después de la colocación de Kirschner y los ratones fueron imágenes utilizando el Quantum FX en vivo sistema μCT. (A) Representante representaciones 3D μCT de Xen29 ratones infectado con (paneles superiores) y los ratones sham infectados (paneles inferiores). (B) Porcentaje de cambio de volumen de hueso exterior (25% distal de los fémures) normalizada a la TI inicialme punto (media ± SEM). * P &lt;0,05, † p &lt;0,01, ‡ p &lt;0,001 ratones infectados Xen29 frente a los ratones sham-infectados (prueba t de Student [dos colas]). Tenga en cuenta que esto es una figura representativa que incluya los datos publicados previamente generados utilizando la cepa bioluminiscente S. aureus Xen29 y fotografiada con el FX en vivo μCT sistema 16 imágenes Quantum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51612/51612fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51612/Movie_1.mpg" target="_blank">Película 1</a> . Representante 3D co-registro anatómico de las señales bioluminiscentes Xen29 y las señales fluorescentes-EGFP neutrófilos en combinación con las imágenes μCT. Las imágenes se giran en el eje vertical.

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Combined In vivo Optical and  &amp;#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combinado de imágenes ópticas y μCT en un modelo de ratón de infección implante ortopédico, la utilización de una cepa bioluminiscente ingeniería de Staphylococcus aureus, siempre que la capacidad de supervisar de forma no invasiva y longitudinalmente la dinámica de la infección bacteriana, así como la respuesta inflamatoria correspondiente y cambios anatómicos en la hueso.

Combinado<em&gt; En vivo</em&gt; Óptica y μCT imágenes para vigilar la infección, inflamación y Hueso anatomía en una infección de implantes ortopédicos en ratones

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

16.9K vistas.  David Geffen School of Medicine at University of California, Los Angeles (UCLA).  Combinado de imágenes ópticas y μCT en un modelo de ratón de infección implante ortopédico, la utilización de una cepa bioluminiscente ingeniería de Staphylococcus aureus, siempre que la capacidad de supervisar de forma no invasiva y longitudinalmente la dinámica de la infección bacteriana, así como la respuesta inflamatoria correspondiente y cambios anatómicos en la hueso. 

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Investigación

Medicina

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove nonadherent cells and lung lining fluid from the mucosal surface. In research environments, BAL allows sampling of innate (lung macrophage), cellular (B- and T- cells), and humoral (immunoglobulin) responses within the lung.
BAL is internationally accepted for research purposes and since 1999 the technique has been performed in &#62; 1,000 subjects in the UK and Malawi by our group.
Our technique uses gentle hand-held suction of instilled fluid; this is designed to maximize BAL volume returned and apply minimum shear force on ciliated epithelia in order to preserve the structure and function of cells within the BAL fluid and to preserve viability to facilitate the growth of cells in ex vivo culture. The research technique therefore uses a larger volume instillate (typically in the order of 200 ml) and employs manual suction to reduce cell damage.
Patients are given local anesthetic, offered conscious sedation (midazolam), and tolerate the procedure well with minimal side effects. Verbal and written subject information improves tolerance and written informed consent is mandatory. Safety of the subject is paramount. Subjects are carefully selected using clear inclusion and exclusion criteria.
This protocol includes a description of the potential risks, and the steps taken to mitigate them, a list of contraindications, pre- and post-procedure checks, as well as precise bronchoscopy and laboratory techniques.

Bronchoalveolar Lavage BAL for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy and bronchoalveolar lavage using low pressure suction. The technique is used to harvest immune cells from the lung bronchoalveolar surfaces. Local anesthetic and mild conscious sedation (midazolam) is used. Subjects tolerate the procedure well and experience minimal side effects.

Lavado broncoalveolar (BAL) de Investigación; obtención de rendimiento adecuado de la muestra

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Carriage Experimental neumocócica Humanos

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusiones de la arteria carótida para farmacocinéticas y farmacodinámicas Análisis de taxanos en ratones

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

Seguimiento In Vivo del Desarrollo del Edema y Patología Microvascular en un Modelo de Malaria Cerebral Experimental usando Imágenes de Resonancia Magnética

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection

Bone infection results from bacterial invasion, which is extremely difficult to treat in clinical, orthopedic, and traumatic surgery. The bone infection may result in sustained inflammation, osteomyelitis, and eventual bone non-union. Establishment of a feasible, reproducible animal model is important to bone infection research and antibiotic treatment. As an in vivo model, the rabbit model is widely used in bone infection research. However, previous studies on rabbit bone infection models showed that the infection status was inconsistent, as the amount of bacteria was variable. This study presents an improved surgical method for inducing bone infection on a rabbit, by blocking the bacteria in the bone marrow. Then, multi-level evaluations can be carried out to verify the modelling method.
In general, debriding necrotic tissue and implantation of vancomycin-loaded calcium sulphate (VCS) are predominant in antibiotic treatment. Although calcium sulphate in VCS benefits osteocyte crawling and new bone growth, massive bone defects occur after debriding. Autogenous bone (AB) is an appealing strategy to overcome bone defects for the treatment of massive bone defects after debriding necrotic bone.
In this study, we used the tail bone as an autogenous bone implanted in the bone defect. Bone repair was measured using micro-computed-tomography (micro-CT) and histological analysis after animal sacrifice. As a result, in the VCS group, bone non-union was consistently obtained. In contrast, the bone defect areas in the VCS-AB group were decreased significantly. The present modeling method described a reproducible, feasible, stable method to prepare a bone infection model. The VCS-AB treatment resulted in lower bone non-union rates after antibiotic treatment. The improved bone infection model and the combination treatment of VCS and autogenous bone could be helpful in studying the underlying mechanisms in bone infection and bone regeneration pertinent to traumatology orthopedic applications.

This study presents an improved rabbit model infected with Staphylococcus aureus by blocking the same amount of bacteria in bone marrow. Vancomycin loaded calcium sulphate and autogenous bone are used for antibiotic and bone repair treatment. The protocol could be helpful for studying bone infection and regeneration.

Tratamiento con vancomicina cargado sulfato de calcio y hueso autógeno en un modelo de conejo mayor de infección ósea

Bone infection results from bacterial invasion, which is extremely difficult to treat in clinical, orthopedic, and traumatic surgery. The bone infection ...

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. Therefore, adjuvants with both humoral and cellular immuno-stimulatory capabilities that are able to promote cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses are urgently needed. Thus, faithful monitoring of adjuvant candidates that induce cross-priming and subsequently enhance CTL generation represents a crucial step in vaccine development. In here we present an application for a method that uses SIINFEKL-specific (OT-I) T cells to monitor the cross-presentation of the model antigen ovalbumin (OVA) in vivo in the presence of different adjuvant candidates. This method represents a rapid test to select adjuvants with the best cross-priming capabilities. The proliferation of CD8+ T cells is the most valuable indication of cross-priming and it is also regarded as a correlate of adjuvant-induced cross-presentation. This feature can be evaluated in different immune organs like lymph nodes and spleen. The extent of the CTL generation can also be monitored, thereby giving insights on the nature of a local (draining lymph node mainly) or a systemic response (distant lymph nodes and/or spleen). This technique further allows multiple modifications for testing drugs that can inhibit specific cross-presentation pathways and also offers the possibility to be used in different strains of conventional and genetically modified mice. In summary, the application that we present here will be useful for vaccine laboratories in industry or academia that develop or modify chemical adjuvants for vaccine research and development.

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant&#039;s Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

We present here an application for a standard immunological technique (CFSE stained OT-I proliferation) intended to rapidly monitor adjuvant-mediated cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vivo. This fast estimation of CTL capacities is useful for the development of prophylactic vaccines against intracellular pathogens as well as therapeutic cancer vaccines.

Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies that promote efficient bone healing are non-existent and in high demand. Effective and reproducible animal models of fractures healing are needed to understand the complex biological processes associated with bone regeneration. Many animal models of fracture healing have been generated over the years; however, murine fracture models have recently emerged as powerful tools to study bone healing. A variety of open and closed models have been developed, but the closed femoral fracture model stands out as a simple method for generating rapid and reproducible results in a physiologically relevant manner. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice and facilitate a post-fracture stabilization of the femur by inserting an intramedullary steel rod. Although devices such as a nail or a screw offer greater axial and rotational stability, the use of an intramedullary rod provides a sufficient stabilization for consistent healing outcomes without producing new defects in the bone tissue or damaging nearby soft tissue. Radiographic imaging is used to monitor the progression of callus formation, bony union, and subsequent remodeling of the bony callus. Bone healing outcomes are typically associated with the strength of the healed bone and measured with torsional testing. Still, understanding the early cellular and molecular events associated with fracture repair is critical in the study of bone tissue regeneration. The closed femoral fracture model in mice with intramedullary fixation serves as an attractive platform to study bone fracture healing and evaluate therapeutic strategies to accelerate healing.

The murine closed femoral fracture model is a powerful platform to study fracture healing and novel therapeutic strategies to accelerate bone regeneration. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice using an intramedullary steel rod to stabilize the femur.

La generación de fracturas femorales cerradas en ratones: un modelo para el estudio del hueso curativo

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Análisis de alto rendimiento de datos de asignación óptica mediante electromap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Etiquetado de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y murinos en tejido incrustado por parafina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...