El servicio de imágenes en vivo en el Imperial College fue financiado por el MRC.

<ol>
	<li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice.">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547 (2011).</li><li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li><li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+specificity,+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).</li><li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+a+'hyperinfectious'+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract.">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacterial+surface-exopolysaccharide+facilitates+commensal-host+interaction+through+immune+modulation+and+pathogen+protection.">Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Collins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-treatment+with+Bifidobacterium+breve+UCC2003+modulates+Citrobacter+rodentium-induced+colonic+inflammation+and+organ+specificity+of+infection.">Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection.</a> Microbiology. , 10-1099 (2012).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li><li>Hardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder.">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303, 851-853 (2004).</li><li>Szittner, R., Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence,+expression,+and+properties+of+luciferase+coded+by+lux+genes+from+a+terrestrial+bacterium.">Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.</a> J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).</li><li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence.">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).</li><li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).</li><li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting.">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940 (2012).</li><li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man.">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).</li><li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL/6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation.">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).</li><li>Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+biophotonic+imaging+as+a+training+aid+for+administration+of+substances+in+laboratory+rodents.">Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents.</a> Lab Anim. 41, 321-328 (2007).</li><li>Crepin, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+the+Tir:Nck+and+Tir:IRTKS/IRSp53+signalling+pathways+in+vivo.">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li><li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol.">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li><li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-animal+X-ray+dose+from+micro-CT.">Small-animal X-ray dose from micro-CT.</a> Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).</li><li>Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+effects+of+whole+or+partial+body+x-irradiation+on+mice:+life+shortening.">Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening.</a> Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).</li><li>Kohn, H. I., Kallman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+strain+on+acute+x-ray+lethality+in+the+mouse.+II.+Recovery+rate+studies.">The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies.</a> Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).</li></ol>

La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por PerkinElmer. Los autores Kevin P, Francis, Jeff Meganck y Chaincy Kuo son empleados de pinza-A Company PerkinElmer. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los procedimientos científicos Animals Act 1986 y fueron aprobados por el Comité de Ética local.

La película 4D de infección bacteriana es una herramienta útil para visualizar e interpretar grandes cantidades de datos de imágenes multimodalidad rápida y fácilmente. Esta técnica facilita el análisis detallado de cómo una infección se propaga a través de un ratón individual y se puede utilizar para investigar cómo la eliminación de host o genes bacterianos o particular, las estrategias de intervención efecto de la carga bacteriana, la distribución, y la localización durante un estudio longitudinal 7. Estos videos también ofrecen materiales didácticos útiles y un medio de difusión de información al público. Hay varios pasos críticos en este protocolo que podrían afectar a la calidad de los datos obtenidos a partir de imágenes DLIT-μCT y la capacidad para compilar un video 4D de la infección. La parte más importante de este protocolo es el éxito de la infección y homogénea de los ratones con C. rodentium. Es esencial que los ratones utilizados para el estudio son entre 18-20 g y que la bacrial inóculos se preparan y aproximadamente 5 x 10 9 ufc, como se ha descrito previamente 2,3. Antes de la infección de los ratones es importante comprobar que el inóculo es bioluminiscente usando el espectro CT y una vez que el inóculo se ha preparado, que debe ser homogeneizada continuamente delante de cada ratón se gavaged para asegurar que los ratones reciben dosis infecciosas similares. La imagen DLIT-μCT de los ratones se ha optimizado para que la función de exposición automática en el software 4.3.1 Imagen Living determina automáticamente los parámetros de imagen óptimos para la señal de estar bien por encima del ruido. Sin embargo, la función de exposición automática se basa en la configuración y los parámetros definidos por el usuario que necesitan ser modificados como se describe en el procedimiento. De no hacerlo, dará lugar a imágenes de baja calidad con un bajo número de fotones recogidos que no den lugar a una progresión evidente en la infección, como los ajustes de fábrica del Spectrum CT de exposición automática se programan para los tumores que expresan imágenesla luciferasa de luciérnaga. Reconstrucciones realizaron con 560 a 620 nm dan la mejor concordancia entre los datos simulados y medidos y, por lo tanto, son los datos más fiables para incluir en la reconstrucción. Una limitación al uso de DLIT-μCT es que la radiación ionizante de la exploración μCT provoca daño de la radiación subletal que es acumulado en un estudio longitudinal 18. Exposición a la radiación subletal puede debilitar la respuesta inmune, provocar daños en el ADN, y la apoptosis en los órganos internos 19. En última instancia, daños por radiación subletal acumulada puede causar la muerte si la DL 50/30 para la radiación ionizante se excede, que está entre 5 y 7 Gy dependiendo de la cepa de ratón y la edad de los ratones utiliza 18,20,21. Aunque algunos de los daños molecular de las radiaciones ionizantes puede curar, ya que el principio general es el de estimar la dosis de forma conservadora, esto no suele ser contabilizada en la planificación del estudio. En cambio, el objetivo es mantenerse lo más below estos límites como sea posible al tiempo que el cumplimiento de los objetivos del estudio. Esto es particularmente importante en este estudio debido a la respuesta inmune normal a la infección, la frecuencia de formación de imágenes, y el hecho de que transgénico, inmuno-compuesto, o muy infectado animales pueden ser más susceptibles a la radiación ionizante. Al planificar el experimento para generar una película 4D de la infección, es importante tener en cuenta la longitud del experimento, el número de μCT escanea requerido durante este periodo y la DL 50/30 para la radiación ionizante para la cepa de ratón que está siendo utilizado. Otra limitación potencial de DLIT-μCT es la fuerza de la expresión del indicador dentro de la cepa bacteriana utilizada, ya que esto afectará límites de detección bacterianas y los tiempos de formación de imágenes. Es muy recomendable que los investigadores utilizan validados cepas bacterianas que son totalmente virulento, pero optimizado para máxima operón lux expresión, como se ha demostrado previamente para BLI2,3. Una advertencia para el diseño actual de la formación de imágenes 4D es que cada película se compone de exploraciones DLIT-μCT individuales que tienen diferente escala de fotones. Esto puede hacer que las imágenes difíciles de interpretar si los cambios en la localización de la BL focos, o su intensidad son sutiles, o si hay un foco BL intensa rodeada por múltiples focos débil. Por lo tanto, para visualizaciones longitudinales, es importante para mantener las barras de color consistente a través de los puntos de tiempo. El concepto de una película 4D de la infección se puede aplicar a cualquier patógeno bacteriano convenientemente etiquetado. El desarrollo futuro de esta técnica tendrá como objetivo utilizar la tomografía de imágenes de fluorescencia (FLIT), así como DLIT para facilitar la investigación de las respuestas del huésped a la infección usando una combinación de patógenos bacterianos y bioluminiscentes inyectables sondas fluorescentes cerca de infrarrojos para investigar las respuestas del huésped a la infección. Además de esto, en este protocolo sólodescriben el uso de bacterias bioluminiscentes para crear películas 4D de la infección. Sin embargo, en algunos casos, puede ser necesario el uso de bacterias marcadas fluorescentes, por ejemplo, etiquetado con IRFP, de modo que el reportero bioluminiscencia se puede utilizar para la investigación genética del huésped durante la infección. Es importante destacar que el uso de imágenes multimodalidad que combina DLIT / FLIT-μCT nos permitirá investigar de manera no invasiva varios parámetros durante una infección bacteriana, lo que contribuirá de manera significativa a la reducción, refinamiento y reemplazo del uso de animales en la investigación científica como se indica en la iniciativa del NC3R ( <a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ).

Modelos animales pequeños, en particular, aquellos ratones que utilizan, se utilizan habitualmente para investigar la patogénesis bacteriana o para poner a prueba las estrategias de intervención para las infecciones, tales como antibióticos, probióticos, prebióticos y vacunas 1-7. Los principales lecturas experimentales de infecciones animales pequeños son la carga de patógenos, la localización espacial y temporal de la infección, y los cambios en la respuesta inmune del organismo infectado. En imagen óptica in vivo es una herramienta valiosa para la investigación de enfermedades infecciosas y se pueden utilizar para supervisar múltiples lecturas experimentales mediante el uso de genes informadores (luciferasa, proteínas fluorescentes, beta-lactamasa, etc), colorantes fluorescentes, nanopartículas o sondas quimioluminiscentes dirigidos a una proteína, proceso biológico, o microorganismo 6. Imágenes de bioluminiscencia (BLI) es una modalidad de imagen óptico utilizado para controlar la colonización de los animales pequeños, tales como ratones y ratas, por bac patógenaria 3,6,8,9. Los ratones se infectan con bacterias recombinantes que expresan una luciferasa, tales como el operón lux CDABE de Photorhabdus luminescens. Estas bacterias pueden entonces ser detectados a través de su producción de luz usando un CCD basado en formación de imágenes in vivo del sistema 3,6,9. Es importante destacar que sólo los microorganismos metabólicamente activas son bioluminiscentes (BL), es decir, sólo las células bacterianas viables se detectan mediante esta metodología 10,11. Uso de 2D BLI, la ubicación de la fuente de BL se infiere de la superficie del animal en el que se emitió la señal 8. La localización anatómica exacta de los focos BL in vivo tiene que ser determinada mediante el análisis ex vivo de órganos 3,6,9 En contraste, tomografía compuesto 3D difusa la luz de imagen (DLIT) puede ser utilizado para compilar una reconstrucción 3D cuantitativa de la BL fuente 12. DLIT se lleva a cabo mediante la recopilación de BL imágenes tomadas con filtros ópticos de paso de banda estrecha definidos yposteriormente insertando en ellos una tomografía óptica difusa algoritmo de reconstrucción 3D 1,7,12,13. Actualmente, modalidad de imágenes múltiples es la única metodología disponible para obtener verdadera localización anatómica no invasiva de bioluminiscente focos in vivo sin la necesidad de un análisis ex vivo. Recientemente, se utilizó una combinación de DLIT co-registrado con μCT formación de imágenes para evaluar Citrobacter rodentium (C rodentium) dinámica de colonización después del tratamiento profiláctico con una bacteria probiótica 7. C. rodentium es un patógeno entérico murino específico utilizado para modelar la infección humana por enteropatógenos y enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. infección rodentium causas de la colitis, típicamente asociado con la pérdida leve de peso, diarrea, polarizado respuesta inmune Th1 y cambios patológicos distintos, incluyendo hiperplasia de las criptas del colon y adhesión y borrado lesión formatiel 14. Además de esto, C. patogénesis rodentium se ha estudiado a fondo el uso de BLI y su dinámica de colonización en ratones C57BL/6J están bien documentadas, por lo que esta bacteria un microorganismo modelo ideal para su uso con múltiples modalidades de imagen 3,4,7. Este protocolo es el primero en describir una metodología para la formación de imágenes DLIT-μCT integrado de una infección bacteriana utilizando una única plataforma de formación de imágenes multimodalidad, el IVIS Spectrum CT, y la generación de una película de 4D que muestra la verdadera dinámica de esta infección no invasiva.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescent C. rodentium</td>
			<td>Frankel lab</td>
			<td>ICC180</td>
			<td>Wiles et al., 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td>Boots</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (100% v/v)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Oxygen</td>
			<td>BOC Medical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td>25 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10283.0500</td>
			<td>37 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Sigma (Fluka)</td>
			<td>60615</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Falcon tubes</td>
			<td>BD (Falcon)</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universals</td>
			<td>Corning (Gosselin)</td>
			<td>E5633-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD (Plastipak)</td>
			<td>300013</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved</td>
			<td>Vet Tech</td>
			<td>DE005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbanks (Cryovial)</td>
			<td>Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td>PL.170/Y</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum CT</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>133577 Rev A/ Spectrum CT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6kVA UPS</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 anesthesia system</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118918</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anaesthesia filter charcoal</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118999/00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image v4.3.1 SP1</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d multimodality imaging of citrobacter rodentium infections in mice

Este protocolo describe los pasos necesarios para el seguimiento longitudinal de una infección bacteriana bioluminiscente mediante tomografía 3D compuesta de imágenes con luz difusa integrada μCT (DLIT-μCT) y el uso posterior de estos datos para generar una película del ciclo de infección de cuatro dimensiones (4D). Para desarrollar las películas de infección 4D y para validar la formación de imágenes DLIT-μCT para estudios de infección bacteriana usando un espectro CT IVIS, hemos utilizado la infección con C. bioluminiscente rodentium, que causa colitis espontánea en ratones. En este protocolo, se esboza la infección de ratones con bioluminiscente C. rodentium y la monitorización no invasiva de la colonización por el diario de imágenes DLIT-μCT y enumeración de bacterias de las heces durante 8 días. El uso de la IVIS Spectrum CT facilita la co-registro sin fisuras de las exploraciones ópticas y μCT utilizando una única plataforma de imágenes. La modalidad μCT dosis bajas permite la generación de imágenes de los ratonesen múltiples puntos de tiempo durante la infección, proporcionando localización anatómica detallada de focos de bacterias bioluminiscentes en 3D sin causar artefactos de la radiación acumulativa. Es importante destacar que el cine 4D de ratones infectados proporcionan una poderosa herramienta de análisis para monitorear la dinámica de colonización bacteriana in vivo.

La infección de ratones C57BL/6J con 5 x 10 9 ufc C. rodentium es un modelo de infección bacteriana bien descrita y resulta en una infección gastrointestinal auto-limitante que los picos entre 6-8 días después de la infección y dura entre 3 a 4 semanas 2,14. La infección se limita a la luz intestinal por el sistema inmune murino y, como consecuencia, las bacterias se desprenden continuamente en las heces. La colonización de ratones por C. rodentium se puede controlar de forma no invasiva por enumeración bacteriana directa de las heces, o de formación de imágenes de bioluminiscencia 2,3. Este manuscrito describe un protocolo optimizado para la realización de 3D ​​y 4D de imágenes multimodalidad de C. rodentium dentro de ratones para monitorizar la carga bacteriana y la localización durante la infección. Los resultados presentados en la Figura 1 demuestran los controles que se requieren para el éxito de formación de imágenes 4D. Antes de la infección de los ratones, es esencial para disuadirmina que el inóculo bacteriano utilizado es bioluminiscente (Figura 1A) y que, tras la alimentación forzada oral de un ratón con bioluminiscente C. rodentium, que la señal se puede observar en el estómago del animal y no en los pulmones (Figura 1B) 16. Además de controlar la colonización bacteriana utilizando imágenes de bioluminiscencia, es una buena práctica para cuantificar el número de bacterias en las heces; que se utiliza como una medida indirecta de la colonización bacteriana de la mucosa gastrointestinal Figura 2 demuestra la carga bacteriana típica en las heces tomada de 8 ratones C57BL6 / J. ratones que han sido infectadas con el ~ 5 x 10 9 ufc ICC180 y monitoreados durante 8 días PI aumenta Colonización del día 2 PI hasta el día 6-7, donde los picos de infección en ~ 5 x 10 10 ufc / g, que está en consonancia con los informes anteriores 2,3,17. Para enfatizar la importancia de la evaluaciónting de la propagación de la infección en un solo ratón, Figuras 1b y 3, así como Video 1 se han generado a partir del mismo ratón después de C. rodentium infección, como se describió anteriormente. Diario DLIT-μCT se utilizó para evaluar la distribución espacial de las bacterias bioluminiscentes dentro de este ratón, utilizando el esqueleto como referencia anatómica. Figura 3 demuestra la reconstrucción DLIT-μCT de un ratón C57BL/6J infectado con ICC180 en 3 puntos de tiempo clave PI En día 3 PI pequeña bioluminiscente focos se puede observar en el colon, que exhiben un aumento moderado de la intensidad de bioluminiscencia por 5 días PI con poco cambio en la distribución espacial. En el día 7 PI se observó un aumento significativo en bioluminiscencia y los focos propagación bioluminiscente a través de todo el colon. Video 1 es una recopilación de las reconstrucciones 3D DLIT-μCT de 1-8 días PI con ICC180 e ilustra C.rodentium dentro del tracto gastrointestinal proximal entre 1-2 días PI que se extiende a los dos puntos en el día 3 PI De 4-6 días PI los números de bacterias en el colon se expanden hasta alcanzar un máximo de 7 días PI donde los focos bacteriana cubre todo el colon. En el día 8 PI sólo dos focos distintas de bacterias están presentes en el colon proximal y distal. La posibilidad de ver la reconstrucción en 3D en cada momento en orden cronológico representa una poderosa herramienta para analizar las interacciones patógeno de acogida y es más fácil de interpretar que un 3D aún del mismo conjunto de datos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> Figura 1. Bioluminiscencia de imágenes 2D de A) bioluminiscente C. rodentium ICC180 inóculo y B) un ratón después de una sonda oral con 200 l del inóculo. Punta de flecha (&gt;) ilustra bioluminiscente C. rodentium </<html> em&gt; en el estómago. <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> Figura 2. C. dinámica de colonización. rodentium cuantificación de C. rodentium unidades formadoras de colonias de las heces durante 8 días PI <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> Figura 3. La luz difusa imagen de tomografía computarizada de μCT bioluminiscente C. infección rodentium de un ratón de un control en el día 3, 5 y 7 PI punta de flecha (&gt;) ilustra la colonización del colon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver el video. película 4D de la infección por C. rodentium de un ratón controlado de 1-8 días PI

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4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Imágenes multimodalidad es un enfoque valioso para el estudio de la colonización bacteriana en los modelos animales pequeños. Este protocolo describe la infección de ratones con bioluminiscente<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Y el seguimiento longitudinal de la colonización bacteriana mediante tomografía luz difusa 3D compuesto con μCT de imágenes para crear una película de 4D<em&gt; C. rodentium</em&gt; Infección.

4D de imágenes multimodalidad<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Las infecciones en ratones

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

4d-multimodality-imaging-of-citrobacter-rodentium-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

12.9K vistas.  Imperial College London. Imágenes multimodalidad es un enfoque valioso para el estudio de la colonización bacteriana en los modelos animales pequeños. Este protocolo describe la infección de ratones con bioluminiscente Citrobacter rodentium Y el seguimiento longitudinal de la colonización bacteriana mediante tomografía luz difusa 3D compuesto con μCT de imágenes para crear una película de 4D C. rodentium Infección.

Video: 4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Luciferasa utilizando a las infecciones bacterianas de la imagen en ratones

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Investigación

Inmunología e Infección

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

La<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Modelo: Estudiar Contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

En Vivo Investigación de Terapia de luz azul antimicrobianos para multirresistente Acinetobacter baumannii infecciones de quemaduras El uso de bioluminiscencia Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Proyección de imagen de tuberculosis del Mycobacterium en ratones con reportero enzima fluorescencia

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Imágenes de Ca2 + respuestas durante la infección de Shigella de células epiteliales

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Proyección de imagen confocal de ARN bicatenario y receptores de reconocimiento de patrón en la infección por Virus de ARN de sentido negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un alto rendimiento Shigella-ensayo bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...