This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.

Todos los ratones fueron alojados y manipulen de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, y se inscribió en un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales NHLBI. Mujer B6.SJL-PTPRC (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) y ratones C57BL / 6, 6-12 semanas de edad, fueron utilizados como donante y receptor, respectivamente. Una lista de materiales, reactivos y equipo se proporciona en la Tabla 1. 1. LEGO Transducción de Ratón HSPCs y Trasplante de Médula Ósea Lleve a cabo los procedimientos descritos a continuación en un nivel de bioseguridad certificada 2 (BSL-2) gabinete (campana de cultivo de tejidos). <ol><li> Producción de LEGO vectores que codifican 5 fps <ol><li> Utilice la lentiviral &quot;Gene Ontología&quot; (LEGO) plásmidos vectores, cada uno codifica una FP diferente de un fuerte promotor SFFV constitutiva, incluyendo Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venus), Lego-T2 (tdTomato), y Lego-C2 (mCherry) amablemente proporcionados por el Dr. Boris Fehse (Centro Médico Universitario Hamburg-Eppendorf, Hamburgo, Alemania); ahora también disponible en Addgene 5-7. </li><li> Para producir vectores de LEGO, semilla de 5 x 10 6 células 293T en placas de 10 cm (12 utilizar platos para cada vector) 24 h antes de la transfección en 8 ml de medio de I10 (IMDM suplementado con 10% de FCS y glutamina / penicilina / estreptomicina). </li><li> Transfectar las células con fosfato de calcio utilizando las recomendaciones del kit CAPHOS ligeramente modificados: <ol><li> Para cada mezcla de la placa 15 mg vector de Lego, 12 mg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 mg PREV-TAT y 1 mg plásmidos pMD2.G-VSV-G en presencia de 50 l de 2,5 M CaCl 2, y añadir agua para proporcionar un volumen total de 500 l. </li><li> Plásmidos de ADN precipitado con 500 l de 2x HeBS (solución salina tamponada con HEPES) y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente antes de añadir a cada placa de células 293T. </li><li> Se incuban las células para6 horas en un 37 ° C 5% de CO2; eliminar el medio y añadir nueva cultura mediática 6 h después de la transfección. </li></ol></li><li> Recoger los sobrenadantes del cultivo que contiene partículas lentivirales de cada placa, a diario, durante 3 días. Cada colección sobrenadante día siguiente añadir medios I10 fresca a cada placa. <ol><li> Se filtra a través de 0,22 micras poros, piscina y concentrarse sobrenadantes por ultracentrifugación en un rotor SW28 durante 2 horas a 71.900 xg y 4 ° C. </li><li> Resuspender los sobrenadantes en 1 ml de medio StemSpan. Alícuota de los stocks de lentivirus en 200 l y se almacenan a -80 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> La titulación de Lentiviral Particles Determinar el título de partículas de vector de Lego en sobrenadantes recogidos a través de la cuantificación de la transducción de unidades / ml utilizando células NIH3T3. Los títulos permiten el cálculo del volumen de cada sobrenadante del vector necesaria para dar lugar a la multiplicidad relativa deseada de infección (MOI) de objetivo experimentalcélulas. <ol><li> Plate 5 x 10 4 NIH3T3 células por pocillo (placa de 12 pocillos) en 2 ml de medio I10 un día antes de la valoración. </li><li> Preparar diluciones en serie de 5 veces de sobrenadantes de vectores en medios I10 suplementado con sulfato de protamina (4 mg / ml 1,000x es). </li><li> Retire el papel de las células, y reemplazar con 500 l de diluciones de sobrenadante que contiene el equivalente a 2, 0.8, 0.32, y 0.128 l de virus concentrado. </li><li> Determinar el número (n) de células presentes por pocillo en el momento de la transducción, contando así un control. </li><li> 6 horas después de la transducción, añadir 2 ml de medio I10 e incubar durante 3 días a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Recoger las células de cada pocillo usando Tripsina-EDTA, y determinar el porcentaje de células fluorescentes (% FP) a través de citometría de flujo. </li><li> Calcular el título de la siguiente manera, el promedio de los títulos obtenidos para cada pocillo (dilución) resultantes en un FP% entre 1 y 50%: de títulos (partículas de vector / ml) = nx% FP / volumen de sobrenadante de vector (ml). La media de los títulos obtenidos para cada dilución si el FP% está entre 1 y 50%. </li></ol></li><li> Ratón Colección celular, purificación, Transducción y Trasplante (que se muestra esquemáticamente en la Figura 1A adaptado de Malide et al. 4). <ol><li> Sacrificar los ratones donantes mediante un procedimiento adecuado. Cosecha de médula ósea de las extremidades anteriores y posteriores: diseccionar húmeros, fémures y tibias, eliminar completamente todo músculo, ligamentos y el exceso de tejido de los huesos, corte a través del extremo de cada hueso lo más cerca posible a la articulación, y lavar la médula ósea de el hueso usando una aguja de 27-0 en una jeringa que contiene medios I10. </li><li> Pellet enteras las células de la médula ósea durante 10 min a 500 xg, 4 ° C y lisar glóbulos rojos dos veces con 50 ml de tampón ACK. Resuspender las células en 10 ml de medio I10. </li><li> Purificar células progenitoras (Lin-) linaje negativas con el kit de agotamiento MACS linaje de acuerdo con un protoco kit modificadol: <ol><li> Utilice 30 l de microperlas anti-biotina en lugar de 10 l / 10 7 células; completar las etapas de lavado con los medios de comunicación I2 (IMDM suplementado con FCS al 2%) en lugar de tampón. </li><li> Inserte una etapa de lavado entre la incubación con Cocktail biotina-anticuerpo y la incubación con anti-biotina microperlas; y equilibrar la columna con tampón en lugar de I10. </li></ol></li><li> Cultura células Lin-durante 48 horas a una densidad inicial de 5 x 10 5 células / ml en medio StemSpan suplementado con 10 ng / IL-3 murina ml, 100 ng / ml de IL-11 murina, 100 ng / ml Flt-3 humana ligando, y 50 ng / factor de células madre murina ml. </li><li> Transferencia de 1 a 4 x 10 5 células a 12-así placas revestidas con RetroNectin y transducir con sobrenadantes de Lego, cada uno a una multiplicidad de infección (MOI) de 6-7 para lograr la eficiencia de expresión del 50% para cada FP, en presencia de StemSpan medios de comunicación y citoquinas detallan arriba y 4 mg / ml de sulfato de protamina. </li><li> Transducir célulascon cada vector de Lego de forma individual como se describe en el paso 1.3.5 y mezclar las células después de la transducción (llamado Mix) o co-transducir células con todos los sobrenadantes 5 LEGO vector simultáneamente (denominado Co). Retire las células 24 horas más tarde, lavar una vez con medio StemSpan sin citoquinas, y volver a suspender en medios StemSpan sin citoquinas para el trasplante, o transferirlos a medio fresco con citoquinas, y la cultura durante 96 horas adicionales antes de la microscopía confocal y citometría de flujo. <ol><li> Lleve a cabo el trasplante de médula ósea mediante la infusión de transducidas Lin- HSPCs mediante inyección en la vena de la cola en los destinatarios previamente irradiados 11 Gy dosis única (6-18 hr antes del trasplante) los destinatarios, en un volumen de 100 l, a una dosis de células por ratón correspondiente a 1 células -4 x 10 5 Lin- originalmente plateado para la transducción. En cada experimento, trasplantar toda una cohorte de animales con la misma población de células transducidas BM donantes. </li><li> Para la caracterización in vitro de H transducidasSPC, cultivar las células durante otros 4-5 días en StemSpan suplementado con las citoquinas y analizar por citometría de flujo para la eficacia de transducción, y por microscopía a la diversidad de colores. <ol><li> Sacrificar los ratones individuales y recuperar los tejidos y órganos para formación de imágenes, en varios puntos de tiempo de hasta 120 días post-trasplante. <ol><li> Rociar con etanol la piel del ratón y incisión de la piel en el lado ventral evitar la difusión del cabello. </li><li> Diseccionar y los impuestos especiales de acuerdo con los procedimientos estándar del bazo, los ganglios linfáticos poplíteos, pulmones, el corazón, la piel, el tejido adiposo, el músculo esquelético, el riñón, el hígado, así como la cabeza para el acceso a la bóveda craneal. </li><li> Como alternativa, utilice bóveda craneal o la creación de una ventana ósea para imágenes en vivo en varias ocasiones con el tiempo 2,8,9 u órganos superficiales de la imagen tales como los nodos de la piel y de los ganglios en el animal vivo. </li></ol></li><li> Coloca los órganos individuales en 35 mm cultura platos número 0 cubierta de cristal en 50-10056; l PBS para obtener imágenes de ellos intactos sin seccionar, fijación o procesamiento adicional como se describe en el paso 2.5. </li><li> Para imagen volumétrica, mantener los órganos en PBS en frío hasta su uso. Para time-lapse de proceder de inmediato a la formación de imágenes órganos en DMEM, 10% FBS que contenía HEPES 20 a 37 ° C </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2. confocal y microscopía de dos fotones y Análisis de Imágenes <ol><li> Realizar imágenes de microscopía utilizando un sistema de cinco canales y confocal Leica SP5 multifotón equipado con varias líneas de argón, diodo de 561 nm, 594 nm HeNe, y HeNe 633 nm láseres visibles. El uso en modo 2-fotón, un femtosegundo pulsada Ti: Zafiro (Ti-Sa) láser, sintonizable para la excitación de 680 a 1080 nm con corrección de dispersión. Uso en experimentos que implican los MF desplazada al rojo (tdTomato y mCherry), un oscilador paramétrico óptico (OPO) de láser para ampliar el rango de longitud de onda de salida en cuanto a 1,030-1,300 nm, secuencialmente o simultáneamente con tque Ti-Sa láser. </li><li> Image diversos tejidos usando un HCX-IRAPO-L 25X / 0,95 NA objetivo de inmersión de agua (WD = 2,5 mm), una PLAPO-CS-HC 20x / 0,70 NA objetivo seco (WD = 0,6 mm), o HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA objetivo de inmersión en agua (WD = 0,6 mm). </li><li> Obtener espectros de fluorescencia confocal de recogida pilas lambda (xyλ) de luz emitida en 5 nm-anchos de banda del espectro visible a partir de células BM transducidas con un vector único FP LEGO, así como de control, no trasplantados BM. <ol><li> Procesar imágenes con el software v2.4.1 Leica LAS-AF para crear espectros de referencia de los 5 programas marco, así como de autofluorescencia (Figura 2A). El uso de los espectros individuales FP y la diferencia de brillo de fluorescencia (expresado en% de EGFP) de Cerulean (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) y mCherry (47%) establece 5 canales de imágenes secuenciales de la siguiente manera: Cerulean (458/468 a 482 nm), EGFP (488/496 a 514 nm), Venus (514/523 a 558 nm), tdTomato (561/579 a 597 nm), y mCherry (594/618 a 670 nm) ( <strong&gt; Figura 2B). </li><li> Validar la separación los MF precisa, como las células transducidas con cada FP individuo sólo son visibles en el canal correspondiente y ausente del resto (Figura 2C). Además, este enfoque multi-canal definido crea un único 5-canales &quot;Colorprint&quot; que permite el análisis posterior de color y de seguimiento clonal y tiene la ventaja de reducir los tiempos de adquisición en comparación con la imagen espectral. </li></ol></li><li> Separada de emisión de fluorescencia, en el modo de 2 fotones, por alta eficiencia espejos dicroicos de encargo y recoger con un detector de cuatro canales no descanned (NDD) como sigue: un espejo dicroico a 568 nm seguido de un espejo dicroico a 465 nm, seguido por un 452/45 nm filtro de emisión de SHG o autofluorescencia y Cerulean, un filtro de 525/40 nm de emisión para EGFP o Venus, y un espejo dicroico 648 nm y 620/60 nm filtro de emisión para tdTomato o mCherry. <ol><li> Revelar información estructural mediante microscopía de dos fotones iimágenes de contraste ntrinsic (como se describió anteriormente) de la autofluorescencia del tejido de la elastina, NADH, (emocionado a 780 nm), y segundo armónico de la señal (SHG) de colágeno óseo y fibrilar (emocionado en 920 nm o 860 nm recogido en un dispersada-generados dirección) 10,11. </li></ol></li><li> Para la interpretación del volumen 3D, recoger serie de imágenes xyz (típicamente 1 x 1 x 4 m 3 tamaño voxel) a lo largo del eje z en 5 micras intervalos en un rango de profundidades (150-300 m) a lo largo de la médula ósea y otros tejidos, en grandes regiones utilizando la función de baldosas del software para generar automáticamente los volúmenes cosidos que comprenden una fosas toda esternón, aproximadamente 2,5 x 1,2 mm 2 (xy) y 300 m (z) (Figuras 2D-2E) y de la película 1. <ol><li> Imagen de calota ósea directamente a través del cráneo sin seccionar 2, 8. </li><li> Sección esternón a lo largo del plano sagital (bisección) y luegotransversalmente en la unión entre 2 esternal foso y la imagen a través de la cara de corte 3,4,12 (descripción general en la Figura 1B adaptado de Takaku et al 3). </li></ol></li><li> Para time-lapse de 4D, coloque recién extirpado poplítea ganglios linfáticos, el bazo, pulmón, o muestras de hueso de calota sin cortar en 35 mm cultura platos número 0 cubreobjetos, en 50-100 l DMEM, FBS al 10% que contenía HEPES 20 a 37 ° C y el uso de 2 fotones Ti-Sa excitación (860 nm), combinada con la excitación confocal (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) y un escáner de resonancia Leica (8000 Hz / seg), tomando z-pilas (~ 80 micras) a intervalos de 20 segundos hasta 1 hr. <ol><li> Para tricolor uso de imágenes 2P simultánea Ti-Sa sintonizado a 860 nm simultáneamente con el láser OPO (sintonizado en 1130 nm para tdTomato, o 1140 nm mCherry) (Movie 2). </li></ol></li><li> Reconstrucción y Análisis de volúmenes en 3D y secuencias de tiempo 4D <ol><li> Utilice Imaris x64 softwson la versión 7.6, o paquetes de programas alternativos para transformar las-pilas de baldosas de imágenes en bruto en volumen-renderizados (3D) de datos de células fluorescentes dentro de la médula ósea y los diferentes tejidos y para exportarlas como películas 3D de rotación, como se describió previamente 3,4 (Película 1) paso a paso ejemplo: <ol><li> En Imaris, Abra la imagen z-stack; Seleccione &quot;Supera&quot; con el fin de mostrar la visualización de volumen 3D. </li><li> Utilice &quot;navegar&quot; para subir el volumen alrededor de 360 ​​°. </li><li> Seleccione &quot;Animación&quot; para crear una animación; utilizar fotogramas clave para agregar vistas seleccionadas, zoom, rotaciones del volumen; Vista previa de la película, editar según sea necesario y guarde el archivo en un formato de vídeo que desee (por ejemplo: avi, mov). </li></ol></li><li> Para la evaluación cuantitativa de la frecuencia celular y clon 3D, posiciones, tamaños y distribución, más proceso de los z-pilas que utilizan los módulos Imaris XT que integran aplicaciones de MATLAB escénicas meas distanciamedi- (utilizando un algoritmo de transformación distancia) y grupos de análisis, como se ha descrito previamente 3,4. Transformar las secuencias de pilas de imágenes a través del tiempo en cuatro dimensiones (4D) películas de volumen-renderizados con software x64 Imaris y utilice punto y análisis de superficie para el seguimiento semiautomatizado de la motilidad celular en tres dimensiones usando algoritmos de movimiento autorregresivos. </li><li> Realizar análisis multiespectral de las células de la siguiente manera: extraer el color de múltiples puntos marcados por la adición de los 5 canales a través de la aritmética canal de Imaris XT en un nuevo canal; determinar, para todos los puntos (células) de la intensidad media de fluorescencia en cada uno de los canales de componentes 5. Exportar los valores en el software Excel para trazar gráficos que muestran el &quot;Colorprint&quot; única es decir, el% relativo de cada FP en celda individual (Figura 2E gráfico). Corrija el conjunto de datos de la deriva del tejido, y calcular la velocidad de células y el desplazamiento en el tiempo, longitudes de pista, caminos y distancias; los valores de exportación en Excel software para trazar gráficos. Ensamble figuras compuestas con el software Adobe Photoshop CSS 5. </li></ol></li></ol>

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	<li>Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li><li>Takaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis+in+3+dimensions+human+and+murine+bone+marrow+architecture+visualized+by+confocal+microscopy.">Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy.</a> Blood. 116, e41-e55 (2010).</li><li>Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues.">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys J. 82, 493-508 (2002).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119, 238-250 (2012).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Se describen aquí los detalles de una metodología poderosa recientemente ideado para el seguimiento celular clonal, la combinación de la gran diversidad generada por el marcado con vectores que codifican LEGO 5PM-y de formación de imágenes confocal con tándem y microscopía de 2 fotones para lograr volumétrica y la imagen dinámica en los tejidos vivos combinatoria. Esto se extendió el uso del color basados ​​en FP marcado por la grabación de la identidad espectral confocal en 5 &quot;distintos&quot; canale...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

La producción de células sanguíneas, denominado hematopoyesis, es mantenida por una pequeña población de células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs). Estas células residen dentro de la médula ósea (BM) en un complejo que consiste nicho microambientales de los osteoblastos, células del estroma, tejido adiposo, y las estructuras vasculares, todos implicados en el control de la auto-renovación y diferenciación 1,2. Como BM intacto ha sido tradicionalmente inaccesibles a la observación directa, las interacciones entre HSPC y su microambiente sigue siendo en gran medida sin caracterizar in vivo. Anteriormente, hemos establecido una metodología para visualizar la arquitectura 3D de BM intacta utilizando fluorescencia confocal y microscopía de reflexión 3. Nos caracteriza expansión de HSPCs EGFP marcados en la BM, pero el uso de sólo una única FP impidió el análisis de la regeneración en un nivel clonal. Muy recientemente nos aprovechamos de la Ontología de Lentiviral Génica (LEGO) vectores que expresan constitutivamente flproteínas fluorescentes (FPS) para marcar eficazmente células 4,5. Co-transducción de HSPC con 3 o 5 vectores genera una paleta diversa de colores combinatorias, lo que permite el seguimiento de los múltiples clones individuales HSPC. Marcado HSPC combina con la nueva tecnología de imagen permitido trazar homing individuo HSPC y el injerto en el BM de ratones irradiados. LEGO vectores se utilizaron para marcar HSPC con 3 o 5 MF diferentes (desde Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato, y mCherry) y seguir su injerto en el tiempo en el BM por microscopía confocal y 2-fotón, lo que permite una visualización clara de los huesos y otra estructuras de matriz, y la relación de clones HSPC a los componentes de su microambiente. HSPC se purificaron como las células negativas de linaje de ratones C57BL / 6 ratones BM, transducidas con vectores LEGO, y vuelve a infundir por inyección en la vena de la cola en ratones congenic mielo-ablación. Mediante el control de grandes volúmenes de tejido BM esternón visualizamos injerto endosteal ocurren temprano enRegeneración BM. Grupos de células con diversos espectros de color aparecieron inicialmente en estrecha proximidad con el hueso y progresaron de forma centralizada a través del tiempo. Curiosamente, después de más de 3 semanas, la médula ósea consiste en agrupaciones clónicas macroscópicas, que indica diseminación de la hematopoyesis derivada de HSPCs individuales de forma contigua en la médula, en lugar de amplia difusión de HSPCs través del torrente sanguíneo. Hubo menos diversidad de color en los puntos finales de tiempo, lo que sugiere la dificultad en la transducción a largo plazo repoblar células con múltiples vectores. Además, HSPCs formado grupos en el bazo, un órgano también responsable de la hematopoyesis en ratones. Células individuales HPSC derivados podrían resolverse en el timo, los ganglios linfáticos, el bazo, el hígado, los pulmones, el corazón, la piel, el músculo esquelético, tejido adiposo y los riñones también. Las imágenes en 3D pueden ser evaluados cualitativamente y cuantitativamente a apreciar la distribución de células con perturbaciones mínimas de los tejidos. Finalmente, ilustramosd la viabilidad de los estudios dinámicos vivos en 4D combinando multifotón escaneo de resonancia y time-lapse confocal. Esta metodología permite una alta resolución no invasiva, multidimensional celda de destino trazado de las poblaciones de células espectralmente marcados en su arquitectura intacta 3D, proporcionando una poderosa herramienta en el estudio de la regeneración de tejidos y la patología.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Production of viruses</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-Cer2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27338</td>
			<td>Expression of Cerulean</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-G2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">25917</td>
			<td>Expression of eGFP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-V2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27340</td>
			<td>Expression of Venus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-T2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27342</td>
			<td>Expression of tdTomato</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-C2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27339</td>
			<td>Expression of mCherry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Calciumm Phosphate Transfection Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAPHOS-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Tissue culture dish</td>
			<td style="width:493px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:216px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">IMDM</td>
			<td style="width:493px;">Gibco, Life Technology</td>
			<td style="width:216px;">12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td style="width:493px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Pen Strep Glutamine</td>
			<td style="width:493px;">Gibco, Life Technology</td>
			<td style="width:216px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:493px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">SW28 Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:493px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">L60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um)</td>
			<td style="width:493px;">Millipore</td>
			<td style="width:216px;">SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:493px;">Quality Biologicals Inc.</td>
			<td style="width:216px;">118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Lineage Cell Depletion Kit (mouse)</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LS columns + tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-041-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Pre-Separation Filters (30um)</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:493px;">StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc&#160;</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">murine IL-11 CF</td>
			<td>R &#38; D Systems Inc</td>
			<td>418-ML-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">recombinant murine SCF</td>
			<td style="width:493px;">RDI Division of Fitzgerald Industries Intl&#160;</td>
			<td>RDI-2503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">recombinant murine IL-3</td>
			<td>R &#38; D Systems Inc</td>
			<td>403-ML-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">FLT-3 Ligand</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-096-480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">12-well plates, Costar</td>
			<td style="width:493px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:216px;">3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Retronectin</td>
			<td style="width:493px;">Takara Bio Inc</td>
			<td style="width:216px;">T100A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Protamine Sulfate</td>
			<td style="width:493px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">P-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Confocal and two-photon microscopy</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">DMEM</td>
			<td style="width:493px;">Lonza</td>
			<td style="width:216px;">12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">1M Hepes</td>
			<td style="width:493px;">Cellgro, Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:216px;">25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Glass bottom culture dish P35G-0-20-C</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Glass bottom culture dish P35G-0-14-C</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm</td>
			<td style="width:493px;">Coherent</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm</td>
			<td style="width:493px;">Coherent</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Imaris software version 7.6</td>
			<td style="width:493px;">Bitplane</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells marked by five fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy

Hemos desarrollado y validado un marcador fluorescente metodología para el seguimiento clonal de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs) con alta resolución espacial y temporal para estudiar en la hematopoyesis in vivo usando el trasplante de médula ósea modelo experimental murino. Combinatoria genética marcado utilizando vectores lentivirales que codifican proteínas fluorescentes (FPS) permitió la cartografía destino celular a través de imágenes de microscopía avanzada. Vectores que codifican cinco programas marco diferentes: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato y mCherry se utilizaron para transducir simultáneamente HSPCs, creando una paleta diversa de células de color marcado. Imaging utilizando microscopía confocal híbrido / dos fotones permite la evaluación de alta resolución simultánea de las células marcadas de forma única y su progenie en conjunción con componentes estructurales de los tejidos. Volumétrica analiza en grandes áreas revelan que las células derivadas de HSPC espectralmente codificados se pueden detectar de forma no invasiva en diversos tejidos intactos, incluyendo la médula ósea (BM), Durante largos períodos de tiempo después del trasplante. Los estudios en vivo que combinan multifotón-velocidad de vídeo y time-lapse confocal en 4D demuestran la posibilidad de rastreo celular y clonal dinámico de una manera cuantitativa.

Todo el montaje 3D confocal / 2 fotones microscopía reconstrucciones del curso esternal tiempo médula ósea reveló el injerto y la expansión de los compañeros de 5fps trasplantadas en un modelo con características notables: clones aparecieron claramente delimitada, homogénea marcados con amplia paleta de colores inicialmente y el progreso con el tiempo para contener preferentemente a las células de la mayoría de un solo color. La microscopía confocal de configuración y ejemplos representativos de formación d...

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In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

in-vivo-clonal-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells-marked

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

13.1K vistas.  NHLBI/NIH.  Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos ...

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Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Aislamiento y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC)

Investigación

Biología

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Seguimiento de Dinámica de injerto muscular en pequeños animales por En Vivo Fluorescente de imágenes

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Mejorar la precisión de la evaluación citométrica de flujo del potencial de la membrana mitocondrial en células hematopoyéticas de tallo y progenitor a través de la inhibición de las bombas de eflujo

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Medición de la masa mitocondrial y el potencial de la membrana en células madre hematopoyéticas y células T por citometría de flujo

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene manipulation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in vitro makes HSPCs an ideal target cell for gene therapy. However, HSPCs moderately lose their engraftment and multilineage repopulation potential in ex vivo culture. In the present study, ideal culture conditions are described that improves HSPC engraftment and generate an increased number of gene-modified cells in vivo. The current report displays optimized in vitro culture conditions, including the type of culture media, unique small molecule cocktail supplementation, cytokine concentration, cell culture plates, and culture density. In addition to that, an optimized HSPC gene-editing procedure, along with the validation of the gene-editing events, are provided. For in vivo validation, the gene-edited HSPCs infusion and post-engraftment analysis in mouse recipients are displayed. The results demonstrated that the culture system increased the frequency of functional HSCs in vitro, resulting in robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

The present protocol describes an optimized hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) culture procedure for the robust engraftment of gene-edited cells in vivo.