Imaging se realizó en un microscopio confocal Leica SP5 vertical ubicada dentro de las instalaciones FILM, del Imperial College de Londres, dirigido por el Dr. Martin Spitaler. El soporte de la muestra y el casco se hizo en colaboración con el departamento de Ingeniería Química del Imperial College de Londres, con el asesoramiento de Samuel Jones y el Dr. Simon Schultz. Nicola Ruivo, Francisco Díaz y personal de CBS en el Imperial College fueron fundamentales para su asistencia y asesoramiento sobre la cría de ratón. Mark Scott es financiado por HFSP y FILM, Olufolake Akinduro por CRUK y Cristina Lo Celso por CRUK, KKLF, BBSRC y HFSP.

Todos los procedimientos que implican el uso de animales se realizan de acuerdo con la legislación local. Nuestro trabajo es aprobado por el Ministerio del Interior del Reino Unido, así como el grupo de revisión ética Imperial College. Los procedimientos permitidos se describen en la documentación de licencia de proyecto y siguen las pautas que aseguren el bienestar de los animales en todo momento. Asegúrese de cumplir con la legislación sobre la experimentación con animales en el país donde se realiza el trabajo. 1. Etiquetado e Inyección de HSPCs: <ol><li> Cosecha células descritas por Lo Celso 14-15. </li><li> Preparar las células a una concentración de 10 6 células / ml en PBS. NOTA: Utilice un hemocitómetro o la información proporcionada por el clasificador de células para contar las células; el número de células para ser etiquetados y se inyecta varía dependiendo del tipo de célula (por ejemplo, tinción de 10.000 - 20.000 HSCs, 100000 - 300000 HPC); si se trabaja con menos de 10 5 células, resuspender en 100 l de PBS; es importante tener las células en PBS sin suero, como suero inhibe la tinción. </li><li> Agregar DiD a la suspensión celular a una concentración final de 5 M y agitar la suspensión de inmediato para garantizar que el tinte no precipite fuera de la solución y dejar de marcar las células. </li><li> Incubar durante 10 min a 37 ° C luego se lava por centrifugación a 500 xg durante 5 min, decantar el líquido y resuspender el sedimento en un volumen apropiado para inyección IV (~ 100 - 150 l) </li><li> Resuspender las células en 200 l de PBS y recoger en una jeringa de insulina. NOTA: una jeringa de insulina se recomienda más de una jeringuilla convencional porque no tiene aguja del espacio muerto y por lo tanto permite administrar toda la suspensión celular para el ratón. </li><li> Inyectar células en un ratón irradiado letalmente a través de inyección en la vena de la cola. NOTA: La irradiación ha conocido, un impacto considerable en el microambiente de la médula ósea (tanto hematopoyéticas y del estroma componentes), que se desarrolla sobre timí. Por tanto, es muy importante mantener el tiempo constante para la irradiación, la inyección de células (4 a 24 horas de la irradiación para el mejor injerto) y de imagen. Aquí la irradiación se lleva a cabo de 6 horas antes de la inyección y formación de imágenes se realizó 20 h después de la inyección. <ol><li> Coloque el ratón en una cámara caliente (37 ° C) hasta que la vena de la cola aparece vasodilatación. </li><li> Mueva el ratón en el retenedor y deslice cuidadosamente la aguja en la vena de la cola. </li><li> Inyectar las células en la vena - sin resistencia a la inyección debe ser encontrado. </li><li> Deje el ratón O / N a fin de permitir que las células migren a los espacios de la médula ósea. </li></ol></li></ol> 2. Preparación del ratón for Imaging <ol><li> Autoclave de un par de pinzas finas y un par de tijeras finas, así como un casco antes de usar y almacenar en un ambiente estéril. </li><li> Invente anestésico lo más fresco posible, (0,38 ml de ketamina + 0,25 ml medetomidina + 4,47 ml de agua). NOTA: otsus anestésicos aprobados, incluido el isoflurano y el otro inyectable, serán eficaces también. El cóctel se describe es para ser administrado por vía intraperitoneal en 0,1 ml por 10 g de peso corporal, con recargas de 30 - 50 l administrados cada 45 min a 1 h. </li><li> Encienda el láser de dos fotones, si es necesario a continuación, iniciar el microscopio y software, la calibración de la etapa en que se le solicite. Encender el láser y permitir que se caliente y se estabilice mientras se prepara el ratón para la imagen. </li><li> Anestesiar al ratón usando la mezcla anestésica preparada (paso 2.2) para que el anestésico elegido a través de inyección intraperitoneal. Vigilar la aparición de la anestesia profunda a través del reflejo pedal ahora ya intervalos regulares durante todo el protocolo. NOTA: el ratón debe ser monitoreado cuidadosamente durante el procedimiento y si la anestesia parece ser un rayo (por lo general después de 45 - 60 min) y luego administrar una dosis de recarga (como se detalla en el apartado 2.2). Se espera algo de variación entre los ratones de diferentes edades y sexo. Es importante para discutir el protocolo de anestesia con su funcionario veterinario local para asegurar las debidas precauciones se toman para asegurar el bienestar del ratón. </li><li> Hisopo la parte superior del cuero cabelludo con etanol al 70% en un tejido, asegurando de no obtener ninguna etanol en los ojos del ratón. </li><li> Usando fórceps y tijeras estériles, retirar cuidadosamente la porción central del cuero cabelludo para exponer el área bóveda craneal en ser fotografiado: hacer una pequeña incisión en la parte posterior de la cabeza entre las orejas mediante el levantamiento de la piel con los fórceps. Mientras mantiene la piel hacia arriba, deslice la tijera debajo de la piel y cortar con cuidado a lo largo de la parte exterior del área de imagen deseada. </li><li> Limpie el hueso expuesto con un bastoncillo de algodón estéril humedecido con PBS estéril para mantenerlo húmedo. </li><li> Coloque la pieza de cabeza de metal en el cráneo del ratón listo para la imagen. <ol><li> Mezclar una cantidad adecuada de cemento dental en un barco pesan hasta que se convierte en una pasta y aplicar rápidamente a la superficie inferior de la pieza de cabeza que se adhiera a la skull. </li><li> Antes de que los conjuntos de cemento, coloque el casco en el cráneo del ratón, asegurándose de no conseguir cualquier cemento dental en el área de la imagen, a continuación, esperar a que se va a establecer. </li><li> Aplique una pequeña cantidad de Intrasite hidrogel que mantiene el cráneo húmedo. </li></ol></li><li> Coloque la pieza de cabeza para el titular y seguro en su lugar con el tornillo, asegurándose de que las ranuras encajan en las muescas titular. </li><li> Retire el hidrogel del cráneo con bastoncillos de algodón estériles y limpias con PBS estéril antes de ser transferido al microscopio. </li><li> Inserte el soporte en la platina del microscopio, coloque la rejilla de calefacción bajo el ratón, insertar la sonda del termómetro rectal y asegurar todo en su lugar en el escenario con cinta adhesiva. </li><li> Coloque una pequeña gota de pomada oftálmica en los ojos del ratón para asegurarse de que no se sequen mientras que bajo anestesia. NOTA: el ratón no debe ser dejado sin atención en ningún momento durante el proceso de formación de imágenes, mientras que bajo anestesia. </li></ol>En Vivo Imaging: Pilas de alta resolución y Adquisición Time-lapse <ol><li> Concéntrese en el cráneo a través de los oculares. <ol><li> Llenar la ventana de imagen con, agua estéril purificada y usando una lente de inmersión en agua, bajarlo de modo que toque la gota de agua. </li><li> Se centran en la parte superior del cráneo usando los oculares del microscopio, usando una lámpara externa como la fuente de luz. </li><li> Coloque el área de imagen en la sutura central y moverse hacia la parte posterior de la cabeza para encontrar la sutura coronal como una posición de partida. </li></ol></li><li> Ajuste el microscopio para permitir la excitación y la detección eficaz de los fluoróforos aplicables especificados en la tabla de excitación y emisión. NOTA: mientras que un confocal Leica SP5 en posición vertical con una cabeza de exploración galvanómetro convencional corriendo la plataforma de software LAS-AF se utiliza aquí, el procedimiento puede ser fácilmente replicado en otras plataformas microscopio / software. La lente se utiliza aquí es el Leica HCX IRAPO L 25x W / 0,95 NA blentes equivalentes ut de otros fabricantes están disponibles con un aumento adecuado y de alta NA <ol><li> Coloque el software en un modo para capturar ambas imágenes XY, así como una pila Z 3D y ajustar la velocidad de formación de imágenes a 400 Hz y la resolución de 512 x 512 píxeles. NOTA: la configuración de hardware y aquí resulta en un campo de visión de 620 micras y esto puede diferir en otras plataformas. </li><li> Configure el software para que varios canales / pistas son capaces de ser capturado, así como asegurar que el método de recolección está listo para cambiar la configuración entre pilas si es posible o entre bastidores, como mínimo. Establecer 3 configuraciones de captura independientes, la desconexión de la iluminación láser en el extremo de la adquisición de cada pila. NOTA: Se requieren tres canales para este procedimiento para reducir la diafonía entre los canales. </li><li> Configuración de los ajustes para la primera secuencia de exploración para la señal de hueso SHG dos fotones (840 nm de excitación; 400-440 nm de emisión); abrir el obturador para que el láser MP y garantizar MP Gain y Offset son configurados correctamente, la potencia del láser es de 12,5 - 25% y el láser se enciende. Seleccione un PMT apropiado como el único detector y cambiar el color a blanco. Nota: detectores de NDD con filtros apropiados se deben utilizar para la detección de hueso cuando esté disponible para lograr una señal más brillante, más profundo. </li><li> Repita el procedimiento de configuración de canal utilizado para el canal de las buenas prácticas agrarias para una autofluorescencia combinado (excitación 543 nm; 560 - 600 nm de emisión) y DiD (excitación 633 nm; 650-720 nm de emisión) en las segundas opciones de escaneado, utilizando dos PMT apropiadas. Cambiar el color de canal a verde para la autofluorescencia y rojo para el DiD. Nota: el uso de verde como el canal de auto-fluorescencia permite la detección más fácil de células positivas hicieron cuando los dos canales se superponen - células autofluorescentes aparecen como amarillo / naranja debido a que en ambos canales, mientras DiD células sólo aparecen como rojo, ya que sólo aparecen en el DiD canal. El canal de auto-fluorescenciasólo se utiliza para esta comparación y no se utiliza en ningún análisis final, sin embargo, si el usuario desea, esto se puede cambiar a un color diferente para fines de visualización para evitar la confusión con el canal de GFP. </li><li> Por último, la configuración de la tercera y última exploración para GFP (excitación 488 nm; 500-530 nm de emisión); asegúrese de que el obturador está abierto, si es necesario y luego establecer la potencia del láser de la línea de láser de 488 nm a alrededor de 15% o un nivel apropiado para el láser que se utiliza, seleccione un PMT apropiado como el único detector activo y cambiar su pseudocolor a verde. </li><li> Activar un modo de imagen &quot;en vivo&quot; para comenzar una exploración preliminar del canal seleccionado y ajuste de ganancia del detector y Offset para una exposición óptima. Repita esto para cada escaneo en la ventana secuencial. </li><li> Guarde los ajustes de estas exploraciones multi-canal para fácil reutilización. NOTA: esto permite al usuario para volver a cargar los ajustes en las sesiones posteriores. </li></ol></li><li> Activar la captura de múltiples posiciones, denominado «Marcar unnd Encuentra &quot;en el software demostrado, y restablecer los puntos de coordenadas. </li><li> Explore el área de imágenes de los huesos, a partir de la intersección entre la sutura central y coronal, escanear la profundidad de la zona de la médula ósea utilizando tanto autofluorescencia (pseudo color verde) y DiD con una vista compuesta (de color rojo pseudo). NOTA: células autofluorescentes estarán presentes en ambos canales y aparecerá de color naranja / amarillo en la imagen compuesta mientras que hice células marcadas aparecerán como-sólo rojo células en la imagen compuesta. </li><li> Cuando se detecta una célula, marcar esto como una nueva posición de coordenadas (x, y, z) en el &#39;Marcos y Encuentra &quot;herramienta haciendo clic en la ventana&quot; Agregar nuevo icono de posición en el lado izquierdo de la &quot;Marca y Encuentra&quot; . </li><li> Cuando se ha examinado el campo de vista actual, mover el escenario de la distancia de un campo de visión ya sea izquierda / derecha / arriba / abajo. Repita este proceso para cada campo de visión, trabajando poco a poco por todo el área de la ventana de imagen a la izquierda de jue sutura central, moviéndose hacia la nariz del ratón. Una vez que la bifurcación de sutura central es la vista, mueva hacia el lado derecho de la sutura y repetir el procedimiento de exploración del lado izquierdo en la dirección inversa (es decir, hacia la sutura coronal). Marque las coordenadas de las nuevas células de interés utilizando el &#39;Marcos y Encuentra&#39; herramienta. </li><li> Una vez que la exploración de la ventana de imagen es completa, utilice el &#39;Marcos y Encuentra &quot;herramienta para revisar los puntos (seleccionar el punto deseado y revisar cada punto por separado). Ajuste la parte superior e inferior de una pila Z alrededor de cada celda para cada posición, (muchas plataformas de software le permitirá realizar z-pilas independientes para cada posición, lo que reduce la captura de espacio vacío). Para cada punto, se centran arriba y hacia abajo y fijar posiciones superior e inferior Z para 3D captura z-stack y actualizar el punto individual en la &#39;Mark y Encontrar&#39;. Fije el intervalo Z-Stack a 5μm y un promedio para cada canal de recorrido secuencial a una calidad adecuada: Línea opromedio Frame r. NOTA: Aumentar el número de exploraciones para promediar aumenta la longitud del tiempo de adquisición. </li><li> Adquirir una pila de referencia de alta calidad para cada punto de interés, comenzando todo el procedimiento de escaneo (a menudo referido como &quot;Start&quot; en lugar de &quot;Capture&quot;). NOTA: esta exploración puede actuar como referencia para futuras imágenes de alta velocidad. </li><li> Una vez finalizado el escaneo de alta calidad, activar un ajuste de lapso de tiempo por la captura. </li><li> En la configuración de lapso de tiempo, establecer el intervalo de tiempo de 5 minutos y el tiempo total de ejecución a la longitud deseada (por ejemplo, 5 h). &#39;Aplicar&#39; estos ajustes para la exploración general. NOTA: con el fin de reducir este tiempo de exploración para permitir un intervalo de tiempo transcurrido 5 minutos, uno puede tener que reducir el número de análisis utilizados para promediar, limitar la resolución a 512 x 512 píxeles, convertir la exploración para bidireccional (con corrección de fase requerido para alinear los dos sentidos de escaneo), y / o aumentar la velocidad de exploración a 600 Hz o más (más de 600Hz hará que el zoom del área de imagen de la plataforma de software demostrado). También es importante señalar que mientras que un modo de imagen secuencial se utiliza para adquirir una imagen de alta calidad pila inicialmente, adquisición simultánea se utiliza para aumentar la velocidad de formación de imágenes durante el lapso de tiempo - esto puede resultar en una ligera diafonía entre los canales que sitúa adicional importancia en la captura inicial de las pilas de referencia separados con precisión. </li><li> Comenzar por imágenes (como antes haciendo clic en el botón &#39;Inicio&#39; en el software demostrado). NOTA: asegúrese de mantener el nivel adecuado de anestesia mediante la administración de más, dosis más pequeñas cuando sea necesario, teniendo cuidado de no sufrir una sobredosis con el ratón, regularmente recargar el agua para asegurar el objetivo no se seque y vigila los signos vitales y la temperatura de calentamiento-pad todo. </li><li> Cuando termine, levante la lente del soporte y luego retirar el soporte de la platina del microscopio, asegurando los cables de la sonda rectal y hcomer estera no estén dañados. </li><li> Desenrosque el cabezal del soporte de la platina y retirar con cuidado el ratón. Cull el ratón por dislocación cervical y eliminar el metal cabeza pieza asentándola fuera del cráneo. Guarde los datos en el disco y transferir al servidor para su posterior análisis. NOTA: La pieza de cabeza está idealmente limpiada por inmersión en acetona durante unas pocas horas y finalmente fuera frotando el cemento residual. </li></ol>

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There is nothing to disclose.

¿Qué se logró? El protocolo utiliza imágenes multidimensionales-lapso de tiempo para controlar la migración de FACS purificada, ex vivo etiquetados, HSPCs trasplantadas en ratones calvarial médula ósea. La identificación de las células trasplantadas individuales se ha logrado y éstos han sido objeto de seguimiento durante períodos prolongados de tiempo (hr) con gran precisión. Respirar los artefactos de movimiento inducidos se han minimizado y las células se han reimaged repetidamente durante un tiempo prolongado curso. ¿Cuáles son las direcciones futuras? Desarrollo de la técnica podría avanzar hacia experimentos de recuperación para permitir la formación de imágenes en varios días, en el transcurso de una semana o más y el uso de anestésicos tales como gas isoflurano para acortar y simplificar el proceso de recuperación para el ratón (Nota: los experimentos de recuperación requieren estrictamente condiciones de cirugía estériles y la administración de analgésicos apropiados). Development de un mayor color paleta de tintes en vivo, así como el etiquetado genética eficiente de células hematopoyéticas también facilitará experimentos multi-etiquetado, permite comprender mejor las interacciones célula-célula en la médula ósea y permitir experimentos más complejos en el futuro. Además, el etiquetado simultáneo de las estructuras de la médula ósea y varios componentes del estroma proporcionará una imagen más completa de los eventos que tienen lugar en nichos HSPC. Estabilidad de imagen de las películas a intervalos podría mejorarse preadquisición estabilizando el microscopio más, así como minimizar los gradientes de temperatura en la muestra y posterior a la adquisición mediante el uso de algoritmos de registro de imágenes. Limitaciones: La técnica descrita presenta algunas limitaciones. La supervivencia de los ratones después de la administración de anestésicos inyectables es impredecible y es muy fácil de experiencia complicaciones dependiendo de la respuesta individual a laanestésico. En general, cuanto más tiempo una sesión de imágenes, más difícil es para el ratón se recupere de la anestesia y por ello es importante planificar cuidadosamente si el ratón se va a recuperar, lo ideal es limitar la duración de las imágenes de lapso de tiempo. El uso de anestésicos inyectables limita el tiempo de cada sesión de formación de imágenes puede durar. Si bien es posible prolongar la anestesia por readministración una dosis más pequeña de anestésico, es difícil realizar esta precisión y una sobredosis del ratón es una de las causas más frecuentes de la terminación prematura de imágenes in vivo. Anestesia de gas es menos tóxico y permite una sesión más larga de imagen inicial, sin embargo rápida recuperación del ratón después de&gt; 2 hr a largo administración de isoflurano es raramente exitosa. Otra limitación de la técnica es la resolución limitada de las imágenes que se pueden obtener durante múltiples puntos de imagen de lapso de tiempo, debido a la necesidad de adquirir imágenes rápidamente. Esto, unido a la deriva o campo focal salta (discoussed arriba), puede hacer el seguimiento de las células difícil. Comparación con métodos alternativos: HSPCs suelen ser etiquetados con el colorante lipófilo DiD, pero DiR y DiI colorantes son alternativas equivalentes y otros colorantes celulares pueden ser usados ​​siempre y cuando lo suficientemente brillante, tal como fue revisado en [16]. A pesar de que el etiquetado ex vivo de células con DID se ha demostrado que no afecta a la función a largo plazo de las HSC, tiene la limitación de que DiD (o cualquier otro colorante químico) se diluye en la división celular. Desde HSCs proliferan durante los primeros días después del trasplante, la relación señal a ruido para estas células se deteriora rápidamente. Etiquetado endógena de las células por medio de la manipulación genética y expresión de proteínas fluorescentes es un método alternativo viable, siempre y cuando las proteínas fluorescentes se expresan a niveles suficientemente altos para generar la señal detectable a través del hueso del cráneo. Hay un número de techn alternativaiques disponibles para realizar las imágenes de HSPCs dentro del espacio de la médula ósea, cada uno con sus propias ventajas y limitaciones. La inserción de dispositivos de imagen basado en fibra óptica para formación de imágenes permitió la reconstitución de médula ósea en huesos largos [8], mientras que la imagen confocal después de la exposición quirúrgica de la tibia y el adelgazamiento del esmalte hueso con un taladro quirúrgico [12] produce imágenes detalladas de HSPCs residente en las zonas periféricas de los huesos largos. Sin embargo, estos métodos son mucho más invasivo que el descrito aquí y por lo tanto no permiten repetir las sesiones de formación de imágenes se centran en la misma zona de la médula ósea en el mismo ratón. Además, es posible que estas técnicas pueden afectar a las células observadas dada la respuesta inevitable a grandes daños en el tejido circundante. HSPCs han sido fotografiadas por cortos períodos de tiempo a través de cubreobjetos colocados sobre extirpados, fémures fracturados [11], sin embargo, el impacto de esta dura preparación del tejido en HSPCs no es clear y la técnica se utilizó únicamente para obtener observaciones de un solo punto de tiempo. Huesos de uso han sido seccionadas en cortes seriados, manchado, y las imágenes obtenidas reconstruido en un modelo 3D, que proporciona una excelente resolución en 3D, especialmente cuando se utilizan moldes vasculares [17], y recientemente de barrido láser de Citometría (CSL) se ha utilizado para obtener cuantitativa medidas sobre HSPCs in situ, destacaron por inmunotinción [18] pero no son capaces de proporcionar cualquier información temporal sobre el comportamiento de las células. Las técnicas descritas en esta nueva técnica proporcionan una combinación de buena resolución en 3D, el muestreo temporal suficiente para el seguimiento de las células en 4D y son relativamente no invasiva, por lo tanto ofrecer un enfoque ideal para lograr el seguimiento a largo plazo de HSPCs interactuar con la médula ósea microambiente.

A pesar de haber sido reconocidos nichos de células madre desde hace décadas 3 y caracterizan en muchos tejidos, así como el bulbo olfatorio, la fibra muscular, abultamiento del folículo del pelo o del SNC zona subventricular 4-7, las interacciones entre las células madre hematopoyéticas (HSC) y microambiente de la médula ósea ( BM) son aún poco conocidos debido a la dificultad de observar directamente las células individuales a través del hueso, así como la naturaleza extremadamente fluido del propio tejido. Se ha demostrado, a través de una serie de estudios funcionales sobre la base de la ablación o la sobreexpresión de genes específicos en cualquiera de las CMH o las células del estroma del propio microambiente, que una intrincada red de diferentes tipos de células y señales reguladoras es responsable de regular el delicado equilibrio entre la quietud , la proliferación, la expansión y diferenciación de las HSC 1-2. La diafonía entre HSC y sus nichos se puede entender en profundidad sólo a través de la observación directa. Este es ACHievable gracias a la elaboración de protocolos de imagen avanzadas, combinando la tecnología disponible no sólo en términos de la microscopía, sino también de soluciones de soporte de la muestra y del software de adquisición. Resolución de celda individual de imágenes en vivo de las células trasplantadas madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) en el compartimiento de la BM de los huesos calvaria ratón mostró que HSPCs de injerto se localizan en la proximidad de los vasos SDF-1 y VCAM-1-positivas 8-9 y que las células más inmaduras se encuentran dentro de 15 - 20 micras a partir de células osteoblásticas positivas para GFP (línea de ratón transgénico Col2.3-GFP, en la que el promotor 1α colágeno osteoblastos restringida conduce la expresión de GFP), mientras que su progenie son más distal 10. Observaciones similares se han obtenido a partir de huesos de fémur fracturados disecados y 11 y de los huesos tibeal adelgazadas 12. Obtención de imágenes de la médula ósea de calota sigue siendo el método menos invasivo para lograr la visualización directa de HSPCs dentro ªeir microambiente nativa. Con cualquier imagen espécimen vivo hay una necesidad inherente para mantener la muestra lo más quieto posible para evitar artefactos innecesarios debido al movimiento de la muestra. La respiración causa movimientos oscilatorios de la cabeza del ratón, que deben ser evitados cuando la formación de imágenes de médula ósea de calota. Titulares estereotácticas convencionales, utilizados por ejemplo para formación de imágenes del cerebro y electrofisiología, no son adecuados para formación de imágenes bóveda craneal porque obstruyen los huesos frontales. A partir de un soporte de ratón utilizado para disminuir el sufrimiento durante la formación de imágenes y electrofisiología estudios en vivo 13, un soporte de 2 componente fue desarrollado, con una pequeña pieza fija para la cabeza del ratón para crear una ventana de imágenes conectado a un brazo mayor asegurar asimiento estable con un placa base pesada que asegura firmemente en la platina del microscopio. Fijación de la pieza de cabeza en el cráneo del ratón permite la respiración libre, mientras que todavía la inmovilización de la cabeza en su sitio y eliminar adecuadamente movements debido a la respiración. Un mecanismo &#39;y llave de bloqueo&#39; que une la cabeza-pieza para el cuerpo de soporte permite que el tamaño de la ventana para minimizar así como una mayor precisión de posicionamiento, por lo tanto, la simplificación de la cirugía, y el ajuste de la placa de base en la etapa permite la alineación precisa en el microscopio. Para controlar con precisión células móviles, un protocolo de lapso de tiempo de múltiples puntos fue diseñado para permitir el rastreo de células en el tiempo con intervalos de 5 min entre puntos de tiempo. HSC Aquí, DiD marcadas se inyectaron en ratones reportero col2.3GFP osteoblasitc 10,14 y la imagen de aproximadamente 20 horas más tarde. El titular de ratón que fue diseñado y la configuración de imagen necesarios para realizar rápida de múltiples puntos de lapso de tiempo de formación de imágenes de las mismas áreas durante un período de múltiples hr se describen en detalle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine(Narketan 100mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:119px;">407575 0107 C</td>
			<td style="width:167px;">Other anesthetics may be used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Medetomidine(Domitor 1mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Elanco</td>
			<td style="width:119px;">134800-2</td>
			<td style="width:167px;">Other analgesics may b used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Vibrant DiD cell labeling solution</td>
			<td style="width:71px;">Roche Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">V22887</td>
			<td style="width:167px;">Other colors are available and may be used if required.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lacrilube ophtalmic ointment</td>
			<td style="width:71px;">Allergan</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">avaliable by prescription by the local vet</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Kemdent &#34;Diamond Carve&#34; glass ionomer cement</td>
			<td style="width:71px;">Associated Dental Products Ltd. via Kemdent</td>
			<td>SUN527</td>
			<td style="width:167px;">We use shade A3, but any shade of cement can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sterile water</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;">Terumo Medical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">SS10M3109</td>
			<td style="width:167px;">1mL, 31G</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">340031</td>
			<td style="width:167px;">Cone type (small)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Autoclaved forceps and scissors</td>
			<td style="width:71px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGT577 
			AGT5034</td>
			<td style="width:167px;">Iris scissors - 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Weigh boat and cement stirrer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>611-1996/231-0370</td>
			<td style="width:167px;">5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Not available</td>
			<td style="width:167px;">Call for quote</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506323</td>
			<td style="width:167px;">HCX IRAPO L lens</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Custom designed mouse holder</td>
			<td style="width:71px;">Imperial College Engineering Workshop</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">See Figure 1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Heating pad with rectal thermometer probe</td>
			<td style="width:71px;">BASi Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502</td>
			<td style="width:167px;">Heat mat/ Control box/ Thermometer probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow

A través de un delicado equilibrio entre la quiescencia y la proliferación, la auto renovación y la producción de progenie diferenciada, las células madre hematopoyéticas (HSC) mantener la rotación de todos los linajes de células sanguíneas maduras. La coordinación de las señales complejas que conducen a destinos específicos de HSC se basa en la interacción entre las HSC y el microambiente intrincada médula ósea, lo que aún es poco conocido [1-2]. Se describe cómo mediante la combinación de un soporte de la muestra de nuevo desarrollo para el posicionamiento de animales estable con múltiples pasos confocal y de dos fotones en las técnicas de imagen in vivo, es posible obtener de alta resolución 3D pilas que contienen HSPCs y sus nichos circundantes y para su seguimiento a través del tiempo a través de múltiples puntos de time-lapse. Formación de imágenes in vivo de alta definición permite que las células madre y progenitoras hematopoyéticas ex detección etiquetados (HSPCs) que reside dentro de la médula ósea. Por otra parte, múltiples puntos de imagen en 3D de lapso de tiempo, obtained con los ajustes de adquisición más rápidos, proporciona información precisa sobre el movimiento HSPC y las interacciones recíprocas entre HSPCs y células del estroma. Seguimiento de HSPCs en relación a las células osteoblásticas positivo GFP se muestra como un ejemplo de aplicación de este método. Esta técnica puede ser utilizada para el seguimiento de cualquier hematopoyéticas o células estromales apropiadamente marcada de interés dentro del espacio de la médula ósea bóveda craneal de ratón.

El encargo, titular de ratón de alta precisión incluyendo una ventana de imagen bóveda craneal de formación de imágenes permite prolongado de FACS HSPCs purificados, marcados inyectados en ratones receptores irradiados letalmente (Figura 1A). Típicamente, después de la inyección de entre 15 a 20.000 células marcadas, de 8 a 15 células son generalmente reconocible dentro de la zona de formación de imágenes de la médula ósea del cráneo al día siguiente. Aquí se muestra cómo adquirir resolución celular pilas individuales en 3D de HSPC-que contiene áreas de la médula ósea de aproximadamente 90 a 120 micras de espesor, (Figura 1B), seguido de 4D películas a intervalos de los HSPCs identificados (Figura 1C y películas). Se obtienen resultados subóptimos si el cemento dental no se prepara de manera óptima, por ejemplo, el agua podría gotear de áreas no selladas, y aunque se puede recargar desde la parte superior del soporte, cualquier período de tiempo en el que no se sumerge la lente en agua conduce a negro f<html> rames. Algunos de deriva en las imágenes es inevitable debido a la expansión térmica de los materiales del soporte de ratón, sin embargo, puede ser acentuada por la adhesión de cemento subóptima, que conduce a desprendimiento progresivo del ratón, y por perturbaciones de la formación de imágenes establecido, dando lugar a saltos repentinos del enfoque durante el time-lapse. Drift durante múltiples puntos time-lapse también puede ser causada por inexactitudes en los movimientos escénicos al Revisando posiciones previamente fotografiados. Drift y tartamudeo artefactos en películas a intervalos pueden ser corregidos por el uso de algoritmos de registro de imágenes. Tabla 1. de excitación y de emisión de configuración. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:204px;"> Canal de Color </td><td style="width:213px;"> Excitación </td><td style="width:208px;"> Emisión </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px; &quot;&gt; 488 nm </td><td style="width:208px;"> 500-530 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> Autofluorescencia </td><td style="width:213px;"> 543 nm </td><td style="width:208px;"> 560-610 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> DiD </td><td style="width:213px;"> 633 nm </td><td style="width:208px;"> 640-700 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> SHG </td><td style="width:213px;"> 840 nm (MP) </td><td style="width:208px;"> 400-450 nm </td></tr></tbody></table><img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1 En imágenes 4D vivo de HSPCs en la bóveda craneal de ratón. Células ejemplos de los resultados obtenidos (B) rodajas de 2D a partir de una pila 3D (profundidad total es de 114 micras), que contiene la señal de la médula colágeno (blanco), DiD marcados (rojo) - (A) Esquema del experimento (C B).. , cel autofluorescentels (amarillo) y las células osteoblásticas (verdes). Las barras de escala: 100 micras rodajas (C) 2D a partir de una película de lapso de tiempo 4D muestra una HSC DiD marcado (rojo) la migración en la proximidad de las células osteoblásticas (verdes).. La línea de puntos destaca el desplazamiento de la célula. Las barras de escala: 50 micras (B) y 100 m (c). NOTA:. La película obtenida a partir de la adquisición de lapso de tiempo en (C) se muestra en el artículo de vídeo <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

La naturaleza de las interacciones entre las células madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) y nichos de la médula ósea es poco conocido. Modificaciones de hardware personalizados y un protocolo de adquisición de múltiples pasos permiten el uso de dos fotones y microscopía confocal a la imagen ex vivo HSPCs etiquetados alojados dentro de las áreas de la médula ósea, las interacciones de seguimiento y el movimiento.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

in-vivo-4-dimensional-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

13.7K vistas.  Imperial College London.  La naturaleza de las interacciones entre las células madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) y nichos de la médula ósea es poco conocido. Modificaciones de hardware personalizados y un protocolo de adquisición de múltiples pasos permiten el uso de dos fotones y microscopía confocal a la imagen ex vivo HSPCs etiquetados alojados dentro de las áreas de la médula ósea, las interacciones de seguimiento y el movimiento. 

Video: In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

El trasplante de médula del riñón entero en adultos de pez cebra

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Investigación

Biología

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Mensajeras de las células hematopoyéticas de la médula ósea

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

El aislamiento y la expansión a gran escala de células humanas adultas Colonia progenitoras endoteliales formación

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Mejorar la precisión de la evaluación citométrica de flujo del potencial de la membrana mitocondrial en células hematopoyéticas de tallo y progenitor a través de la inhibición de las bombas de eflujo

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...