The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.

1. Preparación de la muestra <ol><li> Limpieza Cubreobjetos NOTA: Trabaje bajo una campana de humos. <ol><li> Utilice pinzas limpias para colocar cubreobjetos de vidrio (24 mm de diámetro) en un soporte de portaobjetos que separa cubreobjetos individuales. </li><li> Coloque el soporte con cubreobjetos en un vaso de precipitados y agregar cloroformo hasta que los cubreobjetos están cubiertos. Cubrir el vaso con papel de aluminio para reducir la evaporación y se somete a ultrasonidos en un baño de ultrasonido durante 1 hora a TA. Tome el titular cubreobjetos fuera del vaso y dejar que los cubreobjetos secos. </li><li> Repita el paso 1.1.2 con la solución de NaOH 5 M en vez de cloroformo. </li><li> Tome el soporte de cubreobjetos en un nuevo vaso de precipitados y lavar tres veces con agua destilada. Ponga cubreobjetos limpios en una placa de cultivo celular de vidrio lleno de etanol al 100%. </li></ol></li><li> Preparación de muestras de calibración <ol><li> Disolver colorante fluorescente en disolvente apropiado. </li><li> Preparar una dilución en serie 1:10 del colorante fluorescente que vande 13:00 a 1 nM en esterilizó por filtración (0,22 micras) del agua. </li><li> Tome cubreobjetos limpios almacenados en etanol al 100% y se lava con agua esterilizada por filtración. Punto 20 l de cada dilución tinte fluorescente en un cubreobjetos limpio separado. Deje que los portaobjetos se secan bajo una campana estéril. Proteja los cubreobjetos de la luz y el polvo hasta su uso. Utilice estas muestras para estimar la intensidad de moléculas fluorescentes individuales (ver paso 3). </li></ol></li><li> Transfección <ol><li> Células de cultivo de CHO en 01:01 mezcla de medio / nutriente Eagle modificado de Dulbecco F-12 (DMEM/F12) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina a 37 ° C, en . 5% de CO 2 NOTA: Utilice medios de comunicación libres de fenol rojo durante todo el experimento para minimizar la autofluorescencia. </li><li> Tome cubreobjetos limpios de solución de etanol al 100%, lávelos con una solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y coloque un cubreobjetos en cada pocillo de una cultura pl 6 celdas asícomió. </li><li> Trypsinize, contar y células CHO semilla a una densidad de 3 x 10 5 células / pocillo en la placa de cultivo celular de 6 pocillos que contiene los cubreobjetos. Deje que las células crecen en una incubadora (37 ° C, 5% CO 2) durante 24 horas a fin de alcanzar aprox. 80% de confluencia, que es la densidad celular óptima para la transfección. </li><li> Para cada pocillo, diluir 2 g de ADN plásmido deseado (p. ej., SNAP-etiquetados β 2-adrenérgicos) y 6 l Lipofectamine 2000 en dos tubos separados que contenían 500 medio OptiMem l. Incubar a TA durante 5 min. </li><li> Se combinan las soluciones de la etapa 1.3.4 en un tubo y mezclar para obtener una mezcla de transfección. Incubar la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Durante la incubación (1.3.5), tome las células CHO y lavar dos veces con pre-calentado (37 ° C) PBS. Reemplazar PBS con 1 ml / pocillo de fenol medio DMEM/F12 libre de rojo suplementado con 10% de FBS, pero sin antibióticos. </li><li> Añadir todo el transfectmezcla de iones (1 ml) de la Etapa 1.3.5 gota a gota a cada pocillo, y suavemente la placa de roca de ida y vuelta para asegurar una mezcla completa. </li><li> Incubar durante 2 a 4 horas a 37 ° C, en 5% de CO 2 y proceder inmediatamente después para el siguiente paso NOTA:. Estas condiciones de transfección se han optimizado para conseguir densidades de receptores de partícula &lt;0,45 / 2 micras, que son adecuados para un solo de formación de imágenes molécula. Los ajustes podrían ser necesarios cuando se utilizan diferentes células, construcciones o reactivos. </li></ol></li><li> El etiquetado de proteínas <ol><li> Diluir 1 l de solución madre de fluoróforo-BG en 1 ml de medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 10% para obtener una concentración final de 1 mM. Tome las células transfectadas de la incubadora y se lava dos veces con precalentado (37 ° C) de PBS. Reemplazar PBS con 1 ml de 1 M solución de fluoróforo-BG y se incuba durante 20 min a 37 º C 5% de CO 2 en una incubadora. </li><li> Después de la incubación, se lavan las células tresveces con medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 10%, cada vez seguido de 5 min de incubación a 37 ° C. Tome un cubreobjetos (con células marcadas) con unas pinzas y colocarlo en una cámara de imágenes. </li><li> Lavar dos veces con 300 l buffer de imágenes. Añadir 300 l de buffer de imágenes frescas y proceder de inmediato a las imágenes (Parte 2). </li></ol></li></ol> 2. Adquisición de imágenes NOTA: Use un total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopio, equipado con un objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numérica (por ejemplo, apertura numérica 100X magnification/1.46.), Los láseres adecuados (por ejemplo, 405 nm, 488 nm, 561 nm y 645 láseres de diodo nm), un dispositivo de acoplamiento de carga del electrón multiplicando (EMCCD) de la cámara, una incubadora y un control de temperatura para visualizar moléculas fluorescentes individuales. <ol><li> Establezca los parámetros de microscopio deseados, es decir., Línea de láser, el ángulo TIRF (este parámetro controla la penetraciónprofundidad ción del campo evanescente), tiempo de exposición, la velocidad de fotogramas y el número de imágenes por película 10. Mantenga el control de la calefacción / de la incubadora y la temperatura siempre a evitar las derivas de temperatura y la condensación de humedad. </li><li> Ponga una gota de aceite de inmersión sobre el objetivo 100X del microscopio. Coloque la cámara de formación de imágenes con las células marcadas en el portamuestras del microscopio, y traer las células en foco usando iluminación de campo claro. </li><li> Cambie a la iluminación TIRF. Mantener la potencia del láser tan bajo como sea posible para permitir la búsqueda de la célula deseada, pero al mismo tiempo se minimiza fotoblanqueo. </li><li> Seleccione la celda deseada y ajustar con precisión el enfoque. Establecer la potencia del láser a un nivel que permite la visualización de fluoróforos individuales. Adquirir secuencia de imágenes y guardar el archivo de secuencia de imágenes en bruto como. Tiff. </li></ol> 3. Calibración (fluoróforos individuales sobre Vidrio y monómeros / Controles receptor dimérico) <ol><li> Montar cada sampl calibracióne preparado como se describe en 1.2 en la cámara de formación de imágenes. Colocar cada muestra en el microscopio y elegir la muestra que contiene manchas de difracción limitada bien separados que el cloro en un solo paso NOTA:. Estos puntos representan moléculas individuales del colorante fluorescente. </li><li> Adquirir secuencias de imágenes TIRF como se describe en el paso 2 Importante:. Los mismos parámetros de la imagen se deben utilizar para todos los experimentos, incluidos los de calibración. </li><li> Lleve a cabo la detección y análisis de seguimiento tal como se detalla en el apartado 4.1 - 4.2. Extraer la intensidad de cada partícula como se describe en 4.2.6. A partir de estos datos, calcular la media (μ) y la desviación estándar (σ) de la intensidad de fluoróforos individuales. </li><li> Opcional: realizar el mismo análisis en células transfectadas con un receptor de superficie celular monomérico (. Por ejemplo, CD86), N-terminalmente etiquetado con ya sea una o dos copias de la SNAP 10 y se marcó con el derivado de fluoróforo-BG. FolloW el procedimiento descrito anteriormente para la solo fluoróforo en el vidrio. Estimar el etiquetado de eficiencia como se describe en Calebiro, D. et al. 10 </li></ol> 4. Análisis de Imágenes <ol><li> Preparación de secuencia de imagen <ol><li> Utilice un software de procesamiento de imágenes (por ejemplo., ImageJ) para recortar las imágenes. </li><li> Guardar imágenes individuales por separado. Imágenes TIFF en una carpeta nueva, indicando en cada imagen el número de fotograma. </li><li> Medir el área de la superficie celular mediante la elaboración de una región de interés (ROI) a lo largo del contorno de una célula y el uso de la herramienta de medida en ImageJ o una herramienta similar en otro software. Utilice este valor para calcular la densidad de partículas dividiendo el número total de partículas en el principio de la película por el área de superficie de la célula. </li></ol></li><li> La detección de partículas y de seguimiento NOTA: Utilice el software no comercial, como u-pista 13, trabajando en Matlabmedio ambiente, para detectar automáticamente y realizar un seguimiento de las partículas de los receptores individuales. NOTA: El algoritmo u-pista se basa en el enfoque de seguimiento de varias hipótesis. Este enfoque vincula partículas entre bastidores mediante la construcción de matrices de costos, donde se asignan las probabilidades individuales de que una partícula dada en un cuadro corresponde a una partícula dada en el siguiente cuadro, aparece, desaparece o se fusiona / divide a / de otras partículas. La solución que minimiza los costos a nivel global, es decir., La una con la probabilidad más alta, se seleccionó finalmente. Esto también permite el seguimiento de una partícula de desaparecer temporalmente, un fenómeno típico causado por fluoróforo parpadeo. La última versión de u-track (2.1.0) tiene interfaces gráficas de usuario que facilitan la ejecución de estos análisis. <ol><li> Desde la línea de comandos del Matlab, escriba &quot;movieSelectorGUI&quot; para abrir la interfaz de selección de películas. Siga las instrucciones para crear unanueva base de datos de películas a partir de las imágenes separadas previamente guardados (ver 4.1.2). </li><li> Proporcionar el tamaño de píxel en nm, intervalo de tiempo en segundos, apertura numérica, la profundidad de bits de la cámara y la longitud de onda de emisión del fluoróforo, requerido para la detección de partículas y de seguimiento. Guardar la base de datos de películas. </li><li> Desde la interfaz de selección de películas, ejecutar el análisis, la elección de &quot;partículas individuales&quot; como tipo de objetos. Una nueva ventana aparecerá donde los parámetros utilizados para la detección de las partículas y de seguimiento pueden ser definidos. Comience con los parámetros por defecto. Más tarde, ajustar estos parámetros si la calidad de la detección y / o el seguimiento no es satisfactoria (por ejemplo, algunas partículas no se detectan o pistas están fragmentados) Opcional:. En la configuración de seguimiento, comprobar &quot;los resultados de rastreo Exportar a formato de la matriz&quot; para almacenar las coordenadas y las amplitudes de todas las partículas en una sola matriz (campo llamado &quot;trackedFeaturedInfo&quot;). Para una descripción detallada de estos parámetros, consulte la documentación u-pista. </li><li> Ejecute el algoritmo de detección. Este algoritmo de determinar automáticamente la ubicación y la intensidad por encima del fondo de cada punto de difracción limitada (es decir., Complejos de receptores individuales / receptor) por el ajuste de una función de Gauss de dos dimensiones con una desviación estándar igual a la función de dispersión de punto del microscopio alrededor de máximos de intensidad local de . A continuación, ejecute el algoritmo de seguimiento. Guarde los resultados de los análisis en un archivo colchoneta.. </li><li> Utilice la rutina &quot;movieViewer&quot;, contenida en el paquete de u-pista, o los personalizados similares a visualizar las pistas y comprobar la calidad de la detección y el seguimiento. </li><li> Abrir el archivo de estera. Para ver la posición y la amplitud (es decir., Intensidad) de las partículas de orugas en cada marco. Los datos generados en el paso 4.2.4 se encuentran en el campo tracksCoordAmpCG del ar tracksFinalRay y / o en trackedFeaturedInfo. A partir del número total de partículas detectado calcular la densidad de partículas dividiendo este valor por el área de superficie de la célula medido a 4.1.3. </li><li> Opcional: Utilice la partícula coordina a través del tiempo (véase 4.2.6) para analizar el movimiento de las partículas de los receptores. Calcular los desplazamientos cuadráticos medios (MSD) y coeficientes de difusión (D) usando Matlab o software similar. Para cada partícula y cada intervalo de tiempo (Δ T) considerado, calcular el desplazamiento cuadrático medio (MSD) utilizando la siguiente fórmula: <img align="middle" alt="Ecuación 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq1.jpg" /> donde Δ t es el intervalo de tiempo en tramas, N es el número de pasos analizados, X e Y son X e Y de las coordenadas de la partícula en la trama indicada por el índice. Utilice el MSD sobre parcelas de tiempo para evaluar el tipo de movimiento de una partícula dada: relaciones linealesindican difusión libre (es decir., el movimiento browniano), una curvatura positiva (es decir., la curva parece una parábola) sugiere movimiento dirigido, una curvatura negativa es indicativa de movimiento limitado 14. En caso de partículas que se difunden libremente, calcular el coeficiente de difusión (D) de cada partícula ajustando los datos MSD obtenidos con la ecuación siguiente: <img align="middle" alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq2.jpg" /></li></ol></li><li> Cálculo del tamaño de partícula con método de ajuste de Gauss NOTA: Una vez que se conoce la distribución de intensidad de muestras de calibración (fluoróforos individuales sobre el vidrio y / o los receptores monoméricos marcados con fluorescencia), realizar un ajuste gaussiano mixta en la distribución de intensidades de partículas en el comienzo de una secuencia de imágenes para determinar el tamaño de los complejos receptores (es decir., el número de receptores por partícula) 10. Lleve a cabo estos análisis con Matlab o ssoftware imilar. <ol><li> Calcular la intensidad de cada partícula por media de la intensidad de la partícula desde el primer fotograma en el bastidor antes de que el primero se produjo cambio en la intensidad (en la mayoría de los casos una disminución debido a photobleaching). </li><li> Realizar un ajuste gaussiano mixta según la siguiente ecuación: <img align="middle" alt="Ecuación 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq3.jpg" /> donde φ (i) es la frecuencia de partículas que tiene una intensidad i, n es el número de componentes, α n es un parámetro que contribuye a la altura del componente N, μ y σ son la media y la desviación estándar de la intensidad de fluoróforos individuales de referencia . (calculado según se describe en el paso 3) NOTA: Determine tél número máximo de componentes (n max) para cada secuencia de imágenes mediante el aumento progresivamente n max hasta que la adición de un componente no ya no producen un estadísticamente mejor ajuste, como se juzga por una prueba F. </li><li> Opcional (por ej., Los últimos 60 fotogramas de una secuencia de fotogramas 400) Realice un ajuste gaussiano mixta en la distribución de la intensidad obtenida en los últimos fotogramas de la película. Reemplace μ y σ con los valores obtenidos después de este ajuste, que proporcionan estimaciones refinadas para esos parámetros, y repita el paso 4.3.2. </li><li> Calcular el área bajo la curva (AUC) de cada componente de la forma gaussiana mixta. Calcular la abundancia relativa de las partículas de los receptores de diferente tamaño (es decir, monómero, dímero, trímero, etc) dividiendo el valor de AUC de cada componente por la AUC de toda la distribución. </li><li>Opcional: Use datos de diferentes células y las densidades de las partículas correspondientes (calculados como se describe en 4.2.6) para generar parcelas donde la distribución de partículas con diferente tamaño se correlaciona con la densidad de la partícula 10. </li></ol></li><li> Cálculo del tamaño de partícula con el método de ajuste de paso NOTA: Utilice un análisis paso a montar como un método alternativo para determinar el tamaño de los complejos de receptores 10. La base de este análisis es que la destrucción inducida por la luz (photobleaching) de una sola resultados fluoróforo en su desaparición instantánea - Se espera por lo tanto, las partículas que contienen n fluoróforos que progresivamente lejía producir un perfil de intensidad con n pasos. <ol><li> Extracto de perfiles de intensidad de cada partícula del archivo colchoneta. Generada por u-pista o software de detección / seguimiento similar (ver 4.2.6). </li><li> Usa un algoritmo de paso de ajuste, tales como el presentadoen la ref. 10, para contar el número de etapas de blanqueo para cada partícula. </li><li> Opcional: utilizar los resultados para generar distribuciones que muestran la abundancia relativa de las partículas de los receptores de diferente tamaño y correlacionarlos con densidad de las partículas como se describe anteriormente para los resultados de la instalación de Gauss mixto (ver 4.3). </li></ol></li></ol>

<ol>
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J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: applications to membrane dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

El protocolo descrito permite el análisis de la disposición espacial, la movilidad y el tamaño de los complejos receptores de la superficie celular a nivel de una sola molécula. En comparación con el uso de proteínas fluorescentes, etiquetado con fluoróforos orgánicos pequeños, que son más brillantes y más fotoestable, tiene la ventaja de permitir la visualización ampliada de las partículas de los receptores individuales. Dado que los niveles de expresión extremadamente bajos se consiguen (&lt;0,45 de los ...

Receptores localizados en la superficie celular detectan el medio ambiente extracelular y responden a una variedad de estímulos, tales como odorantes, iones, pequeñas neurotransmisores y hormonas proteicas grandes. La naturaleza fluida de las membranas celulares permite movimientos de los receptores y otras proteínas de membrana. Esto es esencial para la formación de complejos de proteínas y la aparición de interacciones proteína-proteína transitorios, tales como los utilizados por los receptores para ensamblar en unidades funcionales y transducir señales al interior de la célula. Por ejemplo, los receptores de proteína G acoplados (GPCR), que constituyen la mayor familia de receptores de superficie celular 1, se han sugerido para formar di-/oligomers, que parece estar implicada en la regulación afinada de la transducción de señales y podría tener importantes consecuencias fisiológicas y farmacológicas 2-5. Microscopía sola molécula tiene el gran potencial de visualizar directamente con alta spatiotempresolución oral, el comportamiento dinámico de los receptores individuales situados en la superficie de las células vivas, incluyendo su asociación para formar dímeros y de orden superior complejos moleculares 6-10. Esto ofrece varias ventajas en comparación con los métodos bioquímicos y de microscopía estándar, que por lo general reportan el comportamiento medio de miles o millones de moléculas. El etiquetado de proteínas con un fluoróforo suficientemente brillante y fotoestable es esencial para la microscopía de una sola molécula. Este protocolo se aprovecha de la etiqueta SNAP recientemente introducido 11 para unir covalentemente fluoróforos orgánicos pequeños y brillantes a los receptores de la superficie celular. SNAP es un 20 kD etiqueta de proteína derivada de la enzima O-ADN alquiltransferasa 6-alquilguanina de reparación del ADN humano, que puede ser irreversible etiquetado con fluoróforo conjugado-bencilguanina derivados (fluoróforo-BG). CLIP, una etiqueta de ingeniería adicional derivado de SNAP, puede en cambio marcado con fluoróforo-cderivados bencilcitosina onjugated 12. El protocolo en este manuscrito se explica cómo transfectar y la etiqueta de SNAP-11 marcado con receptores pequeños fluoróforos orgánicos y el uso total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía para visualizar los receptores individuales o complejos de receptores en la superficie de las células vivas 10. Los resultados del protocolo reportados en&gt; 90% de eficiencia en el etiquetado de una proteína de la superficie celular de etiquetado SNAP extracelular 10. Más información sobre cómo utilizar los datos de una sola molécula para analizar el tamaño y la movilidad de los complejos receptores, así como para capturar las interacciones del receptor-receptor transitorio, se proporciona. Un flujo de trabajo esquemática de todo el protocolo se da en la Figura 1. Como un ejemplo, la transfección de células de ovario de hámster chino (CHO) con los receptores etiquetados SNAP-G-acoplados a proteínas (GPCRs) seguida por el etiquetado con un derivado de fluoróforo-BG como así como su aplicación a quantifse describen y y di-/oligomerization receptor de monitor. Este protocolo se puede extender a otras proteínas de la superficie celular y etiquetas fluorescentes (por ejemplo., CLIP), así como a otros métodos de transfección y etiquetado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="882">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:259px;">Chloroform</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1585</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">NaOH</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S8045</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: strong base and highly corrosive reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">32205</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Glass coverslip&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Marienfeld-Superior</td>
			<td style="width:115px;">111640</td>
			<td style="width:261px;">24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.2 mm sterile filter</td>
			<td style="width:248px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:115px;">83.1826.001</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CHO cells</td>
			<td style="width:248px;">ATCC, USA</td>
			<td style="width:115px;">ATCC CCL-61</td>
			<td style="width:261px;">Chinese hamster ovary cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well cell culture plare</td>
			<td style="width:248px;">Nunc</td>
			<td style="width:115px;">140675</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM/F-12 medium</td>
			<td style="width:248px;">GIBCO, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11039-021</td>
			<td style="width:261px;">Phenol-red free medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Biochrom</td>
			<td style="width:115px;">S 0115</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Penicillin - streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P06-07 100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P10-23100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11668-019</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">31985-047</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fluorophore-conjugated benzylguanine&#160;</td>
			<td style="width:248px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:115px;">S9136S</td>
			<td style="width:261px;">SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMSO</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1584</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:259px;">Imaging buffer:</td>
			<td style="width:248px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; NaCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1371</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; KCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3582</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; CaCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A2303</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; MgCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3618</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; HEPES</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3724</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">Imaging chamber</td>
			<td style="width:248px;">Molecular Probes, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">A-7816</td>
			<td style="width:261px;">Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF-M</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Model: DMI6000B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF objective</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;">11 506 249&#160;</td>
			<td style="width:261px;">HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">EM-CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Photometrics Cascade 512B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:248px;">Pecon</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Tempcontrol 37-2 digital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:248px;">NIH, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">u-track software</td>
			<td style="width:248px;">Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Matlab software</td>
			<td style="width:248px;">The MathWorks, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution spatiotemporal analysis of receptor dynamics by single-molecule fluorescence microscopy

Microscopía sola molécula está surgiendo como un enfoque poderoso para analizar el comportamiento de las moléculas de señalización, en particular en lo referente a los aspectos (por ejemplo., La cinética, la coexistencia de los diferentes estados y poblaciones, interacciones transitorias), que normalmente se ocultan en las mediciones del conjunto, tales como los obtenidos con métodos bioquímicos o de microscopía estándar. Por lo tanto, los eventos dinámicos, como las interacciones receptor-receptor, se pueden seguir en tiempo real en una célula viva con una alta resolución espacial y temporal. Este protocolo describe un método basado en el etiquetado con fluoróforos orgánicos pequeños y brillantes y el total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía para visualizar directamente los receptores individuales en la superficie de las células vivas. Este enfoque permite a localizar con precisión los receptores, medir el tamaño de los complejos receptores, y la captura de eventos dinámicos, como las interacciones receptor-receptor transitorio. El protocolo proporciona una descripción detallada de la forma de performa un experimento de una sola molécula, incluyendo la preparación de muestras, adquisición de imágenes y análisis de imágenes. Como un ejemplo, la aplicación de este método para analizar dos receptores G acoplados a la proteína,, β 2-adrenérgicos y γ-aminobutírico de tipo ácido B (GABA B), se informó es decir.. El protocolo se puede adaptar a otras proteínas de la membrana y diferentes modelos de células, métodos de transfección y estrategias de etiquetado.

El protocolo descrito se puede aplicar a una variedad de diferentes proteínas de la membrana. Como un ejemplo, los resultados representativos obtenidos con β 2-adrenérgicos y GABA B se reportan 10. Dado que las señales fluorescentes de las moléculas individuales son débiles, la minimización de la fluorescencia de fondo es el primer paso clave para obtener resultados exitosos. Por lo tanto, es importante utilizar cubreobjetos ampliamente limpiadas (Figura 2A), así...

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High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

high-resolution-spatiotemporal-analysis-receptor-dynamics-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K vistas.  University of Würzburg, Germany. This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins. 

Video: High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

3D de alta resolución de imagen de Ex-Vivo Muestras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Investigación

Bioingeniería

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Individual Detección Molecule-Label gratis con Microtoroid ópticos Resonadores

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Ingeniería 'Oro' de la fluorescencia por presión selectiva incorporación de aminoácidos no canónica y análisis de proteínas por espectrometría de masas y la fluorescencia

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...