The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Deckglasreinigung HINWEIS: Arbeiten unter einer Abzugshaube. <ol><li> Verwenden Sie saubere Pinzette Deckgläschen (24 mm Durchmesser) in einem Deckglas Halter, die einzelnen Deck trennt platzieren. </li><li> Setzen Sie die Halterung mit Deckgläsern in ein Becherglas, und fügen Chloroform, bis die Deckgläschen abgedeckt. Das Becherglas wird mit Aluminiumfolie, die Verdunstung und beschallen in einem Ultraschallbad für 1 h bei RT reduzieren. Nehmen Sie die Deckhalter aus dem Becherglas und lassen Sie die Deckgläser trocken. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.1.2 mit 5 M NaOH-Lösung anstelle von Chloroform. </li><li> Nehmen Sie die Deckhalter in eine neue Becherglas gegeben und dreimal mit destilliertem Wasser. Setzen gereinigt Deck in einem Glas-Zellkulturplatte mit 100% Ethanol gefüllt. </li></ol></li><li> Herstellung der Eichproben <ol><li> Auflösen fluoreszierenden Farbstoff in einem geeigneten Lösungsmittel. </li><li> Bereiten Sie eine serielle 01.10 Verdünnung der Fluoreszenzfarbstoff im Bereichvon 01.00 bis 1 nM in Filter sterilisiert (0,22 um) Wasser. </li><li> Nehmen gereinigt Deckgläser in 100% Ethanol gelagert und waschen mit Filter-sterilisiertem Wasser. Punkt 20 ul jeder Fluoreszenzfarbstoff Verdünnung auf einem separaten Deckglas gereinigt. Lassen Sie die Deckgläser trocknen unter einem sterilen Abzug. Schützen Sie die Deckgläser, vor Licht und Staub bis zur Verwendung. Mit diesen Proben, die Intensität der einzelnen fluoreszierenden Molekülen (siehe Schritt 3) zu schätzen. </li></ol></li><li> Transfektion <ol><li> CHO-Zellen in Kultur 1:1 Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium / Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F12) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin bei 37 ° C, supplementiert . 5% CO 2 HINWEIS: Phenolrot-freien Medien während des Experiments zu Autofluoreszenz zu minimieren. </li><li> Nehmen gereinigt Deckgläser aus 100% Ethanol-Lösung, waschen Sie sie mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und legen Sie ein Deckglas in jedes Well einer 6-Well-Zellkultur plaß. </li><li> Trypsinize, zählen und Samen CHO-Zellen in einer Dichte von 3 x 10 5 Zellen / Well in 6-Well-Zellkulturplatte mit den Deckgläsern. Lassen sich die Zellen (37 ° C, 5% CO 2) wachsen in einem Inkubator für 24 Stunden, um einen max. 80% Konfluenz, die die optimale Zelldichte für die Transfektion ist. </li><li> Für jeden gut verdünnen 2 ug des gewünschten Plasmid-DNA (zB., Β 2-adrenergen Rezeptor-SNAP-tagged) und 6 ul Lipofectamine 2000 in zwei getrennten Röhren mit 500 ul OptiMem Medium. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Kombinieren Sie die Lösungen aus Schritt 1.3.4 in ein Rohr und mischen, um eine Transfektion Mischung zu erhalten. Inkubieren der Transfektion bei RT für 20 min. </li><li> Während der Inkubation (1.3.5), nehmen Sie die CHO-Zellen und waschen zweimal mit vorgewärmten (37 ° C) PBS. Ersetzen PBS mit 1 ml / Vertiefung phenolrotfreiem DMEM/F12-Medium mit 10% FBS, aber keine Antibiotika. </li><li> Fügen Sie den gesamten TransfektionIonen-Mischung (1 ml) aus Schritt 1.3.5 tropfenweise in jede Vertiefung und schaukeln die Platte hin und her, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten. </li><li> Inkubation für 2 bis 4 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2 und gehen unmittelbar danach zum nächsten Schritt. HINWEIS: Die Transfektion Bedingungen wurden optimiert, um Rezeptordichten &lt;0,45 Partikel / &amp;mgr; m 2, die für Einzel zu erzielen Molekül-Bildgebung. Anpassungen könnten bei der Verwendung von verschiedenen Zellen, Konstrukte oder Reagenzien erforderlich. </li></ol></li><li> Proteinmarkierungs <ol><li> 1 &amp;mgr; l der verdünnten Fluorophor-BG-Stammlösung in 1 ml DMEM/F12 Medium mit 10% FBS, um eine Endkonzentration von 1 uM erhalten. Nehmen Sie die transfizierten Zellen aus dem Inkubator und waschen zweimal mit vorgewärmten (37 ° C) PBS. Ersetzen PBS mit 1 ml von 1 uM Fluorophor-BG-Lösung und Inkubation für 20 min bei 37 ° C 5% CO 2 im Brutschrank. </li><li> Nach der Inkubation, Waschen Sie die Zellen dreimals mit DMEM/F12 Medium mit 10% FBS, jedesmal gefolgt von 5 min Inkubation bei 37 ° C. Nehmen Sie ein Deckglas (mit markierten Zellen) mit einer Pinzette und legen Sie sie in einem bildgebenden Kammer. </li><li> Zweimal waschen mit 300 ul Bildpuffer. In 300 ml frisches Bildpuffer und gehen sofort auf Bildgebung (Teil 2). </li></ol></li></ol> 2. Image Acquisition HINWEIS: Verwenden Sie eine Totalreflexion (TIRF)-Mikroskop, mit einer Öl-Immersion mit hoher numerischer Apertur Ziel (zB 100X magnification/1.46 numerische Apertur.), Geeignete Laser (zB 405 nm, 488 nm, 561 nm und 645 ausgestattet nm Diodenlaser), ein Elektronenvervielfachungs Charge Coupled Device (EMCCD)-Kamera, ein Inkubator und eine Temperaturregelung, einzelne fluoreszierende Moleküle zu visualisieren. <ol><li> Stellen Sie die gewünschten Parameter Mikroskop, dh., Laserlinie, TIRF-Winkel (steuert dieser Parameter die Durchdringungtion Tiefe des evaneszenten Feld), Belichtungszeit, Bildrate und die Anzahl der Bilder pro Film 10. Halten Sie die Heizung / Inkubator-und Temperatursteuerung immer auf Temperaturdriften und Feuchtigkeitskondensation zu vermeiden. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf dem 100X Objektiv des Mikroskops. Legen Sie die Bildkammer mit den markierten Zellen auf den Probenhalter des Mikroskops, und bringen die Zellen im Fokus mit Hellfeldbeleuchtung. </li><li> Wechseln Sie in den TIRF-Beleuchtung. Halten Laserleistung so gering wie möglich, damit die Suche nach der gewünschten Zelle, aber zur gleichen Zeit minimiert Photobleichen. </li><li> Wählen Sie die gewünschte Zelle und Feineinstellung des Fokus. Stellen Sie die Laserleistung auf einem Niveau, das die Visualisierung einzelner Fluorophore ermöglicht. Erwerben Sie Bildfolge und speichern rohen Bildsequenz-Datei als. Tiff. </li></ol> 3. Kalibrierung (Single Fluorophore auf Glas und Monomer / Dimer-Rezeptor-Controls) <ol><li> Montieren Sie jede Kalibrierung sample wie in 1.2 in der Imaging-Kammer beschrieben. Platzieren Sie jede Probe auf dem Mikroskop und wählen Sie die Probe, die gut getrennten beugungsbegrenzten Flecken, die in einem einzigen Schritt zu bleichen HINWEIS:. Diese Spots einzelne Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs zu vertreten. </li><li> Erwerben TIRF Bildsequenzen, wie in Schritt 2 beschrieben. Wichtig: die gleichen Abbildungsparameter muss für alle Experimente, wie die, die für die Kalibrierung verwendet werden. </li><li> Führen Sie die Erkennung und Tracking-Analyse, wie in 4.1 beschrieben - 4.2. Entpacken Sie die Intensität der einzelnen Teilchen wie in 4.2.6 beschrieben. Aus diesen Daten berechnet den Mittelwert (μ) und Standardabweichung (σ) der Intensität der einzelnen Fluorophore. </li><li> Optional führen die gleiche Analyse auf Zellen mit einem monomeren Zelloberflächenrezeptor (. Z. B. CD86) transfiziert, N-terminal mit ein oder zwei Kopien von SNAP 10 markiert und mit dem Fluorophor-BG-Derivat markiert. Follow der oben für die einzelnen Fluorophor auf Glas beschriebenen Verfahren. Schätzen Sie die Markierungseffizienz wie in Calebiro, D. et al. 10. </li></ol> 4. Bildanalyse <ol><li> Bildsequenz Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie eine Bildverarbeitungssoftware (zB., ImageJ), um die Bilder zu beschneiden. </li><li> Speichern Sie einzelne Bilder als separate. TIFF-Bilder in einem neuen Ordner, was auf jedem Bild die Rahmennummer. </li><li> Messung der Zelloberfläche, indem ein interessierender Bereich (ROI) entlang der Kontur der Zelle und mit dem Messwerkzeug in ImageJ oder ein ähnliches Werkzeug in eine andere Software. Diesen Wert verwenden, um die Partikeldichte, die durch Dividieren der Gesamtzahl der Teilchen am Anfang des Films von der Oberfläche der Zelle zu berechnen. </li></ol></li><li> Partikeldetektion und-verfolgung HINWEIS: Verwenden Sie nicht-kommerzielle Software wie U-Bahn 13, die in MatlabUmwelt, automatisch zu erkennen und zu verfolgen einzelnen Rezeptor-Partikel. HINWEIS: Die u-Track-Algorithmus basiert auf der Hypothese, Multiple-Tracking-Ansatz. Dieser Ansatz verbindet Teilchen zwischen Frames, indem Kosten Matrizen, wobei die einzelnen Wahrscheinlichkeiten, dass ein bestimmtes Teilchen in einem Rahmen entspricht einem bestimmten Teilchen im nächsten Rahmen angezeigt wird, verschwindet oder verschmilzt / Splits mit / von anderen Teilchen zugeordnet sind. Die Lösung, die die Kosten minimiert, global, dh., Die mit der höchsten Wahrscheinlichkeit wird schließlich ausgewählt. Dies ermöglicht auch die Verfolgung eines vorübergehend verschwinden Teilchen, ein typisches Phänomen von Fluorophor Blinken verursacht. Die neueste Version von u-Bahn (2.1.0) hat grafische Benutzerschnittstellen, die die Ausführung dieser Analysen zu erleichtern. <ol><li> Von der Matlab-Eingabeaufforderung &quot;movieSelectorGUI&quot;, um den Film Auswahl Schnittstelle zu öffnen. Folgen Sie den Anweisungen, um eine zu erstellenneue Filmdatenbank ausgehend von den zuvor gespeicherten separate Bilder (siehe 4.1.2). </li><li> Stellen die Pixelgröße in nm, Zeitintervall in Sekunden, numerische Apertur, Kamera Bittiefe und Emissionswellenlänge des Fluorophors zur Partikeldetektion und-verfolgung erforderlich. Speichern Sie die Film-Datenbank. </li><li> Aus dem Film-Auswahl-Schnittstelle, führen Sie die Analyse, die Wahl &quot;single-Teilchen&quot; als Typ der Objekte. Ein neues Fenster wird angezeigt, in dem die für die Partikelerkennung und-verfolgung verwendeten Parameter definiert werden können. Beginnen Sie mit den Standardparametern. Später, stellen Sie diese Parameter, wenn die Qualität der Erkennung und / oder Verfolgung nicht zufriedenstellend ist (zB sind einige Teilchen nicht erkannt oder Tracks sind fragmentiert) Optional:. Unter den Tracking-Einstellungen überprüfen &quot;Export Tracking-Ergebnisse zu Matrix-Format&quot; zu speichern die Koordinaten und die Amplituden aller Teilchen in einer Matrix (Feld &quot;trackedFeaturedInfo&quot;). Für eine detaillierte Beschreibung dieser Parameter, auf die U-Bahn-Dokumentation. </li><li> Führen Sie den Erkennungsalgorithmus. Dieser Algorithmus den Ort und die Intensität über den Hintergrund der einzelnen beugungsbegrenzten Fleck (dh., Einzel-Rezeptoren / Rezeptor-Komplexe), indem eine zweidimensionale Gauß-Funktion mit einer Standardabweichung gleich der Punktbildfunktion des Mikroskops um lokale Intensitätsmaxima automatisch ermitteln . Führen Sie dann den Tracking-Algorithmus. Bewahren Sie die Ergebnisse der Analysen in einem. Matte Datei. </li><li> Verwenden Sie die &quot;movieViewer&quot;-Routine, in der u-Track-Paket enthalten ist, oder ähnliche Gewohnheit eine, um die Titel zu visualisieren und überprüfen die Qualität der Erkennung und Verfolgung. </li><li> Öffnen Sie die. Mat-Datei, um die Position und Amplitude (dh., Intensität) der verfolgten Teilchen bei jedem Rahmen sehen. In Schritt 4.2.4 erzeugten Daten werden in der tracksCoordAmpCG Feld der tracksFinal ar enthaltenray und / oder in trackedFeaturedInfo. Aus der Gesamtzahl der Teilchen detektiert errechnen Teilchendichte Dividieren dieses Werts durch die Zelloberfläche gemessen bei 4.1.3. </li><li> Optional: Verwenden Sie die Partikelkoordinaten über die Zeit (siehe 4.2.6), um die Bewegung der Rezeptor-Partikel zu analysieren. Berechnen Sie die mittlere quadratische Verschiebungen (MSD) und Diffusionskoeffizienten (D) mit Matlab oder ähnliche Software. Zu jedem Teilchen und jedes Zeitintervall (Δ t) betrachtet, die Berechnung der mittleren quadratischen Verschiebung (MSD) mit folgender Formel: <img align="middle" alt="Gleichung 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq1.jpg" /> wobei Δ T das Zeitintervall in Rahmen ist, N die Anzahl von Schritten analysiert, x und y des Teilchens x-und y-Koordinaten an der durch den Index angegebenen Rahmen. Verwenden Sie den MSD im Laufe der Zeit Grundstücke, um die Art der Bewegung einer bestimmten Partikel bewerten: Lineare Beziehungenzeigen freie Diffusion (dh., Brownsche Bewegung), eine positive Krümmung (dh., sieht die Kurve wie eine Parabel) deutet gerichtete Bewegung, ist eine negative Krümmung bezeichnend für Bewegung beschränkt 14. Im Falle von frei diffundierenden Teilchen, die Berechnung der Diffusionskoeffizienten (D) von jedem Teilchen durch Anpassung der erhaltenen MSD Daten mit der folgenden Gleichung: <img align="middle" alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq2.jpg" /></li></ol></li><li> Berechnung der Partikelgröße mit Gauß-Anpassungsverfahren HINWEIS: Wenn die Intensitätsverteilung des Kalibrierungsproben (einzelner Fluorophore auf Glas und / oder fluoreszierend markierten monomeren Rezeptoren) bekannt ist, führen eine gemischte Gauß-Fit auf die Verteilung der Partikelintensitäten zu Beginn einer Bildsequenz, die Größe der Rezeptor-Komplexe zu bestimmen, (dh. die Anzahl der Rezeptoren pro Partikel) 10. Führen Sie diese Analysen mit Matlab oder similar Software. <ol><li> Berechnen der Intensität von jedem Teilchen durch Mittelung der Intensität des Teilchens aus dem ersten Bild zu dem Rahmen vor der ersten Intensitätsänderung aufgetreten ist (in den meisten Fällen eine Abnahme durch Photobleaching). </li><li> Durchführen einer Gaußschen Mischarmatur nach der folgenden Gleichung: <img align="middle" alt="Gleichung 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq3.jpg" /> wobei φ (i) die Frequenz von Teilchen mit Intensität i, n die Komponentennummer, α n ein Parameter ist, die der Höhe der Komponente n trägt, μ und σ sind der Mittelwert und der Standardabweichung der Intensität des Referenz einzelner Fluorophore . (berechnet wie in Schritt 3 beschrieben) HINWEIS: Bestimmen Sie ter maximale Anzahl von Komponenten (n max) für jede Bildsequenz von progressiv zunehmenden n max bis die Zugabe einer Komponente ist nicht mehr produzieren eine statistisch bessere Passform, wie durch einen F-Test beurteilt. </li><li> Optional: (. ZB die letzten 60 Frames einer Bildfolge 400) Führen Sie eine gemischte Gauß-Sitz auf der Intensitätsverteilung auf den letzten Frames des Films erhalten. Μ und σ Ersetzen mit den nach dieser Armatur erhaltenen Werte, die raffinierte Schätzungen für diese Parameter liefern, und wiederholen Sie Schritt 4.3.2. </li><li> Berechnen der Fläche unter der Kurve (AUC) für jede Komponente der gemischten Gauß Form. Berechnung der relativen Häufigkeit von Rezeptor Teilchen unterschiedlicher Größe (dh Monomer, Dimer, Trimer etc.) durch Dividieren der AUC-Wert von jeder Komponente von der AUC der gesamten Verteilung. </li><li>Optional: Verwendung von Daten aus verschiedenen Zellen und die entsprechenden Partikeldichten (berechnet wie in 4.2.6 beschrieben) auf Flächen, auf denen die Verteilung der Teilchen mit unterschiedlicher Größe mit Partikeldichte 10 korreliert zu erzeugen. </li></ol></li><li> Berechnung der Partikelgröße mit Schritt Anpassungsverfahren HINWEIS: Verwenden Sie eine Schritt-für Montage-Analyse als eine alternative Methode, um die Größe der Rezeptor-Komplexe 10 zu bestimmen. Die Grundlage für diese Analyse ist, dass die lichtinduzierte Zerstörung (Photobleaching) eines einzelnen Fluorophors Ergebnisse in seiner augenblicklichen Verschwinden - also Teilchen mit n Fluorophore werden voraussichtlich schrittweise Bleich Herstellung eines Intensitätsprofil mit n Schritten. <ol><li> Auszug Intensitätsprofile der einzelnen Teilchen aus dem von U-Bahn oder ähnliche Erkennung /-Tracking-Software (siehe 4.2.6) erzeugt. Matte Datei. </li><li> Verwenden einen Schritt Anpassungsalgorithmus, wie der vorgein ref. 10, um die Anzahl der Bleichschritte für jedes Teilchen zählen. </li><li> Optional: Verwenden Sie die Ergebnisse auf Ausschüttungen, die die relative Häufigkeit von Rezeptor-Partikeln unterschiedlicher Größe erzeugen und korrelieren sie mit Partikeldichte, wie zuvor für die Ergebnisse der gemischten Gaußsche Anpassung beschrieben (siehe 4.3). </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Die beschriebenen Protokoll ermöglicht die Analyse der räumlichen Anordnung, Mobilität und Größe der Zelloberflächenrezeptor-Komplexen auf Einzelmolekülebene. Verglichen mit der Verwendung von fluoreszierenden Proteinen, Markierung mit kleinen organischen Fluorophoren, die heller und photostabil sind, hat den Vorteil, daß die erweiterte Darstellung der einzelnen Rezeptor Teilchen. Da sehr niedrige Expressionsniveaus erzielt werden (&lt;0,45 Rezeptor Teilchen / &amp;mgr; m 2), die Eigenschaften der Rez...

Rezeptoren auf der Zelloberfläche zu erfassen und die extrazelluläre Umgebung reagieren auf eine Vielzahl von Stimuli, wie z. B. Duftstoffe, Ionen, Neurotransmittern kleinen und großen Proteinhormone. Die Flüssigkeit Natur der zellulären Membranen ermöglicht Bewegungen von Rezeptoren und anderen Membranproteinen. Dies ist wichtig für die Bildung von Proteinkomplexen und dem Auftreten von transienten Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie sie von Rezeptoren verwendet werden, um in Funktionseinheiten zusammenzubauen und zu transduzieren Signale ins Zellinnere. Zum Beispiel G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), die die größte Familie von Zelloberflächenrezeptoren 1 ausmachen, sind vorgeschlagen worden, um di-/oligomers, die in der Feinabstimmung Regulierung der Signaltransduktion beteiligt zu sein scheint und bilden könnte wichtige physiologische und pharmakologische Auswirkungen haben 2-5. Einzelmolekül-Mikroskopie hat das große Potential der Visualisierung direkt mit hoher spatiotempMund Auflösung das dynamische Verhalten der einzelnen Rezeptoren auf der Oberfläche von lebenden Zellen, einschließlich ihrer Verbindung angeordnet ist, um Dimere und höhere Ordnung Molekülkomplexe 6-10 bilden. Dies bietet mehrere Vorteile gegenüber Standard biochemischen und Mikroskopieverfahren, die in der Regel den Durchschnittswert Verhalten von Tausenden oder Millionen von Molekülen. Proteinmarkierung mit einem ausreichend hell und photo Fluorophor für Einzelmolekül-Mikroskopie von wesentlicher Bedeutung. Dieses Protokoll nutzt die kürzlich eingeführten SNAP-Tag 11 bis kovalent klein und hell organischen Fluorophore Zelloberflächenrezeptoren. SNAP ist ein 20 kD Protein-Tag aus der menschlichen DNA-Reparaturenzym O 6-Alkylguanin-DNA Alkyltransferase, die irreversibel mit fluorophorkonjugierten Benzylguanin (Fluorophor-BG)-Derivate bezeichnet werden kann, abgeleitet. CLIP, eine weitere technisch-Tag aus SNAP abgeleitet, kann stattdessen mit Fluorophor-c gekennzeichnet werdenonjugated benzylcytosine Derivate 12. Das Protokoll in diesem Manuskript berichtet, erklärt, wie Transfektion und Label-SNAP-11-Rezeptoren getaggt mit kleinen organischen Farbstoffen und benutzen Totalreflexion (TIRF) Mikroskopie einzelne Rezeptoren oder Rezeptor-Komplexe auf der Oberfläche lebender Zellen 10 visualisieren. Die berichteten Ergebnisse im Protokoll&gt; 90% Markierungseffizienz eines extrazellulär SNAP-markierten Zelloberflächenprotein 10. Weitere Informationen darüber, wie Einzelmolekül-Daten verwenden, um die Größe und die Mobilität von Rezeptor-Komplexe zu analysieren, als auch transient receptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu erfassen, bereitgestellt. Eine schematische Ablauf des gesamten Protokolls ist in Fig. 1 angegeben. Als Beispiel die Transfektion von Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen, die mit SNAP-markierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) durch Markierung mit einem Fluorophor-BG-Derivat wie folgt sowie ihre Anwendung auf quantify und Monitor-Rezeptor di-/oligomerization beschrieben. Dieses Protokoll kann auch für andere Zelloberflächenproteine ​​und fluoreszierende Markierungen (zB., CLIP), sowie zu anderen Transfektions-und Markierungsverfahren erweitert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="882">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:259px;">Chloroform</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1585</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">NaOH</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S8045</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: strong base and highly corrosive reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">32205</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Glass coverslip&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Marienfeld-Superior</td>
			<td style="width:115px;">111640</td>
			<td style="width:261px;">24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.2 mm sterile filter</td>
			<td style="width:248px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:115px;">83.1826.001</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CHO cells</td>
			<td style="width:248px;">ATCC, USA</td>
			<td style="width:115px;">ATCC CCL-61</td>
			<td style="width:261px;">Chinese hamster ovary cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well cell culture plare</td>
			<td style="width:248px;">Nunc</td>
			<td style="width:115px;">140675</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM/F-12 medium</td>
			<td style="width:248px;">GIBCO, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11039-021</td>
			<td style="width:261px;">Phenol-red free medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Biochrom</td>
			<td style="width:115px;">S 0115</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Penicillin - streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P06-07 100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P10-23100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11668-019</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">31985-047</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fluorophore-conjugated benzylguanine&#160;</td>
			<td style="width:248px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:115px;">S9136S</td>
			<td style="width:261px;">SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMSO</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1584</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:259px;">Imaging buffer:</td>
			<td style="width:248px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; NaCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1371</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; KCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3582</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; CaCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A2303</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; MgCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3618</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; HEPES</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3724</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">Imaging chamber</td>
			<td style="width:248px;">Molecular Probes, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">A-7816</td>
			<td style="width:261px;">Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF-M</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Model: DMI6000B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF objective</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;">11 506 249&#160;</td>
			<td style="width:261px;">HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">EM-CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Photometrics Cascade 512B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:248px;">Pecon</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Tempcontrol 37-2 digital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:248px;">NIH, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">u-track software</td>
			<td style="width:248px;">Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Matlab software</td>
			<td style="width:248px;">The MathWorks, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution spatiotemporal analysis of receptor dynamics by single-molecule fluorescence microscopy

Einzelmolekül-Mikroskopie ist als ein leistungsfähiges Konzept, um das Verhalten von Signalmolekülen, insbesondere in Bezug auf jene Aspekte (zB., Kinetik, Koexistenz der verschiedenen Staaten und Bevölkerungen, transiente Wechselwirkungen), die in der Regel in Ensemblemessungen versteckt sind, wie die sich abzeichnen die mit biochemischen Standard oder Mikroskopieverfahren erhalten. So, dynamische Ereignisse, wie Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen, kann in Echtzeit in einem lebenden Zelle mit hoher raum-zeitlichen Auflösung verfolgt werden. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die auf der Markierung mit kleinen und hellen organischen Fluorophore und totale interne Reflexion (TIRF) Mikroskopie einzelner Rezeptoren auf der Oberfläche von lebenden Zellen direkt sichtbar zu machen. Dieser Ansatz erlaubt es, genau zu lokalisieren Rezeptoren, messen Sie die Größe der Rezeptor-Komplexe, und erfassen dynamische Vorgänge, wie transient receptor-Rezeptor-Wechselwirkungen. Das Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung, wie perform eine Einzelmolekül-Experiments, einschließlich Probenvorbereitung, Bildaufnahme und Bildanalyse. Als ein Beispiel der Anwendung dieses Verfahrens auf zwei G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu analysieren, dh., Β 2-adrenergen und γ-Aminobuttersäure Typ B (GABA)-Rezeptor berichtet. Das Protokoll kann auch für andere Membranproteine ​​und verschiedene Zellmodelle, Transfektionsmethoden und Markierungsstrategien anpassen.

Das beschriebene Protokoll kann auf eine Vielzahl unterschiedlicher Membranproteine ​​verwendet werden. Als Beispiel sind mit β 2-adrenergen Rezeptoren und GABA B erhaltenen Ergebnisse repräsentativ 10 gemeldet. Seit fluoreszierenden Signale von einzelnen Molekülen schwach sind, ist die Minimierung der Hintergrundfluoreszenz der erste entscheidende Schritt zur erfolgreichen Ergebnissen. Daher ist es wichtig, intensiv gereinigt Deckgläser (2A) verwenden sowie Prob...

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy at JoVE.com

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

high-resolution-spatiotemporal-analysis-receptor-dynamics-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K Aufrufe.  University of Würzburg, Germany. This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins. 

Serie: High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Forschung

Biotechnik

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Engineering-"Golden" Fluoreszenz durch Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren und Protein-Analyse durch Massenspektrometrie und Fluoreszenz

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...