This work is supported in part by NIH-P41 P41-RRO3155 and NIH P50-GM076516 (grant to EG), and Fondazione Monte dei Paschi di Siena (grant to FB).

Calibración 1. Sistema <ol><li> Spread Function Point (PSF) de calibración <ol><li> Diluir 10 l de 30 nm solución de bolas fluorescentes (aproximadamente 5 mM) en 90 l de agua destilada y luego someter a ultrasonidos la solución durante 20 min. Cortar un cuadrado (1 cm x 1 cm) pieza de gel de agarosa (3%) y depósito de 10 l de la solución en la parte superior del gel. Volcar la pieza de gel en el cristal de fondo de un plato Petri 2 cm y exprimir la caída en el cristal. </li><li> A su vez en la configuración de la adquisición, se coloca la muestra en el soporte, ajuste la exposición de la cámara y EMgain (100 ms y 1000 son buenos parámetros pero optimizan según el sistema) y esperar a que la cámara se enfríe. </li><li> Ajuste la exposición de la cámara a 100 ms, cámara EMgain a 1000, el modo de adquisición al fotograma de transferencia, 100 repeticiones y auto ajuste de ahorro. </li><li> Usando el ocular y enfoque la luz transmitida en la frontera del gel y luego mover el objetivo hacia el centro del gel, ajustar el enfoque y STAta el procedimiento de alineación láser (en LAS AF, seleccione &quot;Configuración TIRF &#39;y siga el procedimiento de alineación automática). </li><li> Encuentra un campo de visión con manchas individuales aisladas, precisa centrarse en el punto más brillante (que por lo general representa los granos agregado) como referencia, adquirir 100 cuadros y repita el paso 5-6 veces con el fin de adquirir varios puntos individuales. </li><li> Importar la serie adquirida a un programa de procesamiento de datos y un promedio de la pila en el tiempo (Figura 1A) y seleccionar un único glóbulo aislado. Tenga cuidado de seleccionar los más pequeños para evitar agregados de partículas. </li><li> Montar la distribución seleccionada intensidad (un ejemplo de perfil único cuentas se presenta en la Figura 1B) con una función de Gauss con el comando &quot;gaussfit&quot; (en las herramientas ICS-Matlab en los Materiales en Matlab). Verificar la bondad del ajuste mediante la inspección de los residuos obtenidos (un ejemplo de perfil gaussiano equipada con los residuos correspondientes i se presentan Figura 1B). </li></ol></li><li> Calibración de la cámara <ol><li> Encienda la cámara y espere a que la cámara se enfríe. AJUSTE adquisición de la cámara, (es decir, para la cámara utilizada fijamos la exposición a 0,5 ms, cámara EMgain a 1000, el modo de adquisición de modo recortada, el tamaño ROI de 32 x 128, 10.000 repeticiones) y comenzar la adquisición del fondo de la cámara señal. </li><li> Importación adquirió serie del marco de un programa de procesamiento de datos. Calcular e inspeccionar la intensidad media en cada píxel con el fin de verificar que el fondo de la cámara es aproximadamente plana en la región seleccionada del chip. En el modo recortada, retire la primera y las últimas líneas horizontales (3 a 10 dependiendo del tamaño de la ROI) para cada trama porque el fondo de cámara está normalmente sesgado en las líneas fronterizas. </li><li> Crear un histograma de los valores (también definido de nivel digital, DL) en imágenes adquiridas Stack (con el comando &#39;hist&#39; en Matlab) y trazar el logaritmode resultar frecuencia (con el comando semilogy en Matlab). Un ejemplo de la distribución de DL para el fondo de la cámara se presenta en la Figura 2. NOTA: Si la cámara está funcionando bien, el gráfico mostrará un pico de aproximadamente gaussiana (un perfil parabólico en el diario de escala) que representa la distribución de los valores asociados al fotón cero seguido de un decaimiento exponencial (una recta con pendiente negativa en el diario de escala ) que representa la distribución de los valores asociados a 1 de fotones (Figura 2). En particular, el centro y la varianza de la función gaussiana representan el desplazamiento de la cámara y de error, respectivamente, mientras que la constante de desintegración de la parte exponencial representa una estimación de la DL asignado por la cámara para cada fotón único. En Matlab utilizar la sección &quot;CalibrateCamera&quot; de la escritura en los materiales de apoyo. </li><li> Repita la operación para toda la cámara seleccionada EMGain y Ganancia. </li></ol></li></ol> 2. EtiquetadaPreparación de células <ol><li> Para preparar los liposomas requeridas para la incorporación de lípidos 36, se disuelven por separado 1 mg de DOPE (1,2-dioleoyl- sn-glicero-3 fosfoetanolamina), 1 mg de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano), y 1 mg de PPE-ATTO488 en 1 ml de cloroformo. Mezclar 0,5 ml de solución de DOPE, 0,5 ml de solución de DOTAP, y 25 l de solución de PPE-ATTO488 y secar a vacío durante 24 horas. Añadir 0,5 ml de tampón HEPES 20 mM, vórtice durante 15 minutos y se somete a ultrasonidos durante 15 min a 40 ° C. </li><li> Para preparar la celda, lavar 3 veces con PBS un plato p100 de confluente CHO-K1 (ovario de hámster chino), añadir 1 ml de tripsina y almacenar en incubadora durante 5 min. Suspender células desprendidas adición de 9 ml de medio DMEM / F12 suplementado con 10% de FBS y SEED 150 l de solución de células en una placa de Petri que contiene 800 l del mismo medio. </li><li> Almacenar en incubadora durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Para la incorporación de lípidos, reemplace medio celular con 500l de medio libre de suero; después de 30 minutos, añadir 2 l de solución de liposomas; después de 15 minutos de lavado con PSB y añadir nuevo medio DMEM / F12 para imágenes. </li><li> Para la transfección, transfectar células según el protocolo Lipofectamine (las instrucciones del fabricante) utilizando el plásmido TfR-GFP y tienda de 24 horas en la incubadora antes de exponer. </li></ol> 3. Adquisición de Datos <ol><li> Preparación de instalación <ol><li> Con el fin de termostato el microscopio, 24 h antes del experimento encender la incubadora. </li><li> Con el fin de aplicar el tiempo de adquisición más rápido posible, el trabajo en el modo de sensor recortada (véase la introducción) y el uso de una primera cámara para obtener imágenes (cámara 1) y la segunda cámara para seleccionar la celda (cámara 2). Un esquema de la configuración de la instalación se presenta en la Figura complementario S1. Entonces, para alinear el turno dos cámaras en el microscopio y esperar a que las cámaras se enfríen. </li><li> Ubicado en ambas cámaras los parámetros para la imagen de luz transmitida (es decir, </em&gt;, 20 ms para el tiempo de exposición, 1 para EM Gain) y poner el microscopio en el modo Campo Claro. </li><li> Poner las muestras en el soporte y enfocar con el ocular, enviar la luz a la cámara 1 y empuje suavemente hacia las ranuras permitiendo que la luz sólo en el retorno de la inversión se utiliza para obtener imágenes de células (en este caso un ROI de 32 x 32 píxeles). </li><li> Mover una celda de la región seleccionada y enviar la luz a la cámara 2, a continuación, dibuje un retorno de la inversión en el software que controla la cámara 2 con el fin de tener una referencia. </li></ol></li><li> Imaging (Figura 3A) <ol><li> En primer lugar, alinear el láser TIRF acuerdo con el procedimiento de su configuración. En nuestra configuración, seleccione el &#39;setup TIRF&#39; e iniciar el procedimiento de alineación automática. Cuando está alineado el láser establecer 70 nm de profundidad de penetración (aproximadamente 70 °). </li><li> Establecer el tiempo de exposición a 70 ms y EMGain a 100 tanto en las cámaras 1 y 2; a continuación, seleccione una celda usando la cámara 1, a continuación, enviar la luz en la cámara 2 y enfocar con precisión la membrana celular. Ajuste la exposición mínima en caMera 2, 1000 EMGain, modo de sensor recortada, 10 5 repeticiones y autoguardado establecer como archivos FITS (Flexible Image Transport System, un formato que puede ser fácilmente administrado). </li><li> Iniciar la adquisición de grabar la serie de imágenes. Suelte la ganancia y el modo recortada para permitir la estabilización de temperatura antes de adquirir un nuevo celular, a continuación, repita los dos últimos pasos para la adquisición de 8-10 células. </li></ol></li></ol> 4. Cálculo del Mean Square Desplazamiento de imágenes (i MSD) NOTA: El siguiente protocolo se puede aplicar directamente a los datos en bruto. Al mismo tiempo, todo el protocolo es válido para adquisiciones de datos simulados tanto en Matlab y en SimFCS. El enlace a los tutoriales correspondientes se pueden encontrar en la sección &quot;Materiales&quot;. <ol><li> Cálculo por Matlab <ol><li> Importar la serie adquirida a Matlab usando la escritura ImportImageSeries. Calcular la intensidad media de cada imagen en el tiempo mediante el command significar en los primeros 2 dimensiones y el uso de parcela para ver el vector resultante. </li><li> Si más del 10% de photobleaching está presente, desechar la serie o eliminar la primera parte de ellos. Si es inferior, tratar de corregir el efecto sobre la función de correlación restando a cada imagen su intensidad media, como se muestra antes de 37. </li><li> Calcular el promedio de intensidad de cada píxel mediante el uso de media en la tercera dimensión y ver la imagen resultante. Se requiere una atención especial para evitar correlaciones de artefactos: NOTA. De hecho, como se muestra anteriormente para técnicas similares 38, los bordes de celda, así como de las vesículas de enfoque podría introducir una fuerte correlación. Si la inspección de la imagen promedio revela los bordes de celda o de vesículas de enfoque, tratar de excluir la región que participan de lo contrario descartar la adquisición. Para corregir el efecto de estas estructuras inmóviles restar la intensidad media temporal de cada píxel 39. </li><li> Calcular tél correlación espacio-temporal (G (ξ, χ, τ)) mediante el uso de la función CalculateSTICScorrfunc. Eliminar G (ξ, χ, 0) porque la correlación debido al ruido de un disparo en régimen de poca luz domina G (0,0,0); la correlación debido al domina el detector G (± 1,0,0), y el movimiento de las partículas durante el tiempo de exposición podría deformar G (ξ, χ, τ) para τ = 0 mediante el aumento de la cintura medido (este efecto desaparece para τ &gt; 0) 34. </li><li> Promedio de G (ξ, χ, τ&gt; 0) usando un tiempo de-bin logarítmica para reducir el ruido mediante el uso de la función &quot;LogBinStack&quot; en el material de apoyo y luego se ajusta el G resultante (ξ, χ, τ) usando la función &quot;gaussfit&quot; de las herramientas ICS-Matlab en los Materiales para recuperar el i MSD (la segunda columna de la matriz resultante). </li><li> Trazar la σ obtenido de la cintura (τ) 2 (i MSD) como una función del tiempo. Si los datos son demasiado ruidosos, tratar de aumentar el número de acqumarcos IRED, aumentan la potencia del láser, la media más G (ξ, χ, τ) juntos. </li></ol></li><li> Cálculo por SimFCS <ol><li> Abra los archivos adquiridos con ImageJ usando BIOFORMAT importador plugin y guardar serie adquirida como secuencia Tiff. </li><li> Abrir herramienta SimFCS y seleccione RICS y seleccione Archivo&gt; Importar imágenes múltiples (Figura suplementaria S2). </li><li> Seleccione Fit, introduzca los parámetros de adquisición correctos y cerrar la ventana de ajuste (Figura complementario S3). </li><li> Seleccione Pantalla&gt; Intensidad Media&gt; CH1 y verificar la presencia de photobleaching (que complementa la figura S4). </li><li> Si más del 10% de photobleaching está presente descarte la serie o si es posible la carga de nuevo la secuencia de imágenes de retirar la primera parte de la serie. </li><li> Si blanquear es inferior al 10% seleccione Herramientas&gt; i MSD&gt; Ajustar parámetros, reviso &#39;Uso de media móvil&#39;, situado en el panel de retorno de la inversión de la izquierda unúmero de marco para la atención de pagar de media móvil que el tiempo corresponsal es mayor que el tiempo de difusión característica (por partícula que se mueve a 1 m 2 s-1 un tiempo de 10 segundos es una buena media móvil) </li><li> Seleccione Herramientas&gt; IMSD&gt; Calcular i MSD (Figura S5) y en forma y exportar el i MSD del cojín de nota (Figura S6). </li></ol></li></ol> 5. Cálculo de la Ley de Difusión de la i MSD <ol><li> Montar los primeros puntos para extrapolar el intercepto (σ 0 2) (5 puntos suelen ser suficiente, pero más puntos se pueden instalar si muestran un comportamiento lineal) y comparar este valor con el PSF medido previamente 2. Si son comparables, se están siguiendo la dinámica de fluoróforos aisladas. Por el contrario, si σ 0 2 &gt;&gt; PSF 2 tratar de adquirir más rápido para asegurar quedinámica ocultos están presentes 34. </li><li> Calcular la difusividad aparente (app D) y el desplazamiento medio (R) utilizando las ecuaciones 3 y 4 (véase la introducción). </li><li> Parcela aplicación D como una función de R para obtener una ley de difusión comparable con lo que se mide con la variación lugar basado FCS 12 (Figura 3D). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Rastreo de partículas Individual (SPT) representa una de las estrategias más comunes para estudiar la dinámica molecular y tiene la gran ventaja de la medición de trayectorias de las partículas. Esto a su vez permite sondear el comportamiento de incluso pocas partículas marcadas en un sistema complejo. Sin embargo, para alcanzar esta ventaja SPT típicamente necesita una baja densidad de la sonda y etiquetas muy brillantes. Particularmente, para obtener alta resolución temporal (rango mu s) sonda inorgánico norm...

A partir del modelo original &quot;mosaico fluido&quot; de Singer y Nicolson, la imagen de la membrana plasmática celular se ha actualizado continuamente durante las últimas décadas con el fin de incluir el papel emergente de citoesqueleto y lípidos dominios 1,2. Las primeras observaciones fueron obtenidos por la recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) descubrimiento de que una fracción significativa de proteínas de la membrana es inmóvil 3-5. Estos estudios pioneros, aunque muy informativo, sufrieron de la relativamente pobre resolución en el espacio (micras) y el tiempo (segundos) de las configuraciones del FRAP. Además, al ser una medida promedio de conjunto, FRAP le falta en dar información sobre el comportamiento de una sola molécula. En este contexto, la posibilidad de etiquetar específicamente una única molécula con etiquetas muy brillantes (lo que permite el estudio del proceso de difusión de una molécula a la vez) ha sido muy exitosa. Particularmente, empujando elresolución en el tiempo del enfoque único de rastreo de partículas (SPT) de la escala de tiempo de microsegundos, Kusumi, et al. obtenido acceso a características desconocidas de la dinámica de lípidos y proteínas que contribuyeron en gran medida al reconocimiento del papel de esqueleto de la membrana actina basada en la fisiología de la membrana 6 , 7. Estos resultados generan la llamada el &quot;piquete y la valla&quot; modelo, en el que los lípidos y la proteína está regulada por la difusión esqueleto basado en actina. Sin embargo, con el fin de tener acceso a la enorme cantidad de información proporcionada por SPT muchos temas experimentales que abordar. En particular, el procedimiento de etiquetado se compone típicamente por muchos pasos como la producción, la purificación y la introducción de las especies marcadas en el sistema. Por otra parte, las grandes etiquetas, al igual que los puntos cuánticos o nanopartículas metálicas, a menudo se requieren para llegar a la escala de tiempo sub-milisegundo y la reticulación de las moléculas diana por la etiqueta no se podría evitar en muchos casos. Por último, muchas trayectoriastienen que ser registrado para adaptarse a criterios estadísticos y concomitantemente se requiere una baja densidad de la etiqueta para permitir el seguimiento. En comparación con SPT, espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), la superación de muchos de estos inconvenientes, representa un enfoque muy prometedor para estudiar la dinámica molecular. De hecho, FCS también funciona bien con etiquetas tenues y densas, lo que permite estudiar la dinámica de moléculas de proteínas etiquetadas fluorescentes en las células transfectadas transitoriamente. Además, permite alcanzar altas estadísticas en una cantidad limitada de tiempo. Por último, a pesar de la densidad de &quot;alta&quot; de etiquetas FCS proporciona información moléculas individuales. Gracias a todas estas propiedades, FCS representa un enfoque muy sencillo y se ha aplicado ampliamente para estudiar la dinámica de lípidos y proteínas tanto en membranas modelo y en las células vivas 8-10. Se han propuesto muchos enfoques diferentes para aumentar la capacidad de FCS para revelar los detalles de la difusión molecular. Por ejemplo, era shpropia que mediante la realización de FCS en áreas de observación de diferentes tamaños se puede definir una &quot;ley de difusión FCS&quot; características esclarecedoras ocultos de movimiento molecular 11,12. Además de ser variado en tamaño, la esfera de actividad también se duplicó 13, se trasladó en el espacio a lo largo de las líneas 14-20 o conjugados con cámaras rápidas 21,22. El uso de estos correlación &#39;espacio-temporal&#39; enfoques, parámetros biológicos relevantes de varios componentes de la membrana se designarán cuantitativamente por ambas membranas modelo y las biológicas reales, por tanto, una visión que dé en la membrana organización espacial. Sin embargo, en toda la FRAP y aplicaciones FCS descrito hasta ahora el tamaño de la esfera de actividad representa un límite de la resolución espacial que no puede ser superada. Varios métodos de imagen super-resolución se han desarrollado recientemente para eludir este límite. Algunos se basan en la precisión de localización, como la microscopía óptica reconstrucción estocástico (TORMENTA) &lt;sup&gt; 23,24, microscopía de localización de fotoactivación (Palm) 25, PALM fluorescencia (FPALM) 26, y de una sola partícula de seguimiento de palma (sptPALM) 27: la cantidad relativamente grande de fotones requeridas en cada instantánea, sin embargo, limita la resolución de tiempo de estos métodos a por lo menos varios milisegundos, lo cual dificulta su aplicabilidad en vivo. En contraste, una alternativa prometedora para formación de imágenes de súper resolución haber sido abierto por modular espacialmente la emisión de fluorescencia con los métodos de agotamiento de la emisión estimulada (STED o transiciones reversibles saturables ópticos de fluorescencia (RESOLFT)) 28,29. Estos enfoques se combinan la conformación del volumen de observación muy por debajo del límite de difracción con la posibilidad de usar microscopios de barrido rápido y sistemas de detección. En combinación con el análisis de fluctuación de fluorescencia, microscopía STED permitió a la sonda directamente la dinámica espacio-temporales a nanoescala de lípidos y proteins en las membranas celulares en vivo 30,31. Las mismas cantidades físicas de microscopia basado en STED se pueden obtener por una espectroscopia de correlación de imagen espacio-temporal método modificado (STICS 32,33) que es adecuado para el estudio de la dinámica de las proteínas etiquetadas con fluorescencia de membrana y / o lípidos en células vivas y por un microscopio comercial. El protocolo experimental que se presenta aquí está compuesto por dos pasos. La primera de ellas requiere una imagen rápida de la región de interés en la membrana. Entonces, la pila resultante de imágenes se utiliza para calcular las funciones de correlación promedio espacio-temporales. Mediante el ajuste de la serie de funciones de correlación, la &quot;ley de difusión &#39;molecular puede ser obtenida directamente de formación de imágenes en forma de una difusividad aparente (D app) - vs -Promedio trazado de desplazamiento. Esta parcela depende de manera crítica sobre el medio ambiente explorado por las moléculas y permite reconocer directamente los modos de difusión realesdel lípido / proteína de interés. En más detalles, como se indica anteriormente 34, la función de auto-correlación espacio-temporal de la serie de imagen adquirida depende fundamentalmente de la dinámica de las moléculas que se mueven en la serie de imágenes recogido (por favor, tenga en cuenta que el mismo razonamiento se puede aplicar en una adquisición de la línea donde se considera sólo una dimensión en el espacio). En particular, definimos la función de correlación como: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230" /> (1) donde <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50" /> representa la intensidad de fluorescencia medido en la posición x, y y en el tiempo t, <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8" /> y <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> representa la distancia en la x yY. respectivamente, <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> representa el intervalo de tiempo, y <img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20" /> representa la media. Esta función puede expresarse como: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230" /> (2) donde &#39;N&#39; representa el número medio de moléculas en el área de observación, <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10" /> representa la operación de convolución en el espacio, y <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50" /> representa la autocorrelación de la cintura instrumental. Este último puede interpretarse como una medida de cómo están distribuidos los fotones de un solo emisor en el espacio debido a la configuración óptica / grabación (el llamado Point Spread Function, PSF, genRally bien aproximada por una función de Gauss). Finalmente, <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50" /> representa la probabilidad de encontrar una partícula a una distancia <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10" /> y <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> después de un tiempo de retardo <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> . Si tenemos en cuenta una dinámica de difusión, en el que las partículas se mueven al azar en todas las direcciones y los flujos netos no están presentes, esta función también está bien aproximada por una función gaussiana donde la varianza puede ser identificado como el Mean Square Desplazamiento (MSD) de la partícula en movimiento . Por lo tanto, la cintura de la función de correlación (también referido como <img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30" /> ), Se puede definir como la suma de los trastornos musculoesqueléticos de partículas y la cintura instrumental y puede ser medida por un ajuste de GaussTing de la función de correlación para cada retardo de tiempo. La medida i MSD se puede utilizar para calcular una aparente difusividad de las moléculas que se mueven <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40" /> y un desplazamiento medio <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40" /> como: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170" /> (3) <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170" /> (4) Algunas consideraciones sobre la configuración experimental utilizado puede guiar al lector a través de las siguientes secciones. Con el fin de excitar selectivamente los fluoróforos en la membrana basal de las células que utilizaremos una iluminación reflexión interna total (TIR) ​​que viven, utilizando una fluorescencia TIR comercial (TIRF) microscopio (los detalles se pueden encontrar en la sección de materiales). Por otra parte, con el fin de recoger ªe fluorescencia vamos a utilizar un objetivo de gran aumento (100X NA 1,47, se requiere una alta apertura numérica para iluminación TIRF) y una cámara de EMCCD (tamaño físico del píxel en el chip 16 micras). Para llegar a un tamaño de píxel de 100 nm aplicamos una lente de aumento adicional de 1.6X. Como se discute más adelante, una resolución de tiempo por debajo de 1 mseg sería necesario para describir adecuadamente la dinámica de los lípidos de membrana rápido por debajo de 100 nm. Para llegar a esta resolución temporal que necesitamos para seleccionar una región de interés (ROI) más pequeño que todo el chip de la cámara (512 x 512). De esta manera, la cámara leer un número reducido de líneas de aumento de la resolución en el tiempo. Sin embargo, en este régimen de lectura de la hora marco estaría limitado por el tiempo requerido para cambiar los cargos de la exposición a la lectura del chip de la cámara y está normalmente en el orden de milisegundos para EMCCD 512 x 512 píxel. Para superar este límite, una tecnología emergente permite desplazar las líneas de retorno de la inversión sólo en lugar de todo el marco, won una reducción práctica efectiva del tamaño del chip expuesto (llamado Modo Sensor recortada en nuestra EMCCD). Para que esta configuración sea eficaz, el chip fuera de la ROI debe estar cubierto por un par de hendiduras montados en el camino óptico. Gracias a esta configuración una resolución de tiempo hasta 10 -4 segundo se puede lograr. Tenga en cuenta, sin embargo, que este enfoque puede combinarse con diversos montajes experimentales, como se explica en la sección de &quot;discusión&quot;. Demostración del método que se proporcionará en células vivas, usando tanto un marcado ATTO488 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3 fosfoetanolamina (ATTO488-PPE) y una variante de GFP marcado del receptor de transferrina (GFP TfR). En el caso de ATTO488-PPE este enfoque puede recuperar con éxito una aplicación casi constante D como una función del desplazamiento medio indica una difusión sobre todo libre, como se informó anteriormente 30,35. Por el contrario, TfR-GFP muestra una disminución D <sub&gt; aplicación como una función del desplazamiento promedio, lo que sugiere la difusión parcialmente confinado-6. Además, en el último caso, es posible cuantificar la constante de difusión local y el área promedio de confinamiento durante muchos micras en el plano de la membrana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1142">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:480px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">iXon Ultra 897</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td>DU-897U-CS0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Solis</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">CHO-K1</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO 488 labeled PPE</td>
			<td style="width:183px;">ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 488-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOPE</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOTAP</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-106&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">PBS</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SimFCS 3.0</td>
			<td style="width:183px;">Globals Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMI6000 with TIRF modulus</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">LAS AF</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:183px;">Lipofectamine</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Matlab</td>
			<td style="width:183px;">MathWork</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Imagej</td>
			<td style="width:183px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor</td>
			<td style="width:183px;">OriGene</td>
			<td>RG200980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Agar</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Chloroform</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">528730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SONICA Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>SOLTEC</td>
			<td style="width:119px;">ETH S3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:183px;">Willco</td>
			<td>GWSt-3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Bio-Format importer for Matlab</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">ICS-MatLab Tools</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by Matlab Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by SimFCS Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope

Es cada vez más evidente que la distribución espacial y el movimiento de los componentes de la membrana, como lípidos y proteínas son factores clave en la regulación de muchas funciones celulares. Sin embargo, debido a la dinámica rápida y las diminutas estructuras involucradas, se requiere una resolución espacio-temporal muy alta para capturar el comportamiento real de las moléculas. Aquí presentamos el protocolo experimental para el estudio de la dinámica de las proteínas y los lípidos del plasma membrana fluorescencia marcado en células vivas con alta resolución espacial y temporal. En particular, este enfoque no es necesario realizar un seguimiento de cada molécula, pero calcula comportamiento de la población utilizando todas las moléculas en una región dada de la membrana. El punto de partida es una imagen rápida de una determinada región de la membrana. Después, una función de autocorrelación espacio-temporal completa se calcula la correlación de imágenes adquiridas a aumentar los retardos de tiempo, por ejemplo cada 2, 3, n repeticiones. Es posible demostrar que el anchodel pico de los incrementos espaciales función de autocorrelación en el aumento de retardo de tiempo como una función del movimiento de las partículas debido a la difusión. Por lo tanto, encajando de la serie de funciones de autocorrelación permite extraer la proteína real significa desplazamiento cuadrático de formación de imágenes (IMSD), que aquí se presenta en forma de difusividad aparente vs desplazamiento medio. Esto produce una vista cuantitativo de la dinámica promedio de moléculas individuales con una precisión nanométrica. Mediante el uso de una variante de GFP-etiquetados del receptor de transferrina (TfR) y un ATTO488 el nombre 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3 fosfoetanolamina (PPE) es posible observar la regulación espaciotemporal de la difusión de proteínas y lípidos en regiones de membrana-micras de tamaño en el rango de tiempo-micro-para mili-segundos.

Con el fin de calibrar la cintura instrumental, la imagen de un solo cordón de nano-fluorescente puede ser medida como se describe en el Protocolo paso 1.1. Una imagen fluorescente típica de estas cuentas se presenta en la Figura 1. La instalación de distribución de intensidad mediante una función gaussiana 2D devuelve buenas residuos y permite la medición de la cintura instrumentales a 270 nm. Este valor está en buen acuerdo con el límite de difracción esperado estimado por la ecuación de Ray...

Watch this Scientific Journal Video about From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope at JoVE.com

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

from-fast-fluorescence-imaging-to-molecular-diffusion-law-on-live

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K vistas.  Scuola Normale Superiore. Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Video: From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Imágenes de fluorescencia vida de rotores moleculares en las células vivas

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Investigación

Bioingeniería

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Células vivas imágenes de la migración de las células que expresan proteínas de fluorescencia etiquetado en una matriz tridimensional

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Una técnica de microfluidos investigará Deformabilidad Cell

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

La recuperación de fluorescencia después de combinar una gotita de medir la difusión de dos dimensiones de un fosfolípido monocapa

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

La eliminación selectiva de células de Cultura mezclada 3D mediante técnica de infrarrojo cercano Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.