Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microscopía óptica, como cómo tomar imágenes de superconorción, así como imágenes FRET utilizando el mismo microscopio. La principal ventaja de esta técnica es que podríamos combinar tres módulos de imagen diferentes en un microscopio, reduciendo significativamente el costo total. La demostración visual de este método es crítica, ya que el ensamblaje de la ruta de excitación es difícil de aprender.
Requieren una elección adecuada de piezas y alineaciones ópticas sensibles. Para comenzar, instale una tarjeta de adquisición de datos a través de una interfaz PCI y utiliérsela para conectar los láseres al ordenador. Controle los comportamientos de encendido y apagado de los láseres mediante la salida lógica transistor-transistor y su ajuste de potencia mediante la salida analógica de esta tarjeta.
A continuación, prepare una tabla óptica aislada por vibración con espejos y divisores de haz como se muestra aquí y se describe en el protocolo de texto adjunto. Combine los rayos láser en una fibra óptica monomodo montando primero una placa adaptadora de fibra en un soporte de traducción del eje z. A continuación, monte una lente doblet acromática en una placa de jaula.
Utilice una barra de extensión para conectar el adaptador y la lente para formar una jaula. A continuación, utilice postes ópticos de una pulgada de espesor para montar la jaula en la mesa óptica. Alinee el láser de 647 nanómetros ajustando los componentes para obtener la máxima potencia láser a través de la fibra.
Una vez realizada la alineación del primer láser, instale temporalmente un par de iris y alinee el resto de los láseres uno por uno. Compruebe la eficiencia de alineación de cada láser con un medidor de potencia. Asegúrese de dejar un iris delante de la placa adaptadora para reducir los reflejos de los láseres.
A continuación, diseñe e instale la lente de ampliación como se describe en el protocolo de texto adjunto. Para crear el efecto de astigmatismo necesario para extraer las coordenadas z de cada molécula, coloque una lente 3D con una distancia focal de 10 metros en el cassette e insértela en la trayectoria del haz de emisión. Para minimizar las vibraciones durante la imagen de epifluorescencia multicolor secuencial, utilice filtros de emisión colocados en una rueda de filtro de barrera conectada junto al microscopio.
Para la detección simultánea de multicolor durante experimentos de FRET de una sola molécula, coloque otro conjunto de filtros en un divisor de emisiones. Para configurar imágenes limitadas por difracción mediante epiexcitación, ajuste primero el ángulo incidental del láser de excitación al modo epi en el brazo de iluminación. A continuación, desenganche la lente 3D e inserte el cubo de derivación en el divisor de emisión.
A continuación, inserte la lente mag para ampliar la iluminación. Una vez configurado, tome imágenes multicanal, z-stack y/o time lapsed de la muestra en función de los resultados deseados. Para configurar la detección multicolor de una sola molécula de moléculas inmovilizadas en superficie, mueva primero la rueda del filtro a una posición vacía.
Esto permitirá que los láseres pasen a través. A continuación, ajuste el ángulo incidental de los láseres de excitación al ángulo del césped y desactive las lentes mag y 3D. A continuación, active el modo de tres canales en el divisor de emisiones reemplazando primero el cubo de derivación con un cubo de calibración que permita que toda la luz pase a través de todos los canales.
A continuación, encienda la cámara bajo DIC y ajuste la apertura del divisor de emisiones hasta que aparezcan tres canales completamente separados en la pantalla. Gire los mandos de control de ajuste vertical-horizontal en el divisor de emisiones y alinee aproximadamente los tres canales. A continuación, apague la cámara y reemplace el cubo de calibración por el cubo triple.
Coloque una muestra de perlas multicanal de 100 nanómetros. Tras la excitación a 488 nanómetros, las perlas multicanal de 100 nanómetros emiten diferentes longitudes de onda de luz, lo que permite la alineación de tres canales. A continuación, encienda la cámara y el láser de 488 nanómetros, haga zoom en una de las cuentas brillantes y, finalmente, alinee los tres canales girando de nuevo las perillas de control de ajuste.
Con la muestra ahora en su lugar, utilizando un láser débil, navegue a un área con una densidad de punto razonable y ajuste la potencia del láser y el tiempo de exposición para lograr niveles aceptables de señal a ruido y fotoblancha. A continuación, utilice el software de imágenes para tomar imágenes de lapso de tiempo. Para obtener imágenes de superresoridad, comience insertando la lente 3D y retire la lente mag.
A continuación, determine el ángulo incidental del láser de excitación óptima para que sea el ángulo de césped. Para encontrar la altura objetivo adecuada para la toma de imágenes SR, utilice imágenes DIC para encontrar el plano medio de las células. Identifique el plano por la altura a la que las celdas se vuelven transparentes.
Una vez determinado el plano focal deseado, comience la imagen de superconorción. Durante la toma de imágenes, cambie la potencia del láser de 405 nanómetros para mantener una densidad razonable de puntos parpadeantes. Comience a tomar imágenes sin potencia láser violeta.
Cuente el número de puntos parpadeantes en un período determinado y aumente la potencia del láser violeta para que el número de puntos parpadeantes se mantenga por encima de un umbral de recuento definido por el usuario en el campo de visión. Analice los datos detectando los centroides de cada punto en los fotogramas de imagen y extraiga los valores z para cada punto de anchos X e Y. Cree una imagen reconstruida y visualice objetos en 3D.
Esta configuración del microscopio permite un cambio flexible y reproducible entre diferentes métodos de imagen, incluyendo imágenes epifluorescentes convencionales, imágenes de superconorción basadas en la detección de una sola molécula y detección multicolor de una sola molécula. Con el fin de revelar detalles más finos en el ensamblaje molecular, la microscopía de superresor resolución combina miles de imágenes como esta. Estas imágenes se reconstruyen para generar una imagen de super resolución final.
Las técnicas de superror resolución permiten una alta resolución espacial, proporcionando detalles que no se pueden ver con otras técnicas. Esto se resalta en las dos imágenes que se muestran aquí. La imagen de super resolución muestra la misma RNase reguladora bacteriana que la imagen de epifluorescencia, pero permite la detección de moléculas únicas.
SmFRET es otro método capaz de angstrom a la resolución del nanómetro. Aquí, las moléculas de ARN dobladas fueron etiquetadas con un tinte de donante verde y un tinte de aceptador rojo. Las trayectorias de intensidad de fluorescencia se pueden extraer de moléculas individuales, generando eficiencia FRET en función del tiempo.
No olvide que trabajar con láseres puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar protección para los ojos o reducir las potencias del láser donde se realiza este procedimiento.
