This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.

NOTA: Los siguientes procedimientos están en conformidad con las directrices aprobadas por el Consejo Canadiense de los Animales. Se hacen todos los esfuerzos para minimizar el dolor y el sufrimiento de los animales durante los procedimientos. 1. Revestimiento de Filtros NOTA: Cuando insertos de filtro de cultivo se colocan en pocillos de placas de múltiples pocillos, dos compartimentos se definen: el compartimento superior es la región por encima de la pieza de inserción y el compartimento inferior es el uno debajo del inserto de la Figura 1A.ab. Los explantes se sembraron en el compartimento superior donde se unen a la parte superior del filtro; muchos axones crecen a través del filtro y se extienden en el lado inferior del filtro, dentro de la parte inferior del compartimiento de la figura 1A.c. Los volúmenes de trabajo estándar (es decir, para la aplicación de la solución de recubrimiento, lavados, medios de cultivo, etc) son de 2 ml para el compartimiento inferior y 1 ml para el compartimiento superior y van a ser mencionada en el protocolo como &quot;; Volúmenes estándar &quot;. Añadir soluciones de partida con el compartimento inferior mediante la colocación de la punta de la pipeta en la brecha entre el inserto y el lado del pozo. Además, la inclinación de la inserción a un lado mientras que la dispensación de la solución para evitar las burbujas de ser atrapado en la parte inferior del filtro. <ol><li> Comience el recubrimiento de los filtros el día antes de chapado. Bajo el tejido campana de cultivo estéril, colocar 24 mm inserciones de filtro en una placa de 6 pocillos de recepción. Incubar insertos con poli-D-lisina en agua (1 mg / ml) durante 1 hora a TA usando volúmenes estándar: 2 ml en el compartimento inferior y 1 ml en la parte superior. </li><li> Aspirar poli-D-lisina y se lava una vez con agua. Aspirar el agua, cierre la tapa y deje los platos a secar en la campana de O / N. Durante la aspiración de líquidos, asegúrese de eliminar un remanente de líquido que queda atrapado directamente debajo del filtro. </li><li> A la mañana siguiente, diluir la laminina en agua (10 mg / ml), mezclar y caliente a 37 ° C. Incubar insertos con laminina 1 hr en cell incubadora a 37 ° C, utilizando volúmenes estándar. </li><li> Laminina Aspirar y añadir colágeno en agua (0,1 mg / ml) e incubar durante 1 hora a TA. En este caso, utilizar 2 ml para el compartimiento inferior y 2 ml para el compartimento superior. </li><li> Colágeno Aspirar y lavar una vez con agua estéril. Los filtros están ahora listos para recibir medios de cultivo y explantes de DRG, como se describe en el PASO 3. </li></ol> 2. Dissecting Embryonic Ganglio de raíz dorsal (GRD) explantes <ol><li> Anestesiar a un ratón hembra embarazada de 13 días por una inyección IP de Avertin (250 mg / kg). Espere 10 a 15 minutos y compruebe si hay falta de reflejos de retirada de la córnea y de pedal. Una vez que los reflejos están ausentes, realice dislocación cervical. </li><li> Desinfectar todos los instrumentos quirúrgicos y abdomen de una mujer con etanol al 70%. Permitir que los instrumentos se sequen. Manteniendo la piel del abdomen y cortar a través de las capas de piel y músculo para exponer la cavidad abdominal. </li><li> Extirpar el útero separando del cuello del útero y los ovarios. En un esterilizadorle capó, la toma de embriones del útero con tijeras y recogerlas en una placa de Petri llena de medios L15 helada. Mantener en hielo. NOTA: Consulte los informes técnicos previos para más detalles sobre cómo obtener embriones de 13 días de gestación 17,18. </li><li> Bajo el microscopio, se encontraba el embrión en un lado y el uso de pequeñas tijeras de primavera para quitar de la cabeza. Hacer una incisión a lo largo de los lados laterales para descartar el pecho, el vientre, las extremidades y la cola. Mantenga la parte posterior que contiene la columna vertebral, sentar lado ventral hacia arriba y retire todos los órganos viscerales. </li><li> Con pequeñas tijeras de primavera, exponer toda la médula espinal mediante la reducción de la columna vertebral desde su lado ventral a lo largo de la línea media. Sujete la carcasa inferior con un par de pinzas (# 3) y el uso de un segundo par de celebrar la médula espinal por su aspecto más rostral. </li><li> Lenta y suavemente jale el cable alejado de la cavidad vertebral y evitar el paso de los GRD de la médula espinal utilizando fórceps ultrafinas (# 5). Grupo de los GRD que se recaude enla parte inferior del plato. </li><li> Recoger GRD agrupados por aspiración con una pipeta 200 l que ha sido cortado para ampliar su apertura. Coloca los GRD en un tubo y dejar en hielo hasta que se termine la colección DRG. NOTA: Se prefieren las blancas puntas / transparentes porque GRD no se adhieren a las paredes de este consejo (en comparación con las puntas amarillas estándar). Consejos de lavado con medios antes de su uso previene más GRD se adhiera a sus paredes. </li></ol> 3. Siembra y mantenimiento del Ganglio de raíz dorsal explantes de Filtros <ol><li> Añadir media DRG completa a 37 ° C a los insertos recubiertos utilizando volúmenes estándar. Complementar los medios compartimiento inferior con 15 ng / ml de NGF, mientras se mantiene el compartimento superior libre de NGF. NOTA: Si bien el NGF se difunde de manera eficiente a través del filtro y su concentración se equilibra dentro de horas, hemos observado que la aplicación de NGF al compartimiento inferior directamente antes de la siembra aumenta significativamente el rendimiento axonal en el BOttom superficie del filtro. </li><li> Transfiera los GRD del tubo a los filtros con una pipeta 1.000 l con una punta recortada para ampliar su apertura. </li><li> Dibujar recursos en la punta de 2 a 3 veces antes de la recogida de los GRD. Esto evita que se pegue a la cara interna de la punta. La misma punta puede ser re-utilizado para todos los pozos. El uso de puntas sin color (frente a puntas azules estándar) reduce la adherencia a la superficie DRG punta. </li><li> Para transferir los GRD, establezca la pipeta de 800 l. Aspirar aproximadamente 200 l de los medios de comunicación desde la parte superior del filtro, y luego ir al tubo que contiene DRG-y una pipeta un volumen pequeño de arriba a abajo - para volver a suspender los GRD que se han hundido hasta el fondo. Aspirar todo el volumen y GRD de pipeta sumergiendo la punta en el centro de la pieza de inserción. </li><li> Una vez que todas las partes movibles se cargan, cierre la tapa de la placa y agitar la placa de 10x, golpeándolo suavemente en el banco campana entre cada remolino. Estos movimientos aumentan el rendimiento axonal ayudando explantes de DRG fregadero yadjuntar al filtro. Esto también ayuda a distribuir uniformemente explantes de modo que los axones de diferentes explantes no se superponen. NOTA: El procedimiento de siembra explante se describe en los pasos anteriores aumenta significativamente la tasa global de unión explante al sustrato (hasta 75%). Más significativamente, el procedimiento de pipeteado evita fácilmente explantes de flotando en la superficie del medio en vez de hundirse hasta el fondo de la pieza de inserción. </li><li> Para los análisis bioquímicos, los GRD de semillas de un embrión (alrededor de 30) por filtro. Para los análisis morfológicos, utilice la mitad o un tercio de los GRD de un embrión (10-15). Esta decisión debe ser tomada antes de la recogida de los GRD en tubos, de modo que todos los GRD de un tubo se siembran en un único bien (ya sea 30, 15 o 10 GRD). </li><li> Mantener culturas en un incubador de células a 37 ° C, el cambio de los medios de comunicación cada 2-3 días. Para cambiar los medios de comunicación, aspirar el compartimento superior primero, seguido por el compartimento inferior. Añadir medio fresco en volumen estándars empezando por el compartimento inferior. NOTA: Para evitar que células / axones se seque, no cambie los medios de comunicación en más de 3 inserciones al mismo tiempo. GRD cultivadas en filtros en presencia de NGF se extenderán los axones largos, alcanzando hasta 2 mm después de 2 días en cultivo. </li></ol> 4. Factor trófico Tratamiento Retiro La retirada de NGF induce la degeneración axonal con la fragmentación axonal (determinado por contraste de fase y β-III-tubulina IF) que aparece por primera vez alrededor de 12 horas después de la retirada. Fragmentación completa se logra en un 36 hr. ¿Por cuánto tiempo se deja la degeneración de proceder para tiene que ser elegido por el usuario final de acuerdo con el diseño experimental. <ol><li> Después de la fase de extensión axonal 2-día, cambio de medio de compartimentos superior e inferior de los medios de comunicación que carece de NGF y contiene anticuerpos anti-NGF (1 mg / ml) para secuestrar cualquier NGF restante (o producido endógenamente). </li><li> Placas de retorno a la incubadora de células (37 ° C) para permitirNGF degeneración inducida por la retirada de proceder para la cantidad de tiempo deseada. </li><li> Proceder a la extracción de proteínas (paso 6) para su análisis por Western blot o examinar directamente los filtros de IF (paso 7). </li></ol> 5. Axonal transección para inducir walleriana Degeneración Este procedimiento deja los axones en el lado inferior del filtro separados de su cuerpo celular, pero por lo demás intacto. A partir de entonces, estos axones iniciar rápidamente la degeneración walleriana. Fragmentación axonal (evidenciado por contraste de fase o β-III-tubulina SI) aparece por primera vez por 3 horas después de la sección; por 9 horas, los axones son completamente fragmentada y se separan del filtro. ¿Por cuánto tiempo se deja la degeneración de proceder para tiene que ser elegido por el usuario final de acuerdo con el diseño experimental. <ol><li> Raspe el lado superior del filtro, que contiene los explantes de DRG cultivadas, con una célula-rascador. Asegurar la eliminación completa del material superior por raspador se mueve en X-, Y-y circularlas direcciones. </li><li> Deseche los medios de comunicación desde el compartimiento superior que contiene los explantes flotantes que han sido tomadas por raspado del filtro y reemplazar con 1 ml de medio DRG pre-calentado, completo que contiene NGF (10 ng / ml). </li><li> Placa de retorno a la celda incubadora (37 ° C) para permitir la degeneración walleriana de proceder para la cantidad de tiempo seleccionado por el usuario final. </li><li> Proceder a la extracción de proteínas (paso 6) para su análisis por Western blot o examinar directamente los filtros de IF (paso 7). </li></ol> 6. Extracción de proteínas de muestras axonales <ol><li> Llenar los tubos de recogida (1,5 ml) con 75 l de tampón de muestra Laemmli. Mantener los tubos en hielo durante la cosecha axones de todo el conjunto de filtros. </li><li> Lavar el filtro con explantes de DRG en PBS y raspar el lado superior del filtro. Extraiga la tapa de la placa, limpiar la parte superior del filtro con un aplicador de punta de algodón y aspire cualquier PBS extra de los lados superior e inferior. </li><li> Coloque inserción al revéssobre un banco y corte el filtro de la inserción utilizando un bisturí afilado. Mantenga el filtro con pinzas, de abajo hacia arriba. Haga un corte desde la circunferencia al centro del filtro con unas tijeras. </li><li> Coloque el filtro en la parte superior del tubo de recogida, y con unas pinzas, pulse el centro del filtro por el tubo. Mientras hace esto, debe formar un embudo. Empuje el filtro en forma de embudo para la parte inferior del tubo de modo que se sumerge en el tampón de muestra de Laemmli. </li><li> Extracción de la proteína completa por ebullición los tubos durante 4 min. Retirar el filtro utilizando pinzas para colocar boca abajo en la parte superior del tubo y la realización de un breve centrifugado (2000 xg durante 15 seg). Deseche los filtros secos. </li><li> Resolver 10 l de la preparación de proteína axonal en un SDS-PAGE seguida de Western blot para detectar las proteínas de interés. NOTA: Como referencia, una preparación axonal de 20 explantes cultivados durante 2 días y se lisaron en 100 l de tampón de lisis RIPA tendrá una concentración de proteína de 4-6g / l. </li></ol> 7. Examen de inmunofluorescencia de los axones en los filtros Los pasos siguientes describen las manipulaciones generales para llevar a cabo si la tinción de elementos filtrantes, ejemplificadas por la detección de β-III-tubulina. Fijador, tiempos de incubación, las concentraciones y los demás datos deben ser optimizados para otros pares de antígeno-anticuerpo. <ol><li> Utilizar placas de 6 pocillos utilizados anteriormente, limpiar a fondo, para los siguientes lavados e incubaciones de los insertos. </li><li> Lavar brevemente insertos en PBS. Fijarlos en recién preparada de paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min a TA en un agitador. </li><li> Después de la fijación, raspar y limpiar el lado superior de la pieza de inserción para recoger los axones que crecieron exclusivamente en la superficie inferior del filtro. Proceda con incubaciones estándar para IF. </li><li> Incubar insertos en solución de bloqueo (TBS, 0,05% de Tween 20, leche descremada 5%), el uso de volúmenes estándar, durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Transferencia inserta al anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo (anti-β-III-tubulina, 1:5.000), usando volúmenes estándar. Incubar O / N (~ 18 h) a 4 ° C con agitación suave. </li><li> Lavar el primer anticuerpo dos veces en PBS (2 X 10 min a TA). </li><li> Transferencia inserta a anticuerpos secundarios fluorescentes conjugado diluido en tampón de bloqueo (cabra anti-ratón, 1:2000), usando volúmenes estándar. Incubar protegido de la luz durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Lavar el 3x anticuerpo secundario en PBS (3 x 10 min a TA). </li><li> Después de IF es completa, tome Salida de inserción, vaciar PBS desde el último lavado y limpie la parte superior del filtro con un aplicador de punta de algodón. Aspirar el líquido de los lados superior e inferior. </li><li> Lugar inserte al revés en el banco, y cortó el filtro del inserto con un bisturí afilado. </li><li> Mantenga el filtro con una pinza, la baja, y colocarla sobre el portaobjetos de microscopía. Overlay con un cubreobjetos y mou compatible fluorescentemedios nting. Deje secar extendido en cuarto frío, protegido de la luz. Examinar y capturar imágenes con un microscopio fluorescente. NOTA: Cuando se almacena a 4 ° C y protegido de la luz, estas preparaciones se pueden mantener durante semanas con una mínima pérdida de fluorescencia. </li><li> OPCIONAL: Como alternativa, si se puede realizar en los filtros que se han eliminado de la inserción. Para hacer eso, raspar y limpiar la parte superior de los filtros directamente después de la fijación. <ol><li> Tome filtros de los insertos con un bisturí y colocar filtros en punto axones-up en la parte inferior de una placa de seis pocillos. </li><li> Después, realizar incubaciones de SI como se indica en 7.4 a 7.8 y 7.11. La ventaja de esta alternativa es que ahorra reactivos, ya que, por ejemplo, volúmenes de incubación puede bajar a 500 l (en comparación con los 3 ml utilizados cuando los filtros se tiñeron directamente en los insertos como se muestra en 7.1 a 7.11). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Los parámetros más importantes a tener en cuenta para la adaptación de esta técnica incluyen la población neuronal que será estudiado, el sustrato, el tamaño de poro del filtro y superficie. Todos estos parámetros tendrán un impacto en la especificidad, la calidad y cantidad de la preparación de las neuritas obtenido, y deben ser cuidadosamente considerados por el usuario final. En los ejemplos presentados en este protocolo, el uso de las neuronas DRG tiene la ventaja de que se extiende sólo los axones, dando...

El compartimiento axonal de las neuronas muestran un alto grado de independencia funcional del compartimiento somato-dendrítica. En las neuronas de proyección, los axones contienen la mayor parte de la proteína de 1,2 neuronal. El estudio de la fisiología y la patofisiología de los axones ha cobrado fuerza en la comunidad de las neurociencias porque los estudios recientes han demostrado que la disfunción axonal temprana parece ser una característica común de las enfermedades neurodegenerativas y trastornos neuropsiquiátricos 3. Parece probable que una mejor comprensión de los mecanismos-axonales exclusiva en condiciones normales y patológicas arrojará luz sobre los primeros eventos que conducen a la disfunción. El presente protocolo describe cómo utilizar insertos de cultivo que lleva una membrana porosa (filtro) para obtener grandes cantidades de material axonal pura que es adecuado para la bioquímica y análisis inmunocitoquímico. El uso de filtro inserta estudiar biología axonal fue implementado por primera vez por Steward y4 colegas y seguirá trabajando Twiss y sus colegas 5 a su configuración actual. La técnica está ahora en uso actual por grupos que estudian diversos aspectos de la biología axonal y dendrita, con ligeras modificaciones en cada caso para adaptarse a la población de neuronas estudiados, los tratamientos realizados y el tipo de análisis bioquímicos utilizados 6-9. El presente protocolo no tiene intención de dar cabida a todas las alternativas para una variedad de aplicaciones tales, sino más bien proporcionar un enfoque simple que es adecuado para la mayoría de aplicaciones. En particular, el protocolo descrito aquí utiliza un revestimiento de triple que maximiza el rendimiento axonal para los análisis bioquímicos y es más adecuado para estudiar axonales revestimientos-degeneración otra descritos en la literatura producida menos axones que se retraen y degeneran más rápido cuando se le priva de factores tróficos 9. En este procedimiento, los cuerpos celulares neuronales permanecen aislados en la cima de las qu filtroaxones ile pasan a través de los poros y crecen a lo largo de su superficie inferior. Axones Pure (libres de células gliales y contaminantes del cuerpo celular neuronal) que crecen en la superficie inferior del filtro pueden ser recogidos para análisis bioquímicos o se pueden fijar in situ y se examinaron mediante técnicas inmunocitoquímicas 9. El procedimiento se basa en el uso de las neuronas sensoriales embrionarias a partir de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). GRD embrionarias son ampliamente utilizados para estudiar la biología axonal porque neuritas de estas células experimentan un crecimiento rápido y robusto in vitro cuando se mantiene en factor de crecimiento nervioso (NGF), y porque se someten a la degeneración rápidamente cuando se le priva de este factor. Además, las neuronas DRG carecen de dendritas, de manera que todas las neuritas recogidos por este método son puramente axones. Elementos filtrantes representan una gran ventaja en comparación con otros métodos utilizados para estudiar los axones. Estudios dependen de la utilización de la microscopía para diferenciar los procesos que ocurren en el soma celular de las de unXons proporcionan información bioquímica limitada. Como otro ejemplo, los sistemas de cultivo compartimentadas (por ejemplo, cámaras Campenot 10 o dispositivos de microfluidos 11) son útiles para los enfoques de formación de imágenes y para el tratamiento diferencial de los compartimentos de la célula, pero proporcionan sólo pequeñas cantidades de material axonal, lo que impide el uso de estas técnicas para los análisis bioquímicos que requieren cantidades relativamente grandes de muestra. Además, su uso requiere una formación importante, así como dispositivos especializados, y son mucho tiempo. Otro enfoque a menudo se utiliza para aislar los axones de explantes es quitar manualmente un centro de explante (que contiene los cuerpos celulares neuronales) antes de la recogida de muestras axonal. Aunque esto puede producir grandes cantidades de preparaciones del axón enriquecido, los axones en esta preparación pueden ser envueltos en glía y eliminar rápidamente los cuerpos 20 de explantes consecutivamente de 6 pozos (como un ejemplo de un experimento mínimo) es que consume tiempo y en el límite de la viabilidad. En contraste, el método presentado aquí produce preparaciones axonales abundantes y puros que se pueden analizar por prácticamente cualquier técnica bioquímica que se utiliza comúnmente para analizar lisados ​​de células enteras, como western blot, inmunoprecipitación 6, transferencia de Northern 5 espectrometría de masas 6, la purificación del ARN 7,12,13, entre otros. Además, el protocolo se puede aplicar a inmunofluorescencia (IF) técnicas, ya que es posible fijar los axones que crecen en el lado inferior del filtro de examinar más a ellos por SI. Este enfoque facilita en gran medida el análisis de los procesos axonales-específica ya que no hay cuerpos celulares en la preparación final. Esta es una ventaja significativa ya que una señal de alta inmunofluorescencia desde los cuerpos celulares a menudo socava examen y análisis de una señal más débil procedente de estructuras delgadas tales como los axones. Dos aplicaciones del método de cultivo para estudiar AR degeneración axonalE descrito; un modelo de la poda de desarrollo y un modelo de degeneración inducida por la lesión (comúnmente conocida como degeneración walleriana). El modelado de la poda de desarrollo se basa en el hecho de que las neuronas sensoriales in vivo compiten para limitar cantidades de NGF derivado de la diana y aquellos que no lo suficiente para recibir degenerada apoyo neurotrófico 14. Este fenómeno se puede imitar en cultivos de DRG embrionarias mediante la retirada de NGF del medio de cultivo, que, como sucede in vivo, inicia la degeneración axonal seguida de la destrucción cuerpo de la célula. Para modelar la degeneración walleriana, la parte superior del filtro con los cuerpos celulares se raspa. Los axones que habían crecido en el lado inferior del filtro se separan físicamente de los cuerpos celulares y se someten a partir de entonces el proceso degenerativo rápida y estereotipado conocida como degeneración walleriana 15, el nombre de A. Waller que informó por primera vez el fenómeno en 1850 16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">CD-1 mouse, E13 timed pregnancy</td>
			<td style="width:140px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:416px;">In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353102</td>
			<td>1 &#181;m pore size, fits 6-well receiving plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Companion Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353502</td>
			<td>Receiving plates for inserts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td style="width:416px;">Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 &#176;C and thaw overnight at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureCol Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>Can be replaced by DMEM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Serum-Free Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FDU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGF (2.5S, beta subunit)</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLMCNET-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="109" rowspan="2" style="height:109px;width:297px;">Anti-NGF Antibody</td>
			<td style="width:140px;">Prepared in-house</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:416px;">As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. &#38; Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">AN-240</td>
			<td>Commercial option</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Tubulin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRG culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:297px;">Neurobasal Medium 
			2 % B27 Neurobasal Supplement 
			2 mM l-Glutamine 
			1 % Penicillin-Streptomysin 
			10 &#181;M FDU 
			15 ng/ml NGF (bottom compartment only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Laemmli Sample Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:297px;">10 % SDS 
			0.5 M DTT 
			0.5 M Tris (pH 6.8) 
			5 % Glycerol 
			0.01 % (w/v) Bromophenol blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

Explantes de ganglios de la raíz dorsal de ratones E13.5 crecen extensamente sobre filtros secuencialmente recubiertos con poli-D-lisina, la laminina y el colágeno (Figura 1B, izquierda), que alcanzan hasta 2 mm dentro de 2 días en cultivo. Esta combinación de sustrato produce un crecimiento especialmente exuberante; otras combinaciones producen axones que son considerablemente más corto (Figura 1 B, derecha). Por otra parte, los GRD mantenidos en los filtros se extienden más y m?...

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Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Producción y aislamiento de los axones de las neuronas sensoriales para el análisis bioquímico Usando porosos Filtros

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

production-isolation-axons-from-sensory-neurons-for-biochemical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K vistas.  Montreal Neurological Institute, McGill University. This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration. 

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Investigación

Neurociencias

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Análisis morfológico de Drosophila Larvas dendritas neurona sensorial periférica y axones Con mosaicos genéticos

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Aislamiento y cultivo de neuronas sensoriales disociadas De embriones de pollo

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Eliminación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejido muscular de larvas Filetes para el análisis de inmunofluorescencia de las neuronas sensoriales y las células epidérmicas

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...