Agradecemos al Dr. Michael Wooten por su ayuda en la preparación del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el NIH 2RO1NS033661 (MWW).

1. Puesta en marcha antes de la cosecha <ol><li> Para generar crías prenatales para la cosecha de las neuronas, programar la reproducción entre los ratones adultos 19 días antes del día de aislamiento neurona. (Ratones C57BL / 6 años de edad de 2-8 meses se utilizaron en los apareamientos para los propósitos de desarrollo de este protocolo). El éxito de apareamiento puede ser confirmado por la detección de un tapón vaginal en la confirmación de las mujeres, palpitaciones o visual del embarazo. </li><li> El día antes de aislar las neuronas: <ol class="ualpha"><li> Para aplicaciones de inmunofluorescencia, cubreobjetos capa de vidrio en una placa de 24 pocillos con una ligera capa de 03:01 colágeno 1, Cola de Rata: poli-D-lisina solución. </li><li> Para aplicaciones de cultivo celular, capa de tejido apropiado tamaño de la cultura material de plástico con una capa ligera de 3:01 colágeno 1, Cola de Rata: poli-D-lisina solución. </li></ol></li><li> Resto de las placas descubiertas en una campana de cultivo de tejidos bajo una luz ultravioleta durante la noche. </li><li> Lavar las placas con solución de Hank estéril salina equilibrada de (HBSS) antespara su uso. Placas recubiertas se pueden llenar con HBSS y se almacena hasta una semana a 4 ° C en la oscuridad. </li></ol> 2. Tejido de cosecha <ol><li> La esterilidad es siempre un factor que cada vez más cultivos primarios de células y, como tal, el mayor se debe tener precaución para asegurar el ambiente más estéril posible. Con una cuidadosa atención a la técnica estéril, la disección inicial y la recolección de tejido neural para este protocolo se puede realizar fuera de una campana de flujo laminar con un riesgo mínimo de contaminación. Después de la cosecha inicial, todos los pasos siguientes deben realizarse bajo condiciones de máxima esterilidad dentro de una campana clasificado para el cultivo de células. </li><li> La eutanasia de un ratón embarazada en aproximadamente 19 días después de la fertilización por decapitación. El uso de anestesia para la eutanasia de la mujer embarazada no se recomienda como la anestesia se sabe que causa la muerte de las células cerebrales (Stratmann, et al., 2010). Usando unas tijeras de disección estéril y pinzas, crear una abertura en el lado medio ventral delratón para revelar completamente la cavidad del cuerpo. Los instrumentos se pueden esterilizar con alcohol y una llama abierta. </li><li> Cachorros prenatales se encuentra hacia la parte posterior de la cavidad del cuerpo del ratón, y deben ser fácilmente visibles en el útero. Con pinzas esterilizadas en autoclave, abrir el útero y extraer los cachorros. Decapitar a los cachorros con nuevas tijeras estériles y la cabeza en lugar de retirar una gasa estéril bajo un microscopio de disección. Instrumentos estériles, pueden ser tratados en autoclave llama limpiarse con alcohol y una llama abierta antes de y durante el uso. </li><li> Con unas tijeras estériles o cráneo bisturí, abierto de las crías de la parte posterior del cuello hasta la nariz. Este procedimiento normalmente se puede completar mediante la inserción de una punta de las tijeras en el agujero vertebral para luego proceder hacia delante. Retire con cuidado todo el cerebro con una pinza. Coloque el cerebro de una gasa estéril. Con un bisturí estéril, retire el cerebelo y la incisión por la línea media del cerebro para separar en dos hemisferios (Figura 1)<html> . </li><li> Tome una pequeña sección de las meninges que rodean al hipocampo con pinzas estériles y tire de ella suavemente. Aunque no es estrictamente necesario para eliminar las meninges antes de aislar el hipocampo, la presencia de las meninges puede hacer la disección del hipocampo más difícil debido a la tenacidad de la membrana. En cualquier caso, el hipocampo será más claramente visible después de las meninges se han eliminado. El hipocampo es una estructura curva que se inicia en la parte distal del hemisferio y se inclina ventral (Figura 2). A medida que el interior, el lado cóncavo, (caudal) se enfrenta a un ventrículo, ya es libre. Por lo tanto, para aislar el hipocampo, una necesita para cortar a lo largo del lado exterior convexo. Después de la disección, levante con cuidado cada uno de hipocampos con pinzas estériles y la transferencia de tejido en un plato pequeño con el cultivo de tejidos calientes (37 ° C) HBSS bajo una campana de cultivo celular. El tejido cerebral se pueden combinar de varias crías. </li></ol>&quot;&gt; 3. Tejido disociación <ol><li> Usando un escalpelo estéril tejido, suavemente pelos cerebro en 3 ml de HBSS estériles en un plato de cultivo de tejidos de 100 mm. </li><li> Transferir el tejido picada y HBSS a un tubo cónico de 15 ml. Añadir 1,5 ml de HBSS y 0,5 ml de solución de tripsina 0,25% hasta un volumen total de 5 ml. </li><li> Cap e invertir suavemente el tubo 4-5 veces para mezclar. Trata de evitar la producción de burbujas como ADN liberado del tejido digerido se adherirá a las burbujas y provocar que el tejido picado a flotar en lugar de depositarse en el fondo del tubo (Figura 3). </li><li> Incubar tejido del hipocampo a 37 ° C durante 15 minutos, invirtiendo el tubo como por encima de cada 5 minutos. </li><li> Permitir que el tejido se depositan en el fondo del tubo. </li><li> Retirar con cuidado el exceso de solución con una pipeta estéril, dejando inalteradas tejido en la parte inferior del tubo. </li><li> Lavar sedimento de tejido con 5 ml de HBSS a 37 ° C durante 5 minutos. Repetición de un total de 3 veces. Permitir que el tejido para resolver por completoa la parte inferior del tubo cada vez antes de proceder a la etapa de lavado siguiente. </li><li> Quitar el lavado final a partir del tejido de pellets y reemplazar con 2 ml de HBSS frescas. </li></ol> 4. Neurona trituración <ol><li> Antes de comenzar los pasos trituración, usted tendrá que preparar pipetas Pasteur pulida al fuego. El uso de un quemador Bunson, mantenga una estéril 9 pulgadas pipeta Pasteur punta (Figura 4a) en la llama hasta que el diámetro de la abertura pipeta es de aproximadamente 0,5 mm de tamaño y los bordes de la abertura pipeta se han redondeado ligeramente (Figura 4b). Permita que la pipeta se enfríe completamente antes de comenzar el proceso de trituración. </li><li> Usando una normal estéril 9 pulgadas pipeta Pasteur, se tritura suavemente el tejido un total de 7 veces. Los trozos más grandes de tejido son normales en este punto y se debe permitir que se depositan en el fondo del tubo antes de pasar al siguiente paso. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo cónico estéril 50 ml. </li><li&gt; Para el tejido restante, añadir 2 ml de HBSS estériles y triturar con un total de 5 veces con el fuego, pulido pipeta Pasteur. </li><li> Dejar que todos los restantes grandes piezas de tejido se depositen en el fondo del tubo y se combinan con el sobrenadante sobrenadante anterior para un total de 4 ml células neuronales disociadas. </li></ol> 5. Revestimiento de la célula <ol><li> Cuenta las células disociadas utilizando un hemocitómetro. </li><li> Como regla general, una vez que el número de células se han determinado, restar 20% de ese número final para dar cuenta de cualquier muerte celular que puede ocurrir después de placas. </li><li> Las células pueden ser cultivadas utilizando las siguientes recomendaciones: Para cubreobjetos en una placa y 24 - 6 x 10 4 células / pocillo en 0,5 ml Durante 60 placas de cultivo de tejidos mm - 4 x 10 5 células / placa en 3 ml Para placas de 100 mm de tejido Cultura - 6 x 10 6 células / placa en 6 ml </li><li> Mezcle un número adecuado de células con el volumen indicado de los medios de enchapado Neurobasal (NeurobasalMedios que contienen B27 Suplemento [1 ml / 50 ml], 0,5 mM de solución de glutamina, 25 mM glutamato (Sr. 147,13 g / mol), penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 g / ml) [250 l / 50 ml] , 1 mM de HEPES (Sr. 238,3 g / mol), Calor caballo al 10% de los donantes suero inactivado) y añadir las células a las placas. Placas de agitar suavemente para distribuir las células de manera uniforme. Cadena de Donantes de suero de caballo se añade a los medios de Revestimiento para enriquecer las células durante las primeras 24 horas de crecimiento. Las células son posteriormente retirados de el suero y devuelto a un medio ambiente libre de suero por la reducción de serie del suero en cada sustitución de los medios. También debe tenerse en cuenta que mientras que el glutamato a concentraciones más altas es tóxico para los cultivos de células neuronales, a las concentraciones más bajas añadido aquí, se inhibe la fijación de células no neuronales 11. Sin embargo, sólo hay que añadir a los medios de las planchas para las primeras 24 horas en la cultura y, posteriormente, quedar fuera de los medios de alimentación para prevenir la neurotoxicidad de las células. </li><li> Pencaje de las neuronas en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante la noche. </li><li> Quitar la mitad del volumen de los medios de las células y sustituir con el mismo volumen de medios de alimentación Neurobasal (Medios Neurobasal contiene B27 Suplemento [1 ml / 50 ml], 0,5 mM de glutamina de soluciones, penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 g / ml) [250 l / 50 ml], 1 mM de HEPES (Sr 238,3 g / mol). </li><li> Las neuronas deben ser alimentados cada 4 días mediante la eliminación de la mitad de los antiguos medios de comunicación y su sustitución por el mismo volumen de medios de alimentación fresca Neurobasal. Los procesos neuronales que empiezan a ser visibles en el Día 1 (Figura 5a) y llegado a ser frecuente a los 10 días (Figura 5b). </li></ol> 6. Los resultados representativos La capacidad de crecer y la cultura primaria de las células neuronales se ha convertido en una parte indispensable de la neurociencia. Los cultivos primarios permitirá a los investigadores para analizar las vías celulares específicas, modificación química y el tratamiento, el objetivo de loclización y patrones de crecimiento en un entorno controlado. Muchos de estos procedimientos utilizan sofisticada metodología para visualizar cambios específicos en las respuestas de células. En este caso, las neuronas del hipocampo se utilizan para estudiar las vías neuronales específicas que sería difícil, si no imposible de analizar en el cerebro intacto. Preparación de cerca de poblaciones homogéneas de las neuronas de áreas específicas del cerebro es fundamental para el estudio de la función cerebral. Efectos moleculares en las neuronas individuales puede ser un instrumento más en la delimitación de las vías de orden, como la memoria o el aprendizaje. Como este protocolo produce cultivos relativamente puras de las neuronas del hipocampo, sin la necesidad de una capa alimentadora de células gliales, estas neuronas son fácilmente utilizada para los estudios de inmunofluorescencia. Sin embargo, como con todos los cultivos primarios de los órganos que contienen múltiples tipos de células, alguna contaminación por las células menos deseados pueden ocurrir. En el aislamiento de las células neuronales, la contaminación por las células gliales puede ser un problema común. Las células gliales cun ser fácilmente detectado en visualización microscópica del cultivo como su morfología difiere significativamente de las neuronas diana (Figura 6). El impacto de la contaminación de células gliales dependerá del uso previsto de los cultivos. Si las células se están utilizando para el examen de inmunofluorescencia, la contaminación de la glía puede ser nada más que un inconveniente cuando se trata de fotografiar a las neuronas individuales. Sin embargo, si los cultivos neuronales se van a utilizar para el análisis bioquímico, cualquier contaminación significativa por las células gliales podría causar cambios importantes en los resultados. Formas de abordar la contaminación de las células gliales se describen más en la discusión. Una vez que las neuronas se han aislado con éxito y ha crecido en la cultura, una aplicación típica es el de examinar los procesos celulares de inmuno-fluorescencia técnicas. Como se ilustra en la Figura 7, orgánulos, tales como las mitocondrias, pueden ser teñidos utilizando colorantes vitales añadidos a los medios de cultivo antes de fijarción. Endógenas proteínas celulares pueden ser visualizados a partir de células fijas utilizando estándar inmuno-fluorescencia técnicas (Figura 8). Una vez que las células neuronales son fijos, los anticuerpos específicos para las proteínas de interés puede ser introducido en la célula y estas proteínas pueden ser visualizadas utilizando un microscopio de fluorescencia. Neuronas cultivadas también proporcionar al investigador con los medios para examinar los efectos individuales de proteínas en las funciones neuronales. Usando una variedad de técnicas, incluyendo las transfecciones de ADN, electroporación o transducción viral, las proteínas pueden ser sobreexpresada en las células neuronales (Figura 9). ¿Cómo las células nerviosas responden a los efectos de la sobre-expresó proteínas puede tener inferencias directas sobre cómo el cerebro puede responder y ofrece la posibilidad de identificar dianas celulares para el tratamiento con medicamentos. Los detalles de estos tipos de experimentos ir más allá del alcance de este documento pero ilustran que los cultivos preparados por esta técnica son adecuados para una amplia gama de abajo-stream aplicaciones. Sin embargo, la simplicidad general de este protocolo, así como, el corto período de tiempo necesario para preparar estos cultivos neuronales hacen de este un método ideal para su uso en laboratorio de neurociencia de hoy. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig1.jpg" /> Figura 1. La disección del cerebro del ratón prenatal. La primera incisión es abajo de la línea media del cerebro que lo separa en dos hemisferios. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig2.jpg" /> Figura 2. Ubicación del hipocampo en el cerebro del ratón prenatal. El cuerpo estriado se hizo a un lado para visualizar el hipocampo y se caracteriza por la curva de estructura de &quot;frijol&quot; tipo en la región distal de cada hemisferio. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig3.jpg" /> Figura 3. La disociación del tejido del hipocampo en solución de tripsina. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig4.jpg" /> Figura 4. Puntas de pipeta Pasteur utilizada en la trituración del tejido del hipocampo. (A) normal pipeta Pasteur de punta. (B) Pasteur pulida al fuego punta de la pipeta. Tome nota de los bordes redondeados y la disminución aproximada del 50% en el tamaño de la abertura pipeta. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig5.jpg" /> Figura 5. Neuronas del hipocampo aislado utilizando este procedimiento y se sembraron en la Nota Media. (A) Crecimiento de las células un día después de la siembra. Procesos neuronales empiezan a ser visibles durante el Día 1. (B) el crecimiento de la célula 10 días después de la siembra, neuritas se ramifican y se superponen. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig6.jpg" /> Figura 6. Las neuronas del hipocampo contaminadas con las células gliales cultivados durante 7 días y se tiñeron con el orgánulo marcador MitoTracker Red CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) y TaxisDirección Ejecutiva con GFP-LC3 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). Las mitocondrias son visibles en todas las células sin embargo, sólo una sola neurona se transfectadas con éxito con la construcción fluorescente. La contaminación con las células gliales hace que el análisis de GFP-LC3 expresión en los procesos neuronales difíciles de visualizar. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig7.jpg" /> Figura 7. Neuronas del hipocampo cultivadas durante 7 días y se tiñeron con el orgánulo marcador MitoTracker Red CM-H 2 Xros (Invitrogen # M7513). Este colorante vital se utiliza para teñir las mitocondrias activo en células de cultivo de tejidos. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% / PBS y se visualizó por microscopía de fluorescencia. El propio medio de contraste no es fluorescente hasta oxidados en la mitocondria. Activa las mitocondrias puede ser visto a través de los procesos neuronales. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig8.jpg" /> Figura 8. </strong&gt; neuronas del hipocampo cultivadas durante 7 días, se fijaron con paraformaldehído al 4% / PBS y la inmuno-teñidos con anticuerpo monoclonal anti-β tubulina (Sigma # T0198). Después de anticuerpo primario, Oregon Green etiquetados de cabra anti-ratón anticuerpo secundario (Invitrogen # O11033) se añadió y se visualizó por microscopía de fluorescencia. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig9.jpg" /> Figura 9. Neuronales del hipocampo culturas fueron cultivadas durante 5 días y transfectadas con GFP-LC3β construcción de ADN utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). En el día 7, las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% / PBS y aggresomes con LC3β GFP etiquetados incorporado en su membrana externa se visualizaron utilizando microscopía fluorescente. Aggresomes se encuentran en todo el cuerpo celular y neurites y se indican con flechas.

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No hay conflictos de interés declarado.

Cultivos de hipocampo se han utilizado en la biología molecular de más de 20 años. Aunque, en principio, cultivos neuronales se pueden hacer de cualquier parte del cerebro, cultivos de hipocampo han demostrado ser el más popular debido a la arquitectura relativamente simple de la población de células nerviosas en el hipocampo 7. Cultivos de hipocampo son típicamente hechos de la última etapa del tejido embrionario. Este tejido es más fácil para disociar y contiene menos células gliales que funciona...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Rata colágeno de cola 1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina Solución </td><td> Chemicon </td><td> Una-003-E </td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hanks </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-095 </td></tr><tr><td> Solución de tripsina (1X) 0,25%, líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> Medio Neurobasal (1X) líquida </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B27 Suplemento (50X) de líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> L-glutamina 200 mM (100X) líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-149 </td></tr><tr><td> La penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 g / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-148 </td></tr><tr><td> HI-Donante de suero de caballo </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S12150H </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice

Los cultivos primarios de rata y las neuronas del hipocampo de ratón se utilizan ampliamente para revelar los mecanismos celulares en neurobiología. Al aislar y cultivar las neuronas individuales, los investigadores son capaces de analizar las propiedades relacionadas con el tráfico celular, estructura celular y la localización de la proteína individual, utilizando una variedad de técnicas bioquímicas. Los resultados de estos experimentos son críticos para probar las teorías que abordan las bases neurales de la memoria y el aprendizaje. Sin embargo, los resultados inequívocos de estas formas de experimentos se basan en la capacidad de crecer cultivos neuronales con mínima contaminación por otros tipos de células cerebrales. En este protocolo, el uso de los medios de comunicación específicos diseñados para el crecimiento de neuronas y la cuidadosa disección de tejido del hipocampo embrionario para optimizar el crecimiento de las neuronas sanas y reducir al mínimo los tipos de células contaminantes (es decir, los astrocitos). Embrionario tejido del hipocampo de ratón puede ser más difícil de aislar de tejido roedor similar debido al tamaño de la muestra para dissection. Se muestran las técnicas de disección detallada de hipocampo de embriones crías de ratón del día 19 (E19). Una vez que el tejido del hipocampo es aislado, la disociación suave de las células neuronales se logra con una concentración diluida de la tripsina y la disrupción mecánica diseñado para separar las células de tejido conectivo mientras que proporciona el mínimo daño a las células individuales. Una descripción detallada de cómo preparar pipetas para ser utilizado en la interrupción está incluido. Densidades óptimas de planchas se proporcionan para los inmuno-fluorescencia protocolos para maximizar el cultivo de células de éxito. El protocolo proporciona una técnica rápida (aproximadamente 2 horas) y eficiente para el cultivo de células neuronales a partir de tejido del hipocampo del ratón.

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Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Proporcionamos un protocolo para el cultivo de las neuronas del hipocampo altamente purificada de cerebros de ratones prenatales sin el uso de una capa alimentadora de células gliales.

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

69.8K vistas.  Auburn University. Proporcionamos un protocolo para el cultivo de las neuronas del hipocampo altamente purificada de cerebros de ratones prenatales sin el uso de una capa alimentadora de células gliales.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato de Calcio La transfección de Primaria neuronas del hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Aislamiento y cultivo de neuronas sensoriales disociadas De embriones de pollo

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

Aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de Islmnprenatal :GFP Ratones transgénicos

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.

Aislamiento y cultura de las neuronas primarias y Glia de la vejiga urinaria de rata adulta

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

Minimizar la hipoxia en las rebanadas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

Aislamiento y cultura de chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...