Name: isolation of murine lymph node stromal cells
Uploaded: 2014-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells at JoVE.com

The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.

En esta publicación de vídeo y el protocolo, se llevaron a cabo todos los procedimientos con animales de acuerdo con el protocolo de los animales aprobado por la Autoridad Cantonal Basel-Stadt, Suiza. 1. linfa Preparación de nodos y digestión <ol><li> Agua Pre-calor en un vaso de precipitados a 37 ° C en un agitador magnético con placa de calentamiento. </li><li> Preparar Básica Media de la siguiente manera: medio DMEM (sin piruvato) suplementado con FCS al 2%, 1,2 mM CaCl 2 y Pen / Strep (100 unidades de penicilina, 100 mg de estreptomicina). </li><li> Esterilice todos los instrumentos de disección antes de su uso. </li><li> La eutanasia a los ratones donantes nodo linfático por asfixia con CO2 y asépticamente diseccionar los ganglios linfáticos. No diseccionar la grasa circundante. NOTA: Este protocolo está optimizado para el nodo periférico-el drenaje linfático de la piel (inguinal, braquial, axilar). </li><li> Coloque los ganglios linfáticos en una placa de Petri estéril que contiene 2 ml de hielo frío medio básico. </li><li> Interrumpir el ca ganglio linfáticopsule usando dos agujas 25 G fijos en 1 ml jeringa. </li><li> Transferir el tejido del ganglio linfático alterado en un tubo de fondo redondo de 5 ml de polipropileno que contiene 750 l medio básico suplementado con 1 mg / ml de colagenasa IV y 40 mg / ml de DNAsa I. </li><li> Añadir un agitador magnético estéril en cada tubo. </li><li> Colocar el tubo en el vaso de precipitados con 37 ° C precalienta el agua y agitar los tubos a una velocidad lenta (1 ronda / seg) durante 30 min. </li><li> Retire el tubo del agitador magnético con placa calefactora y dejar fragmentos de ganglios linfáticos se asientan. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante enriquecido en &quot;células no estromal&quot;. NOTA: Si el análisis de T, B, células dendríticas y CD45 - GP38 - CD31 - se prevé, guarde el &quot;no-células estromales&quot; fracción. </li><li> Lave restante tejido de los ganglios linfáticos una vez con 750 l medio básico. NOTA: Este paso sólo es necesario si se trabaja con ratones inmunocompetentes. </li><li> Deje que los fragmentos de los ganglios linfáticos se asientan. </li><li> Quite elfracción de células flotantes no estromal. </li><li> Añadir a los fragmentos de los ganglios linfáticos medio básico suplementado con 750 l 3,5 mg / ml de colagenasa D y 40 mg / ml de DNasa I. </li><li> Colocar el tubo de nuevo en el vaso de precipitados que contiene el 37 ° C precalentado agua. </li><li> Digerir el tejido de los ganglios linfáticos durante 5 minutos mientras se agitaba lentamente. </li><li> Ganglios fragmentos de tejido nodo desagregados por pipeteo y la mezcla de 700 l para 10 ciclos a máxima velocidad utilizando una pipeta multicanal automatizado. NOTA: Esto altera el tejido del ganglio linfático para mejorar la digestión. </li><li> Colocar el tubo de nuevo en el vaso de precipitados con 37 ° C el agua precalentado. </li><li> Fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos Digest durante otros 10 minutos, mientras que poco a poco revolviendo. </li><li> Desglosar los fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos con la pipeta y mezclar durante 99 ciclos a máxima velocidad utilizando una pipeta multicanal automatizada. </li><li> Añadir 7,5 l de 0,5 M EDTA para asegurar el mantenimiento de la suspensión de células individuales. </li><li> Fragmentos de tejido de los ganglios linfáticos desagregados por tuberíatting y mezclando durante 99 ciclos a máxima velocidad utilizando una pipeta multicanal automatizado. </li><li> Añadir medio básico 750 l y pasar las células a través de una malla de nylon 70 micras. </li><li> Se centrifuga la suspensión celular 5 min a 1500 × g, 4 ° C. </li><li> Las células estromales se pueden utilizar ahora para su posterior análisis. </li></ol> 2. La tinción de células de ganglio linfático estromales <ol><li> Use una combinación de anti-CD45, anti-podoplanin (GP38), los anticuerpos anti-CD31 para reconocer con éxito las células TRC, LEC, BEC y DN. </li><li> Incubar el tejido del ganglio linfático digerido con vivo rastreador / Dead, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-GP38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) en 100 l de HBSS que contiene 2 % de FCS durante al menos 20 min, 4 ° C, en la oscuridad. </li><li> Lavar las células añadiendo 500 l de HBSS que contenía 2% de FCS </li><li> Se centrifuga la suspensión celular 3 min a 1500 × g, 4 ° C. </li><li> Vuelva a suspender en 100 l de HBSS que contenía 2% de FCS. </li><li> Ejecute las células teñidas en un citómetro de flujo equipped con las siguientes óptica: fuente de excitación con hasta tres láseres: azul (488 nm, enfriado por aire, 20 mW de estado sólido), rojo (633 nm, 17 mW HeNe), y violeta (405 nm, 30 mW estado sólido) . </li><li> Puerta de CD45 - células para excluir las células hematopoyéticas. </li><li> Interiores de puertas (FSC-W) y células vivas (live / perseguidor DEAD) para excluir dobletes y células muertas. </li><li> Terreno GP38 contra CD31 para visualizar TRC (GP38 + CD31 -), LEC (GP38 + CD31 +), BEC (GP38 - CD31 +) células (véase la figura 1) y DN (GP38 - - CD31). </li></ol>

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The authors declare they have no competing financial interests.

El estudio de las células del estroma de los ganglios linfáticos se convirtió recientemente en un foco de investigación, debido al desarrollo de dos protocolos de digestión publicados 6,13. Ambos protocolos son adecuados para obtener las células del estroma sola ganglios nodo, pero difieren en el uso de enzimas de digestión y el tiempo de digestión. Dado que las células estromales y sus marcadores de superficie son sensibles a la digestión enzimática y la tensión mecánica, se requiere un protocolo optimizado. El aislamiento de células del estroma de los ganglios linfáticos viables desde el nodo linfático recién diseccionado es el primer paso para realizar fenotípica y análisis funcional. Por lo tanto, es importante para digerir cuidadosamente con la concentración definida de las enzimas, a una temperatura estable y durante el tiempo indicado. Dos protocolos de digestión se han descrito 6,13, sin embargo con los pasos de digestión más largos. Para reducir el tiempo de la digestión, la desagregación mecánica estaba incluido y estandarizada utilizando una pipeta multicanal. En<html> e de las ventajas del protocolo actual es que permite el aislamiento de las células estromales en sólo 45 min, por lo tanto minimizar su tiempo de incubación con las enzimas de digestión. Además, agitación constante durante la digestión permite el acceso óptimo de las enzimas de digestión a la estructura de los ganglios linfáticos. Además, el volumen se redujo a la digestión 750 l minimizando la cantidad de enzima utilizada. Fuerza mecánica excesiva altera las uniones estrechas, pero podría causar la muerte celular al mismo tiempo. Por esta razón hemos probado varias combinaciones de ciclos de re-suspensión y diferentes dispositivos de disociación. Hemos encontrado que el uso de una pipeta multicanal automatizado permite la disociación dentro de 2 aplicaciones de 99 ciclos; aplicar una presión constante a las células y esto resultará en suspensión de células individuales con la viabilidad óptima. De cuatro a seis muestras se pueden mezclar y se pipetearon al mismo tiempo, reduciendo el tiempo de los ganglios linfáticos de aislamiento de células del estroma. ontenido &quot;&gt; El protocolo de la digestión tiene que mantener la expresión en la superficie de casi todas las moléculas;. sólo de esta manera la tinción concomitante con varios marcadores puede revelar si una población es homogénea o heterogénea Por ejemplo, el uso de BP-3 y CD35 en el TRC GP38 + CD31 -. permite la visualización y el aislamiento de medular TRC (Sanjiv Luther, comunicación personal) Además, la fracción DN mal caracterizado fue caracterizado además como que contiene células Aire + y pericitos como células positivas para la integrina α7 (revisado en 7, 13). Por lo tanto, el presente protocolo se comparó con los publicados. Como se muestra en los resultados, las frecuencias y el número de células del estroma de ganglios linfáticos similares se obtuvieron con el protocolo actual en comparación con los publicados. Curiosamente, frecuencia y número de aislados TRC fueron más altos con el protocolo Fletcher sugiriendo una mejor disociación de las estructuras de la CVR que en el protocolo actual yProtocolo de enlace. Además, la expresión de varias moléculas de la superficie se ha mejorado con el protocolo actual en comparación con el protocolo Fletcher. Estas diferencias en el método de digestión podría ser la razón para ligeramente diferentes patrones de expresión en el ganglio linfático estudios de células del estroma 6,19,21. Podría ser útil para probar diferentes protocolos de digestión a causa de las ventajas de cada protocolo. El protocolo actual podría ser mejor para el análisis de expresión de la superficie, mientras que el protocolo Fletcher podría ser útil para el aislamiento de un gran número de células viables para el análisis de la transcripción (como se publicó en Malhotra et al. 7). Por lo tanto, la comparación de los tres protocolos de digestión puede ser importante para obtener resultados óptimos después del aislamiento de las células del estroma de los ganglios linfáticos y debe ser visto como complementario.

Los ganglios linfáticos son compartimentos especializados donde se inician y coordinan la respuesta inmune adaptativa contra extranjeros y los antígenos propios. El procedimiento presentado aquí describe una digestión enzimática corto combinado con pipeteo automatizado mecánica para obtener los ganglios linfáticos suspensión de células individuales y obtener acceso a las células del estroma de ganglios linfáticos viables que mantienen la expresión en la superficie de varias moléculas. Células estromales de los ganglios linfáticos forman el andamiaje de los ganglios linfáticos y cumple tres funciones principales: en primer lugar que filtran los fluidos corporales para degustar antígenos, patógenos y sus patógenos asociados patrón molecular (PAMP), así como las citocinas y peligros asociados patrón molecular (apaga) presente en el cuerpo. En segundo lugar, que atraen e instruyen a las células presentadoras de antígeno (APC) y linfocitos de interactuar e iniciar la respuesta inmune adaptativa; y tercero, que proporcionan un entorno estructural para la homeostasis y la diferenciación de los linfocitos 1-3. Durante la inflamación de los ganglios linfáticos células estromales producen factores de crecimiento, citocinas y quimiocinas, adaptarse a la hinchazón por lo tanto la organización de la interacción entre las células dendríticas (DCs), y células T B-. La orquestación de las respuestas inmunes sólo es posible debido a la compleja arquitectura estructural formada por diferentes poblaciones de células del estroma. Las células estromales son células de ganglios linfáticos negativos CD45 y se pueden distinguir por la expresión de CD31 o GP38 en las células endoteliales y fibroblásticas 1 -6. GP38 + CD31 - células de la zona T define reticulares (TRC, también conocidos como FRC: células reticulares fibroblásticas), GP38 + CD31 + define células linfáticas endoteliales (LEC), GP38 - CD31 + define las células endoteliales de sangre (BEC). Además, la caracterización de las subpoblaciones reveló la existencia de otras células del estroma de los ganglios linfáticos. De hecho, una pequeña población de células-pericitos se caracterizó como en elGP38 - CD31 - población 7. Por lo tanto, la adaptación del procedimiento de aislamiento es ventajoso para la identificación y caracterización de las propiedades funcionales de las diferentes células del estroma de los ganglios linfáticos. Antes del desarrollo de los ganglios linfáticos digestión células estromales de los protocolos de estudio de las células del estroma de ganglios linfáticos se limita a las observaciones in situ usando sección de tejido y la microscopía. Sin embargo, los estudios estructurales y funcionales mostraron características importantes de las células del estroma de los ganglios linfáticos. Células del estroma de ganglios linfáticos están asociados con podoplanin, colágeno y matriz extracelular (ECM), las proteínas para formar un complejo 3 estructura dimensional llamado sistema de conductos, que transporta las proteínas de los ganglios y de masas moleculares asociados de baja desde el seno subcapsular del ganglio linfático a la alta endotelial vénulas en la zona de las células T 8. Países en desarrollo están en estrecho contacto con las células del estroma y puede observarse que sobresale en el aire tubularestructura de conducto a la muestra de fluido y detectar antígenos 8. La interacción de las células del estroma de ganglios linfáticos (TRC y LEC) con DCS es mediada por la liberación y la presentación de quimiocinas CCL21 y CCL19 9,10. CCL19 y CCL21 son reconocidos por el receptor CCR7 facilitar países en desarrollo y las células T de migrar al ganglio linfático zona de células T 4,11. A pesar de utilizar quimiocinas similares, las células DCs y T tienen diferentes rutas de migración hacia los ganglios linfáticos 12. Más tarde, usando digestión enzimática de los ganglios linfáticos y el aislamiento de las células estromales de ganglios linfáticos puros, se realizaron estudios funcionales sobre el papel de las diferentes células del estroma de los ganglios linfáticos y de su capacidad para interactuar con los DC y células T / B 6,13. En primer lugar, la diafonía entre IFN-γ que producen células T efectoras y las células del estroma de ganglios linfáticos induce la producción del óxido nítrico metabolito se muestra para amortiguar las respuestas de células T y la proliferación en los órganos linfoides secundarios 14-16. En segundo lugar, la linfa ncélulas estromales ode se han reportado para apoyar la diferenciación de subconjuntos de regulación de corriente continua a través de la producción de IL-10 17, y para modular la homeostasis de las células T naïve a través de la producción de IL-7 6,18. En tercer lugar, la expresión de TLR en las células del estroma de ganglios linfáticos sugiere que las células estromales son susceptibles a la señal derivada de una infección o de auto-moléculas liberado durante la lesión de los tejidos. De hecho, el tratamiento de las células del estroma de los ganglios linfáticos con el ligando de TLR3 poli (I: C) induce un modesto regulación positiva de la expresión principal de histocompatibilidad de clase I y la regulación positiva de la molécula inhibidora de la co-PD-L1, pero no de moléculas coestimuladoras, que resulta en cambios dramáticos en el tejido periférico antígenos expresión 19. Varios grupos han demostrado las células del estroma de los ganglios linfáticos expresan antígenos de tejidos periféricos e inducen la tolerancia de las células T autorreactivas 19,21-27. Por lo tanto, la comprensión de las interacciones entre las células del estroma de los ganglios linfáticos y la otra re migratoria ycélulas de nódulos linfáticos Sident ayudarán a encontrar nuevas moléculas diana para permitir la activación o supresión de las respuestas inmunes durante la inflamación. Por lo tanto, se necesita la aplicación de la separación enzimática publicada del ganglio linfático. Protocolos previamente publicados utilizan diferentes combinaciones de a base de colagenasa digestión enzimática con menores esfuerzos mecánicos 6,19,20. Sin embargo, las incubaciones largas con las enzimas de fermentación y de la diferente combinación de enzimas de digestión pueden degradar diversas moléculas de la superficie necesaria para analizar el estado de activación y la identificación de nuevas células del estroma de los ganglios linfáticos. Dependiendo del tipo del análisis de células del estroma, el Protocolo de Enlace o protocolo Fletcher podrían ser más adecuado. En el procedimiento descrito, una digestión enzimática ligeramente más corto se combina con desagregación mecánica automatizada para minimizar la degradación del marcador de superficie de los ganglios viable células estromales nodo. Este procedimiento permite el aislamiento y altamente reproducibledistinción de los ganglios linfáticos poblaciones de células del estroma con baja variabilidad y más de 95% de viabilidad. Las células del estroma de ganglios linfáticos recién aisladas se pueden utilizar directamente para la expresión de marcadores de superficie, el análisis de proteínas, y los estudios de la transcripción, así como el establecimiento de líneas de células estromales para llevar a cabo ensayos funcionales in vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies-Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td></td><td></td><td>Final concentration 2%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>499609</td><td>Final concentration 1.2 mM</td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td>&gt;160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td>use at 3.5 mg/ml</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>11284932001</td><td>use at 40 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Stiring magnets</td><td>FAUST</td><td></td><td>5 mm long-2 mm &amp;oslash;</td></tr><tr><td>Polystyrene round bottom tubes 5 ml</td><td>Falcon-BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer with heating function</td><td>IKA-RCT-standard</td><td>9720250</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes 100 mm, sterile</td><td>TPP</td><td>6223201</td><td></td></tr><tr><td>25 G needles</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti mouse CD45 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>anti mouse CD11c Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>anti mouse Podoplanin Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 8.1.1</td></tr><tr><td>anti mouse CD31 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone MEC13.3</td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Eppendorf Xplorer plus, Multichannel</td><td>Eppendorf</td><td>4861 000.821/830</td><td>1.250 &amp;micro;l max. volume</td></tr><tr><td>anti mouse CD140a</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone APA5</td></tr><tr><td>anti mouse CD80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 16-10A1</td></tr><tr><td>anti mouse CD40</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 1C10</td></tr><tr><td>anti mouse I-Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone AF6-120.1</td></tr><tr><td>anti mouse CD274 (PD-L1)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 10F.9G2</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of murine lymph node stromal cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

El presente protocolo es un protocolo de digestión modificado publicado por Link et al., 2007 6 con un tiempo de digestión más corto (45 min máximo) debido a la disgregación mecánica con una pipeta multicanal automatizada. Además, el procedimiento es más uniforme, minimiza la degradación de marcadores de superficie en diferentes células del estroma de los ganglios linfáticos y permite la manipulación de más de una muestra a la vez. La colagenasa IV y colagenasa D en Enlaces de protocolo 6 y protocolo actual o colagenasa P y Dispasa en protocolo Fletchers 13 mantienen linfático estromal nodo viabilidad de las células y piezas de la digestión de varios marcadores de superficie incluyendo CD45, CD31 y GP38. Para probar se retiraron los nodos de protocolo, axilares, braquial y los ganglios inguinales actuales y digeridos para aislar sus células del estroma. Análisis de CD45, CD31 y GP38 expresión demostró la presencia de células TRC, LEC, BEC y DN aisladas de ratones C57BL / 6 mhielo (Figura 1, la estrategia de activación periódica). La tensión mecánica puede reducir la viabilidad de las células del estroma de nodo de linfa durante la digestión. La comparación de la viabilidad de las subpoblaciones de aislados de las células del estroma utilizando los tres protocolos diferentes, se encontró que la viabilidad fue superior al 95% en el protocolo Fletcher, pero menor tanto para el protocolo actual y el protocolo de enlace (Figura 2A), aunque muestran protocolo actual mejor supervivencia en la subpoblación BEC entonces Enlace con protocolo. El número total de células se recuperó después de digestión de los ganglios linfáticos subconjuntos de células del estroma fue ligeramente superior en protocolo Actual y el protocolo de enlace y protocolo Fletcher (Figura 2A). Estos resultados demuestran que el protocolo actual mantiene la viabilidad de las células estromales de ganglios linfáticos similares a los protocolos publicados. Las principales diferencias entre los tres protocolos se enumeran en la Tabla 1. Marcadores de la superficie de un<html> re necesaria para caracterizar nódulos células estromales nodo por citometría de flujo y aislarlos mediante clasificación celular. TRC y los LEC aislados a través de actual, los protocolos de enlace y Fletcher se compararon para IA b, CD140a, CD80, PD-L1 y la expresión de CD40. Después de aislar las células del estroma de los tres protocolos, encontramos la expresión de IA b, CD80, CD140a, PD-L1, y CD40 fue mayor tras la digestión con CP y LP en ambos TRC y LEC (Figura 2B). Estos resultados sugieren que la degradación de algunas moléculas de la superficie con colagenasa IV y D son menos fuertes que con colagenasa P y dispasa. Tomados en conjunto, el protocolo actual incluye una digestión corto combinado con desagregación mecánica automatizada para minimizar la degradación del marcador de superficie de los ganglios viable células estromales nodo. &quot;/&gt; Fueron digeridos Figura 1. TRC, la tinción de células LEC, BEC, y DN, de compuerta y de cuantificación. Ganglios linfáticos de ratones C57BL / 6 siguiendo el protocolo actual y teñidas con CD45, CD31 y GP38, Live / Dead definir TRC, LEC, BEC, y DN células por citometría de flujo. Los datos muestran resultados representativos de la tinción. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51803/51803fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51803/51803fig2highres.jpg" width="500" /> Fueron digeridos Figura 2. Viabilidad y la superficie marcador expresión de las células del estroma de los ganglios linfáticos. Los ganglios linfáticos de ratones C57BL / 6 después de la actual (CP), de (LP) de protocolo de Fletcher (FP) y se tiñeron con CD45, GP38 y CD31 Link y para definir células TRC, LEC, BEC y DN por citometría de flujo. A) Viabildad y el número total de células de todas las subpoblaciones de células del estroma nodo linfático después de tinción Live / Dead (n ≥ 5, los datos combinados de 2 experimentos independientes, barras representan SEM). B) Análisis de la expresión superficial de IA b (APC-Cy7), CD140a (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) y CD40 (PE-Cy7) en los TRC y LEC (n = 6 para FP y n = 11 para LP y CP , los datos combinados de 2 experimentos independientes, barras representan SEM). Valores geométricos IMF auto-fluorescencia para LEC-APC-Cy7: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82.5, LEC-PerCpCy5.5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 ± 54, TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51803/51803fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Actual Protocolo-Enzimas </td><td> -Protocolo actual </td><td> Enlace de protocolo-enzimas </td><td> Link-protocolo </td><td> FProtocolo-enzimas Letcher </td><td> Fletcher-protocolo </td></tr><tr><td> La colagenasa IV, ADNasa I </td><td> 30 min, 37 ° C, agitación </td><td> La colagenasa IV, DNAsa I </td><td> 30 min, 37 ° C </td><td> La colagenasa P, dispasa, DNAsa I </td><td> 20 min, 37 ° C, invertir cada 5 min </td></tr><tr><td> La colagenasa D, ADNasa I </td><td> 5 min, 37 ° C, agitación, resuspender </td><td> La colagenasa D, DNAsa I </td><td> 20 min, 37 ° C </td><td> La colagenasa P, dispasa, DNAsa I </td><td> 10 min, 37 ° C, 30 seg resuspender </td></tr><tr><td></td><td> 10 min, 37 ° C, agitación </td><td> La colagenasa D, DNAsa I </td><td> 37 ° C, resuspender cada 10 min hasta que la digestión completa </td><td> La colagenasa P, dispasa, DNAsa I </td><td> 37 ° C, resuspender cada 5 min hasta que la digestión completa </td></tr><tr><td></td><td> resuspensión mecánica automatizada </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. resúmenes cortos de CP, LP, enzimas FP utilizados y los protocolos.

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Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Aislamiento de células estromales murinas en nódulos linfáticos

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

isolation-of-murine-lymph-node-stromal-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

31.1K vistas.  University of Basel and University Hospital Basel. Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells. 

Video: Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Aislamiento de células T CD4 + de los ganglios linfáticos del ratón utilizando Miltenyi Purificación MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Investigación

Biología

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Aislamiento de linfocitos de ratón del tracto genital Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Inmunología e Infección

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Optimización del aislamiento de células estromales del timo y la médula ósea

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Autor destacado: Avance de la investigación hematopoyética mediante el aislamiento de células estromales para la secuenciación de células individuales

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Aislamiento de células estromales murinas en nódulos linfáticos

Resumen

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Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

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Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

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