This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.

1. Determinación de un valor aproximado de la constante de disociación (es decir, dentro de un orden de magnitud) <ol><li> Preparar la mezcla se detalla en la Tabla 1. </li><li> Preparar las existencias del ligando de interés en la concentración más alta disponible, y luego a seis de diez diluciones de este. Cuando una K aproximada d es conocido a partir de datos anteriores, el objetivo de tener al menos dos concentraciones por encima y por debajo de la K d. </li><li> Alícuota de 18 l de la mezcla en ocho pocillos en una placa de qPCR. Añadir 2 l de disolvente a la primera también. Añadir 2 l de cada miembro de la serie de dilución ligando (paso 1,2) a un pocillo cada uno de los siete pocillos restantes. </li><li> Coloque un sello qPCR sobre la placa. Para lograr un buen sellado de la placa, colocar un aplicador de mano (véanse los cuadros de reactivos específicos) en el centro de la placa. Suavizar el sello a un lado, y luego repetir en el otro medio dela placa. </li><li> Centrifugar la placa a 500 xg durante dos minutos para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Colocar la placa en un instrumento StepOne qPCR. Seleccionar la opción &quot;curva de fusión&quot;, los filtros ROX, y elegir la velocidad de rampa rápida (esto proporciona una pausa de 2 min a 25 ° C, seguido por una rampa a 99 ° C durante 40 min, y después una pausa de 2 min). Ejecutar una desnaturalización térmica. NOTA: Los archivos de comandos para realizar una carrera están disponibles en línea en http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Al término de la aplicación del instrumento, haga clic en el botón &quot;Analizar&quot; en la pantalla. Guarde el archivo de resultados. </li><li> Abra la proteína software Shift térmica. <ol><li> Crear un nuevo estudio; en la ficha de propiedades, dar a esto un nombre, y en la ficha Condiciones, detalle los ligandos. </li><li> Mover a la pestaña Archivos Experimento, e importar el archivo de resultados de salvado (XXX.eds), y establecer el contenido de cada pocillo (fil plantillaes están disponibles de los autores). </li><li> Mover a la pestaña Análisis, y presione el botón &quot;Analizar&quot;. NOTA: Este analizará los resultados. Es posible exportar los resultados de nuevas investigaciones en Excel utilizando la pestaña Exportar. Los resultados se exportan en un formato de ficha delineado. Lo mejor es abrir el archivo exportado en Excel, e inmediatamente guardar en formato Excel. </li></ol></li><li> Compruebe que la proteína en la presencia de disolvente solo da un resultado similar al mostrado en la Figura 1A. A continuación, examinar las temperaturas de fusión observados en los resultados en el panel de &quot;réplica&quot;. Asegúrese de que este muestra un claro aumento de la temperatura de fusión con el aumento de la concentración de ligando. NOTA: Idealmente, esto proporcionará una temperatura máxima de fusión claro (suponiendo que la proteína está totalmente ligando unido), y una K aproximada d donde la temperatura de fusión está a medio camino entre la proteína-ligando libre yel máximo. </li></ol> 2. experimental para determinar la constante de disociación <ol><li> Preparar la mezcla se detalla en la Tabla 2 como una mezcla maestra. </li><li> Preparar las existencias del ligando a los quince concentraciones diferentes, que se pueden diluir diez veces en el experimento final. Lo ideal es incluir las concentraciones de al menos dos órdenes de magnitud por encima y por debajo del estimado K d, y el centro de las concentraciones en el estimado K d. Centrarse en siete de los puntos dentro de un orden de magnitud del estimado K d, con otros cuatro puntos a cada lado de esta; si hay una opción, incluir más puntos en los valores que están saturado. NOTA: Si es necesario, es factible para alterar las condiciones experimentales tales que las poblaciones de ligandos son al doble de la concentración experimental, donde la solubilidad del ligando es limitante. </li><li> Añadir 120 l de la maestramezclar hasta ocho pocillos en una placa de fondo en U de 96 pocillos, para actuar como un depósito para la dispensación conveniente de la mezcla maestra. Utilice una pipeta de 8 canales para dispensar 18 l en una columna de una placa de PCR. Repita por otros cinco columnas, para dar un total de 48 pozos llenos en un patrón 6 x 8 en la placa. </li><li> Añadir 20 l de las poblaciones de ligando, o el disolvente, para separar pocillos en una placa de fondo en U de 96 pocillos. Usando una pipeta de 8 canales, aspirado de 2 l de ocho acciones diferentes ligandos (o disolvente). Añadir estos a una columna de la placa de PCR que estaba llena de mezcla maestra en el paso 2.3. Repita el procedimiento con los mismos ocho ligando / acciones disolventes para otras dos columnas. Aspirar 2 l de las ocho acciones ligando o disolventes restantes y añadirlos a una cuarta columna en la placa. Repita esto para otras dos columnas. Esto le dará muestras por triplicado para todos 16 ligando y muestras de solventes. </li><li> Coloque un sello qPCR sobre la placa (véase el paso 1.4). </li><li> Centrifugar la placa a 500 xg durantedos min. </li><li> Colocar la placa en el instrumento qPCR. Ejecutar una desnaturalización térmica utilizando los parámetros especificados en el paso 1.6. </li><li> Al término de la aplicación del instrumento, haga clic en el botón &quot;Analizar&quot; en la pantalla. Guarde el archivo de resultados. </li><li> Abra la proteína software Shift térmica. Crear un nuevo estudio; en la ficha de propiedades, dar a esto un nombre, y en la ficha Condiciones, detalle los ligandos. </li><li> Mover a la pestaña Archivos Experimento, e importar el archivo de resultados de salvado (XXX.eds), y establecer el contenido de cada pocillo. NOTA: los archivos de plantilla están disponibles en línea en http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Mover a la pestaña Análisis, y presione el botón &quot;Analizar&quot;. <ol><li> Elija la ficha &quot;réplicas&quot; en el menú en la parte izquierda de la pantalla para mostrar los resultados como triplicados. Evaluar la fiabilidad de los datos basados ​​en el grado de tensión son los triplicados. Should los triplicados muestran mala reproducibilidad, examinar de cerca los datos en bruto. </li><li> Analizar los datos utilizando tanto el Boltzmann o métodos derivados de evaluar la temperatura de fusión. Seleccione la pestaña &quot;Replicar resultados&quot;, y en el &quot;Replicar resultados complot&quot;, mueva el &quot;Terreno de:&quot; botón entre &quot;Tm - Boltzmann&quot; y &quot;Tm - Derivado&quot;. Seleccione el método que da la mayor reproducibilidad para la muestra. Exportar los resultados de nuevas investigaciones en Excel utilizando la pestaña Exportar. NOTA: Para ver ejemplos que muestran múltiples transiciones, casi siempre es mejor usar el método derivativo en el modo de fusión múltiple. Los resultados se exportan en un formato de ficha delineado. Lo mejor es abrir el archivo exportado en Excel, e inmediatamente guardar en formato Excel. </li><li> Repetir el experimento al menos dos veces, incluyendo una repetición en un día separado, para asegurar la reproducibilidad de los resultados. En caso de análisis de datos (véase el paso 3 a continuación)indican que el valor de K d es significativamente diferente a la estimación original, alterar las concentraciones de ligando en consecuencia (véase el paso 2.2) para garantizar una buena gama de valores en torno a K d. </li></ol> 3. análisis de datos para determinar la constante de disociación bajo desnaturalización térmica <ol><li> Crear una tabla en Excel de las concentraciones de ligando y la temperatura de fusión. </li><li> Abra el software GraphPad Prism, y crear una mesa XY. Introduzca los datos, utilizando la columna X de las concentraciones de ligando y la columna de la Y para la fusión de los resultados de temperatura. NOTA: un ejemplo que se muestra es la figura 1B. Un guión con ecuaciones precargados, y otras instrucciones para el uso del paquete estadístico SPSS, están disponibles en línea en http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> En la ficha Análisis, seleccione la opción de cambiar los parámetros de análisiss (Ctrl + T). Para entrar en el modelo correcto, seleccionar &quot;Nuevo&quot; y &quot;Crear nueva ecuación&quot;. Inserte la ecuación se detalla en la Tabla 3 como &quot;la unión del ligando sitio único&quot;. NOTA: Un ejemplo de estos pasos se muestra en la Figura 1C. Cuando se utiliza la secuencia de comandos con ecuaciones precargados, la ecuación correspondiente se puede dirigir elegido de la lista en lugar de introducir. Derivación de esta ecuación se proporciona en un apéndice. </li><li> Seleccione la opción &quot;Reglas para los valores iniciales&quot; caja, y entrar en las reglas para los valores iniciales como se detalla en la Tabla 3. </li><li> Restringir el parámetro P, como &quot;constante igual a&quot; e introducir la concentración final de proteína (en las mismas unidades que el ligando se da en). </li><li> Seleccione Aceptar para realizar el análisis. NOTA: Un ejemplo de estos pasos se muestra en la Figura 1D. El software de gráficos produce una figura que muestra los datos y el ajuste al modelo. Ejemplos de tanálisis stos se muestran en los datos representativos. </li></ol> 4. Ajustando datos a Modelos de Cooperativas Para ajustar los datos a un modelo cooperativo, elegir entre cualquiera de un modelo cooperativo simple, o un modelo en el que se definen dos constantes de disociación separadas. Se prefiere el primer enfoque en el caso de cooperatividad negativa, o como una investigación inicial. Sin embargo, en principio es mejor en casos de cooperatividad positiva al modelo de dos diferentes constantes de disociación 18. En este caso, el modelado puede continuar asumiendo ya sea secuencial de unión de ligandos, o de unión de ligandos independiente. <ol><li> Siga los mismos pasos iniciales como en protocolo 3. Sin embargo, en la etapa 3.3, inserte una de las ecuaciones en la Tabla 3 que aparece como &quot;modelo cooperativo Simple&quot;, &quot;secuencial unión de dos ligandos&quot;, o &quot;unión independiente de dos ligandos&quot; 18. </li><li> Seleccione las reglas relevantes para los valores inicialesasociado con cada una de estas ecuaciones en la Tabla 3. </li><li> Examine el ajuste del modelo a los datos. Si los datos se ajustan mal, considerar otro modelo. NOTA: también es importante examinar cuidadosamente el ajuste de la temperatura de fusión de los datos por el software del Cambio Térmico Proteína (paso 2.9): a veces es necesario modificar los parámetros para obtener los mejores resultados. Otra consideración es si el rango de puntos de datos es ideal, y si hay puntos anómalos: o bien un conjunto limitado de datos a ambos lados de K d, o un punto anómalo (sobre todo en las más altas concentraciones de ligandos), puede afectar significativamente los resultados. </li><li> Repita el experimento por lo menos dos veces (vea el paso 2.12) para asegurar la reproducibilidad. </li></ol> 5. Ajustando datos a curvas que muestran Cambios binarios en fusión Temperatura De vez en cuando, en lugar de una respuesta gradual a ligando, las proteínas han sidoobservado a adoptar una respuesta binaria, en donde la muestra unida se separa claramente de la muestra no unida. Un ejemplo se presenta en los resultados representativos (Figura 4). En este caso, ajuste de las temperaturas de fusión no proporcionar un buen ajuste para K d. <ol><li> Exportar la salida de datos en bruto de la Proteína software Shift térmica. Para cada punto de temperatura, calcular la media de fluorescencia para el ligando cero, y las concentraciones más altas de ligandos. Tabular los resultados de cada punto al lado de estos datos. NOTA: El error creado aquí es menor que el error en las temperaturas de fusión armarios. </li><li> Abra el paquete estadístico SPSS. Copie las temperaturas, los dos conjuntos de datos de medios y datos para cada experimento para una ventana de datos en SPSS. En la pestaña de variables, establecer el conjunto de datos media para no ligando como &quot;baja&quot;, y el conjunto de datos promedio de la concentración de ligando más alto como &quot;alta&quot;. </li><li> Descargue el archivo de sintaxis disponiblesen línea en http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> . Seleccione &quot;Ejecutar → Ejecutar todo&quot;. </li><li> Copie la proporción resultados unidos a un nuevo libro de Excel, con las concentraciones de ligando pertinentes. </li><li> Abra el software Graphpad, y crear una mesa XY. Introduzca los datos, utilizando la columna X de las concentraciones de ligando y la columna de la Y para la fusión de los resultados de temperatura. En la ficha de análisis, seleccione &quot;Parámetros de análisis de cambio&quot;. Para entrar en el modelo correcto, seleccionar &quot;Nuevo&quot; y &quot;Crear nueva ecuación&quot;. Introduzca la ecuación dada en la Tabla 3, que aparece como &quot;Análisis de los cambios binarios en temperatura de fusión&quot;. </li><li> Seleccione la casilla de &quot;Reglas para los valores iniciales&quot;, e introduzca reglas para los valores iniciales que se detallan en la Tabla 3. Restringir el parámetro P, como &quot;constante igual a&quot; y escriba la concentración final de proteína (en las mismas unidades que la ligand se da en). NOTA: ejemplos de completar estas cajas para el protocolo en la sección 3 se muestran en la Figura 1C, D. </li><li> Si hay un buen ajuste, los resultados pueden ser mejorados mediante la extrapolación al resultado esperado en la concentración de ligando infinito. A partir del modelo de la proporción unida a cada concentración de ligando, examinar el valor para el valor más alto de la concentración de ligando. Si esta es 0,99 o mayor, es poco probable que mejorar los resultados de un análisis adicional. </li><li> Si la proporción es inferior a 0,99, se requiere una etapa adicional para corregir los efectos de la proteína no unida en la muestra más alta concentración de ligando. En la etapa 5.2, escribir la proporción de ligando unido en el punto de concentración de ligando más alto (de la etapa 5.7) en la celda R2 (una célula diferente puede ser utilizado, y R2 sustituido apropiadamente en la ecuación en la Tabla 3). Crear una columna adicional después de la media de los resultados más altos de concentración de ligando. En los abetost celular, copia la ecuación que aparece en la Tabla 3, como &quot;La extrapolación a infinito concentración de ligando&quot;. Copiar esta fórmula para las células restantes en esta columna. NOTA: Este cálculo elimina el efecto de la proteína no unida en la más alta concentración de ligando. La diferencia entre la proteína ligando libre y la más alta concentración de ligando se multiplica por el recíproco de la proporción unida a la mayor concentración de ligando para proporcionar la diferencia esperada entre los estados de proteínas totalmente consolidadas y no consolidadas en cada punto de temperatura. Se añade o se resta del estado no ligado para dar el esperado para la proteína de fluorescencia totalmente ligando unido Esta diferencia. </li><li> Vuelva a colocar la columna de máxima concentración de ligando en la hoja de datos de SPSS con esta nueva columna, y repita el ajuste de datos. NOTA: los pasos 5.7 a 5.9 pueden necesitar ser repetidas si el modelo sugiere un cambio significativo de la proporción con destino a los concentrati máximos ligando(si este es el caso, probablemente sería ideal para repetir el experimento con un punto de concentración de ligando superior incluido). </li><li> En los casos en que la proteína muestra un comportamiento cooperativo de desplazamiento binario y muestra, la ecuación sugiere en el paso 5.5 debe ser sustituido con los de paso 4.1. Los parámetros de &quot;abajo&quot; &quot;Top&quot; y deben ser sustituidos por 1 y 0, respectivamente. </li><li> Repita el experimento por lo menos dos veces (vea el paso 2.12) para asegurar la reproducibilidad. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have nothing to disclose.

Fluorimetry diferencial de barrido ha demostrado su poder como un método robusto y versátil para la caracterización de las proteínas, y la identificación de posibles ligandos proteicos. Los éxitos bien documentados en acelerar la estabilización de proteínas, el descubrimiento de fármacos (especialmente en laboratorios tan bien financiados) y cristalización 10,23-25 ​​han convertido en un método atractivo para la selección inicial de los compuestos. Compuestos añadidos a las proteínas muestran un aumento dependiente de la dosis claro en el 7,9 temperatura de fusión aparente. Sin embargo, ha habido pocos intentos de utilizar los resultados de estos experimentos para determinar las constantes de unión aparentes para ayudar en la clasificación de compuestos por su afinidad. A continuación, presentamos un método para determinar sistemáticamente una constante de disociación aparente para las proteínas en presencia de un ligando. Los resultados presentados aquí demuestran que DSF puede proporcionar rápidamente y con firmeza estimaciones de la constante de disociación parauna combinación de proteína-ligando. Los datos observados se pueden manipular con las herramientas disponibles en el mercado para proporcionar una determinación rápida de K d, sin la necesidad de hacer suposiciones sobre el valor probable de parámetros. El método tiene una ventaja significativa sobre algunos métodos comparables de ser parsimonioso en tanto la proteína y el tiempo requerido. El experimento descrito aquí consumirá 0,13 mg de proteína por experimento (aproximadamente 0,4 mg por repetidos experimentos por triplicado). Esto se compara favorablemente con la calorimetría de titulación isotérmica (ITC), donde un solo experimento con un promedio de proteína de 40 kDa consumirá una cantidad similar. El conjunto completo de los experimentos necesarios para este protocolo consumiría alrededor de 4 horas, incluyendo la preparación, para un único conjunto de experimentos. De nuevo, esto es probable que sea considerablemente más rápido que los métodos como el CCI o la resonancia de plasmón de superficie, mientras que a menudo requieren la optimización de gran alcance considerable para lograr mejores datos. Nuestros resultados demuestran que sigue habiendo un requisito de examinar cuidadosamente los datos en bruto, el ajuste de estos datos para determinar la temperatura de fusión, y el ajuste de los datos de temperatura de fusión para determinar la constante de disociación. Un primer desafío es la forma de los datos en bruto producidas en la fusión de proteínas. En algunos casos, la forma no puede aproximarse a la observada en la Figura 1A. Problemas comunes incluyen cambios de baja temperatura en la unión del ligando, de alta fluorescencia de fondo, y múltiples transiciones inusuales de temperatura. Cambios de temperatura baja se ven en la unión de un número de ligandos. Para este método, el parámetro más crítico es el error en la medición T m, en comparación con el cambio de temperatura. Los datos por lo general se puede montar razonablemente bien cuando la desviación estándar de las mediciones por triplicado no supere el 10% del cambio de temperatura de fusión entre la proteína no unida y completamente unido. Nuestra experiencia es que cuando dicha temperaturaturnos bibliografía son sólo 2 ° C, esto puede ser suficiente para el montaje de los datos, si los puntos de datos individuales son muy precisos. Una segunda cuestión tiene forma inusualmente curvas. Estos son distintos en las proteínas libres y formas ligando unido, como el ligando de unión afecta los modos de la proteína de despliegue. En estos casos, el usuario debe tener en cuenta si los datos se pueden utilizar con la debida consideración de los modelos a ser utilizado para determinar la temperatura de fusión y la constante de disociación. Otro problema común es que la adición de un cofactor de la proteína (por ejemplo, de MgCl 2 en nuestro ejemplo con hexoquinasa) se requiere para obtener los datos más fiables. Nuestra experiencia ha sido que una cuidadosa consideración de todos los factores que en el experimento en la etapa de toma de lecturas iniciales es esencial para obtener los mejores resultados. Además, los tratamientos teóricos alternativos pueden revelar características de estos datos 15,17. Por último, no es raro que algunas proteínas que contain nativa expuesta regiones hidrófobas para mostrar alta fluorescencia de fondo. Hay un número de soluciones a estos problemas, que han sido ampliamente revisado en otro 6,9. En particular, el usuario debe considerar la posibilidad de utilizar el Boltzmann o modelos derivados (por ejemplo, Figura 4), ​​y en el caso de uso de derivados, si se funde múltiples deben ser modelados. Los dos métodos de modelado de la desplegamiento térmico se diferencian en que el método de Boltzmann ajusta a los datos experimentales a la ecuación de Boltzmann, asumiendo una forma sigmoidal regular a la curva de desplegamiento. En contraste, el método derivado toma la primera derivada de los datos experimentales en cada punto (panel inferior en la Figura 1A), y considera que la temperatura de fusión para ser el punto más alto de la primera derivada. El método derivado generalmente devuelve una temperatura de fusión más alto en alrededor de 2 - 3 ° C. La mayoría de las proteínas volverán una más consistenteresultado (es decir, el error estándar de la temperatura de fusión para los experimentos por triplicado es menor) para uno de los dos métodos. Esto es generalmente íntimamente relacionada con la forma precisa de la curva de desplegamiento de la proteína, y es necesario para determinar empíricamente el mejor método en cada caso. Cuando se usa el modelo derivado, también es importante tener en cuenta múltiples eventos de fusión. Algunos datos muestran claramente la evidencia para múltiples transiciones, y en estos casos los resultados es probable que sean más fáciles de interpretar si se modelan estas múltiples eventos de fusión. En el contexto de este protocolo, a menudo es el caso que la adición de ligando puede causar una proteína para pasar de tener múltiples transiciones de fusión a una sola transición (por ejemplo, mediante la estabilización de el subdominio térmicamente más frágil), o viceversa. Por lo tanto le abogar por que los datos en bruto se examinan juntos antes de considerar qué enfoque será mejor usar. Después de la modelling de las temperaturas de fusión individuales, otras cuestiones pueden surgir en la adaptación de éstos a los modelos que se presentan en la sección de protocolo. Es imperativo examinar cuidadosamente el ajuste a la ecuación constante de disociación mediante una escala logarítmica, ya que este análisis pone de manifiesto a menudo discrepancias entre los datos observados y el modelo (e .g., Figura 3). Mientras que los resultados obtenidos son generalmente robusta, cuidado en la interpretación ofrece la oportunidad de extraer mejores resultados, y el más significado, a partir de los datos. Una cuestión particular planteada por estos datos es la interpretación que se debe colocar en las proteínas que muestran cooperatividad, o múltiples eventos de unión, en DSF. Hemos, hasta la fecha, sólo se observa este fenómeno en las proteínas que se espera que tengan múltiples eventos de unión específicos (por ejemplo, WCBM, una proteína cuya mejor homólogo es un multímetro de 26 años, y que actúa como un multímero en cromatografía de exclusión [de datos nomuestra]). No es del todo claro que la cooperatividad negativa observada en la desnaturalización DSF indica que la enzima en última instancia, mostrar cooperatividad negativa: más bien, esto puede ser una indicación de complejos de unión que debe ser explorado más a fondo el uso de una gama más amplia de métodos. Esto nos sugiere, sin embargo, que es probable que identificar interesantes efectos más amplios estudios de dichas proteínas. Los valores dados para la constante de disociación utilizando este método son generalmente del mismo orden que los proporcionados por otros métodos, tales como calorimetría de titulación isotérmica y resonancia de plasmón superficial. Sin embargo, los valores absolutos observados son con frecuencia más alta que la observada utilizando estos métodos. Esto es al menos en parte, una consecuencia del hecho de que la constante de disociación se observa a la temperatura de fusión de la proteína con ligando. Este K d es generalmente más alto que a temperaturas fisiológicas. El dissociation constante está relacionado con la temperatura de la reacción por las ecuaciones: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg" /> [1] <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg" /> [2] (Donde θ c es la concentración de referencia estándar, Δ R G es el cambio de energía libre de Gibbs de la reacción, R es la constante molar de los gases, Δ H es el cambio de entalpía en la reacción, y Δ S es el cambio de entropía en la reacción .) Reacciones con constantes de disociación en el rango medible de este método generalmente tendrá un Δ r negativo G, y así el efecto de un aumento de la temperatura en la ecuación [1] serán aumentar la constante de disociación. Tanto los términos Δ Δ H y S que constituyen la energía libre de Gibbs (ecuación [2]) son temperature dependiente 27, y el efecto sobre la constante de disociación se dependen de la magnitud y el signo de estas dependencias de temperatura, y serán necesariamente dependientes de la interacción. En consecuencia, no es inesperado que las constantes de disociación determinadas por este método son a veces mayor que las determinadas por métodos que operan a temperatura ambiente. Dependencia de la temperatura es, por supuesto, también una advertencia de muchos otros métodos, que tienden a proporcionar la constante de disociación a temperaturas inferiores a la temperatura fisiológica. Otra advertencia del método DSF es que es un método de marcado, a diferencia de ITC. La etiqueta fluorescente utilizado (SYPRO naranja) es hidrófobo, y así en algunos casos puede competir con la unión de ligandos a las proteínas hidrófobas. En consecuencia, es probable que en algunos casos, la constante de disociación obtenida se elevó artificialmente debido a la competencia con la etiqueta. Sin embargo, para la comparación de diversos ligandos, (el uso primario deDSF), las diferencias son poco probable que sea lo suficientemente significativos para afectar el ranking de los compuestos por afinidad. Un posible inconveniente de este método es el límite de detección que se puede lograr. En principio, no debería ser posible medir con precisión un valor para K d que es menor que 50% de la concentración de proteína, e incluso en este rango de valores es probable que sean de dudosa precisión. Mientras que el límite de detección en este extremo de la gama se puede extender un poco mediante la reducción de las concentraciones de proteína y el tinte, la sensibilidad del instrumento evitar una mayor reducción en la concentración de proteínas. Del mismo modo, el extremo superior de la sensibilidad será determinado por la solubilidad del ligando. Para obtener una estimación robusta matemáticamente para K d, es más importante para obtener datos con un 90% de la proteína presente en la forma unida al ligando, lo que requiere concentraciones de ligando a ser aproximadamente diez veces K d (suponiendo que no cooperatividad). El límite de detección será por lo tanto necesariamente una décima parte de la solubilidad del ligando en el tampón correspondiente. Esto significa que los límites de detección del método variará típicamente entre 1 M y entre 1 y 100 mM, dependiendo de la proteína y el ligando. En conclusión, fluorimetría diferencial de barrido es una técnica versátil aplicable a una amplia gama de proteínas. Utilizando los métodos presentados aquí, es posible determinar rápida y económicamente la afinidad de una proteína para diferentes ligandos. Esto tiene un gran potencial para su aplicación en la purificación de proteínas y la estabilización, la aclaración de la función o especificidad de las enzimas de metagenomes, y en el descubrimiento de fármacos, sobre todo en los pequeños laboratorios.

Todas las proteínas se unirán, con diferentes afinidades, a una gama diversa de otras moléculas de iones simples a otras macromoléculas grandes. En muchos casos, las proteínas se unen a moléculas pequeñas socios como parte de su función normal (por ejemplo, una quinasa unión a ATP). Otras interacciones pueden no estar relacionadas con la función, pero son útiles como herramientas experimentalmente (por ejemplo, pequeñas moléculas que estabilizan las proteínas para mejorar el éxito de la cristalización, o ayudar en el mantenimiento de las proteínas en solución); mientras que las moléculas pequeñas que se unen a sitios activos y los sitios alostéricos de proteínas pueden actuar como inhibidores, y así modular la actividad de las enzimas. Hay una amplia gama de técnicas que se pueden utilizar para determinar la afinidad de las proteínas para las moléculas asociadas. Calorimetría de titulación isotérmica 1 es ampliamente visto como un &quot;estándar de oro&quot;, ya que proporciona una rica información sobre las reacciones, es libre de la etiqueta, y ha limitado las oportunidades para unrtifacts del experimento. Sin embargo, a pesar de las recientes mejoras en la sensibilidad de la instrumentación y automatización de montaje experimental, todavía es relativamente caro en términos de las necesidades de proteínas, ha en el mejor de un rendimiento bajo a medio, y es el más adecuado a las interacciones con moderada a altas afinidades (10 nm a 100 M K d) 2. Otros métodos libres de etiquetas, tales como resonancia de plasmón superficial o bicapa interferometría 3 oferta rendimientos más altos, y han logrado la sensibilidad para detectar moléculas más pequeñas tan bajas como 100 Da. Sin embargo, los instrumentos de alto rendimiento para estos métodos son relativamente caros, sólo se justifican en el que habrá un caudal continuo de los proyectos pertinentes, y así es probable que sean inaccesibles para muchos laboratorios académicos. Fluorimetría diferencial de barrido (DSF, o thermofluor) fue descrita por primera vez en 2001 4 como un método para el descubrimiento de fármacos. En este method, las proteínas se incubaron con un colorante fluorescente (se utilizaron colorantes inicialmente naftaleno-sulfónico), que altera su fluorescencia tras la unión a las regiones hidrofóbicas de las proteínas. La muestra de proteína-colorante se calienta a continuación, y monitoriza la fluorescencia a medida que aumenta el calor. El despliegue de la proteína, y la exposición de las partes hidrófobas de la proteína, da lugar a un patrón característico en la fluorescencia como una función de la temperatura (Figura 1A). El experimento se puede realizar en pequeños volúmenes en cualquier instrumento PCR cuantitativa comercial, y por lo tanto en un solo experimento, un gran número de muestras se puede probar de forma simultánea (por lo general 48, 96 o 384 muestras, dependiendo del modelo de instrumento). Los experimentos pueden llevarse a cabo por lo general en torno a una hora, proporcionando la posibilidad de análisis de alto rendimiento de las muestras 5. Otras mejoras en la metodología han visto la adopción de tintes con mejores propiedades espectrales 6,7 </sup&gt;, herramientas genéricas para el análisis de datos, y sugirieron protocolos para la detección inicial de 8,9. La gama de aplicaciones del método se ha extendido, con un enfoque particular en el establecimiento de condiciones óptimas para la preparación y almacenamiento de proteínas de 10, y en la identificación de socios potenciales de unión para ayudar a la cristalización 11. El relativamente alto rendimiento del método, un costo relativamente bajo en proteínas (~ 2 g por reacción), y la aplicabilidad al estudio de moléculas de unión débiles ha hecho DSF una herramienta valiosa para el diseño de fármacos basado fragmento, especialmente en un contexto académico 12-14. A pesar de la amplia aplicación de DSF a estudiar las interacciones proteína-ligando, pocos estudios han descrito la determinación de las constantes de disociación de estos estudios. Sin embargo, éstos han tendido a producir ecuaciones detalladas que describen el desarrollo de la proteína, con muchos parámetros que deben acoplarse a la escasez de datos o en algunos casos eESTIMADA 7,15-17. Estos métodos son de especial relevancia en los casos difíciles, tales como compuestos fuertemente vinculantes, o proteínas que muestra transiciones inusuales. Sin embargo, para muchos laboratorios, estos análisis detallados son demasiado engorrosos para su uso rutinario. Por tanto, proponemos tratamientos alternativos para diferentes escenarios, y demostrar cómo estos pueden ser utilizados para ajustar los datos resultantes de las diferentes interacciones ligando-proteína. Nuestro método utiliza el instrumento StepOne qPCR, para el cual el software de análisis de datos a medida está disponible; mientras que esto acelera el análisis de datos, los resultados de otros instrumentos pueden ser procesados ​​utilizando métodos previamente publicados 9, y el mismo análisis de aguas abajo se pueden realizar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">StepOne real time PCR instrument</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4376357</td>
			<td style="width:167px;">DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Protein thermal shift software v1.0</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4466037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">MicroAmp Fast optical 48-well plates&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Optical sealing tape&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375323</td>
			<td>Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">U-bottomed 96-well plates</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td align="right">11521943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">SYPRO Orange</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S6650</td>
			<td>For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SPSS statistics version 20</td>
			<td style="width:71px;">IBM</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism 6.02</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hand applicator (PA1)</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">75-3454-4264-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td align="right">10141520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry

Una amplia gama de métodos están disponibles actualmente para la determinación de la constante de disociación entre una proteína y la interacción de moléculas pequeñas. Sin embargo, la mayoría de ellos requieren el acceso a equipos especializados, ya menudo requieren un grado de experiencia para establecer efectivamente experimentos confiables y analizar los datos. Fluorimetry diferencial de barrido (DSF) se está utilizando cada vez más como un método robusto para la selección inicial de las proteínas para interactuar pequeñas moléculas, ya sea para la identificación de socios fisiológicas o para el descubrimiento de golpe. Esta técnica tiene la ventaja de que sólo requiere una máquina de PCR adecuados para la PCR cuantitativa, y así instrumentación adecuada está disponible en la mayoría de las instituciones; una excelente variedad de protocolos ya están disponibles; y hay fuertes antecedentes en la literatura para múltiples usos del método. Un trabajo anterior ha propuesto varios medios de cálculo de constantes de disociación a partir de datos DSF, pero estos son matemáticamente exigente. Aquí, nos demtrar un método para estimar las constantes de disociación de una cantidad moderada de datos experimentales DSF. Estos datos normalmente pueden ser recogidos y analizados en un solo día. Demostramos cómo los diferentes modelos se puede utilizar para ajustar los datos recogidos de eventos de unión simples, y donde los sitios de unión o unión independientes de cooperación presentes. Por último, se presenta un ejemplo de análisis de datos en caso de que no se aplican los modelos estándar. Estos métodos se ilustran con los datos recogidos en las proteínas de control disponibles comercialmente, y dos proteínas de nuestro programa de investigación. En general, nuestro método proporciona una forma sencilla para que los investigadores ganan rápidamente una mayor comprensión de las interacciones ligando-proteína utilizando DSF.

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Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinación de las interacciones proteína-ligando Uso diferencial de barrido Fluorimetría

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

61.1K vistas.  University of Exeter. Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Video: Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Concentración de proteínas microvolumen Determinación mediante el NanoDrop 2000c Espectrofotómetro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Investigación

Biología

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinación del tejido Con el trasplante de Cap Animal (ACT) en el ensayo Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

El análisis de Schwann-astrocito interacciones utilizando In Vitro Ensayos

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Mediciones en tiempo real de proteínas de membrana: Receptor interacciones utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Recogida de esperma de calidad diferencial mediante centrifugación de gradiente de densidad

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

Uso de Caenorhabditis elegans para detectar interacciones de chaperonas específicas del tejido

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...