We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Cura&#231;ao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.

NOTA: Los reactivos que se preparen para Serial Bloquear Cara Imaging de Coral Muestras 1. Preinfiltration Cera <ol><li> Derretir 3,6 g de copos de ESTEARINA en un vaso de precipitados de vidrio. Mezclar bien en un plato caliente (60-70 ° C). </li><li> Añadir 400 mg de Sudán IV (para minimizar la cera de la fluorescencia de fondo). Mezclar bien y esperar hasta que se logre una solución transparente de color rojo. </li><li> Añadir 96 ml de parafina fundida caliente (100%) y mezclar bien. </li></ol> 1.2) Incorporación de Cera <ol><li> Derretir 7,2 g de copos de ESTEARINA en un vaso de precipitados de vidrio y mezclar bien sobre una placa caliente (60-70 ° C). </li><li> Añadir 0,8 g de Sudán IV. Mezclar bien y esperar hasta que se logre una solución transparente de color rojo. </li><li> Añadir gránulos de parafina (162 g) y mezclar hasta que la parafina se derrite por completo. </li><li> Añadir 30 g de blanco granular Vybar y fundir completamente en el mismo vaso de precipitados; una vez derretida, mezclar. </li><li> Sin apretar cerrar la botella de vidrio con una tapa. Coloque la botella de vidrio en un 60 ° C convección oven mantener los ingredientes en estado líquido. Llevar a cabo todas las infiltraciones en este horno. </li><li> Dividir el volumen total de la 200 ml de cera roja en dos frascos de vidrio de 100 ml cada uno. Utilice una alícuota para la infiltración y el otro para la incrustación final. </li></ol> 1.3) incrustación de coral Los tejidos para Serial Bloquear Cara Imaging <ol><li> Lave los pólipos de coral recogidos sobre el terreno (SI Video 1) y almacenados (3-6 meses a 4-5 ° C en paraformaldehído) en tampón fosfato salino (3x 5 min) y descalcificación cuando esté listo para ser fotografiado. Descalcifique los pólipos en solución Excal durante 24 horas o hasta que los pólipos son totalmente desprovisto de CaCO3. Incubar varios pólipos de coral descalcificada como un solo bloque en una serie 25, 50, 75, y 100% de etanol, seguido por 1x sustituto de xileno para deshidratar las muestras. </li><li> Coloca los pólipos procesados ​​en un horno C 65 ° precalentado que contiene 100% sustituto xileno. Incubar durante 30 minutos dos veces por changing a solución fresca. Orientar los pólipos de tal manera que la parte superior de los pólipos está orientado hacia abajo y la superficie superior es tan plana como sea posible. </li><li> Hacen que las soluciones de 2: 1, 1: 1, y 1: 2 xileno sustituto y cera preinfiltration (paso 1.1) en 50 ml tubos Falcon. </li><li> Incubar los pólipos de coral con estas tres concentraciones crecientes de cera preinfiltration, seguido de 3x incubación en 100% de cera preinfiltration durante 30-60 minutos cada vez. </li><li> Nota: Dependiendo del grosor de las muestras, los pasos 1.3.1-1.3.5 podrían incrementarse con períodos más largos de tiempo. </li><li> Mueva las muestras a la incrustación de cera (vea el paso 1.2.6) después de la incubación 3x en el 100% de cera preinfiltration. </li><li> Quite la cera de incrustación después de 30 min. Reemplace con cera incrustación fresco y continuar la incubación durante un mínimo de 4 horas a 65 ° C. </li></ol> 1.4) Incorporación en rojo de la cera <ol><li> Fotografiar el bloque (la bandeja de acero inoxidable donde se coloca la cera blanca y en la parte superior de la que el sample se coloca). Esto es necesario porque una vez incrustado en la cera, la ubicación de la muestra se volverá invisible como la incrustación de cera roja es opaco. </li><li> Coloque pequeñas gotas de cera de alto punto de fusión en torno al nuevo molde de inclusión acero inoxidable precalentado y deje que se enfríe. Vierta un pequeño volumen de cera de incrustación recién fundido de segundo recipiente como se indica en el paso 1.2.6. </li><li> Coloque el pólipo de coral hacia abajo rápidamente sobre el punto cera blanca, a continuación, colocar un soporte de muestra de plástico en la bandeja de acero inoxidable y se vierte cera más incrustación de manera que la cera se acerca a la superficie del molde de plástico. </li><li> Tome toda la configuración de 65 ° C horno y deje que se enfríe en un banco o una superficie fría hasta que la cera se endurece por completo. </li><li> Este proceso puede tardar 6 horas hasta uno o dos días. Coloque el bloque desecado en un refrigerador a 4 ° C, protegido de la luz, para almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 1.5) seccionamiento en la serie de configuración de bloque de la cara <ol><li> Trim la manzana y cortar 1 micras secciones usando un microtomo. No recoger los apartados tal como serán como polvo. Recuerde, estamos Imaging sólo la cara del bloque. La muestra aparece cuando la cera blanca comienza a desaparecer. </li><li> Capturar imágenes de la cara del bloque lisa que contiene la muestra cada vez que se retira una sección. Continúe hasta que el pólipo de coral desaparece como en SI Video 2. </li><li> Grabar / Captura las imágenes con una cámara monocromática utilizando un filtro fluorescente FITC para recoger la autofluorescencia del cromatóforos / coral pólipo. Imagen 3-4 núcleos descalcificados de cada especie. </li></ol> 2. Imaging corales Bajo de dos fotones microscopía de fluorescencia <ol><li> Fijar núcleos de pólipos de coral, cada uno con alrededor de 10 a 12 pólipos alrededor de una pulgada de diámetro, en el 4% de paraformaldehído en el sitio de la colección (orilla del mar) tan pronto como se recogen bajo el agua. </li><li> Mantenga las muestras a 4 ° C hasta que la imagen. Núcleos lavados se colocan en ee misma solución boca abajo en un plato con fondo de cristal cubierta (0,17 mm de grosor). </li><li> El uso de un láser de dos fotones de excitación a 780 nm, imagen 3-4 pólipos en dos diferentes aumentos (zoom digital) con un (NA 0.3) objetivo de 10X. La forma pólipo de coral y la altura varía entre las muestras (generalmente 1-2 mm) y la profundidad de formación de imágenes también está limitada por la distancia de trabajo del objetivo de formación de imágenes. </li><li> Utilice el modo de exploración de azulejos para recoger aproximadamente 25 a 100 (5 x 5 o 10 x 10 azulejos) imágenes por plano focal en xy y 50-100 imágenes a través del eje z en el intervalo de 10 o 20 micras, por un total de alrededor de 5.000-10.000 images / pólipo de coral. </li><li> Imagen en tres en cuatro ámbitos de pólipos para representar una especie de núcleo y de coral. NOTA: La imagen de tiempo de adquisición varía entre 2-5 hr área / pólipo. </li><li> Guarde todas las imágenes en formato de datos en bruto en el disco duro del sistema como LSM 5. Render 3D en un análisis de imágenes 3D y software de renderizado. </li></ol> 3. 3D Volume Rendering y Visualization de la SBIF y de dos fotones de fluorescencia espectral de datos <ol><li> Recortar los datos 2D para reducir el tamaño del archivo, centrándose en un solo pólipo utilizando la herramienta de recorte cuadrado en el programa y compilar en un solo archivo tiff (reducir el tamaño del archivo también guardando el archivo en formato de 8 bits) en el software de adquisición. </li><li> Abra los archivos reunidos de los datos recogidos (SBIF en el paso 1.5.1) o las baldosas múltiples z-pilas de secciones ópticas de dos fotones (recogidos en el paso 2.1.4) en el programa Imaris Supera módulo de bajo volumen algoritmo. </li><li> Proyectar los datos SBFI prestados en 3D usando una proyección de sombras. Crear un modo de isosuperficie donde se thresholded los voxels para crear un patrón de superficie sólida (SI vídeo 3). </li><li> Visualice las proyecciones en 3D usando un algoritmo de plano de corte en xy, xz y yz modos ortogonales para revelar la estructura 3D y la forma de los corales. </li><li> Animar las proyecciones utilizando un módulo de animación fotograma clave en el mismo programa Imaris (SI Videos 3-7). </li><li> Generar archivos de vídeo en el 5% de compresión y generar unos clips de película en formato avi usando volumen (SI Videos 4 y 6), modalidades 3D y Isosurface (SI Videos 5 y 7). </li></ol>

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The authors declare no conflict of interests.

Investigación de los arrecifes de coral es un esfuerzo de investigación altamente interdisciplinario, que involucra el análisis de la simultánea física, química, y los fenómenos biológicos que operan en el medio marino. Por lo tanto, mejor El estudio de los ecosistemas de arrecifes de coral complejos se completa dentro de un &#39;Powers of Ten&#39; marco contextual (Figura 10). Esta compilación gráfico ilustra que el ecosistema de coral cubre una amplia gama de dimensiones espaciales (10 ...

El calentamiento global y el cambio ambiental que acompaña están afectando directamente la salud y la distribución de los corales marinos tropicales 1-4. Se observan múltiples impactos, incluyendo la decoloración del coral y la aparición de enfermedades infecciosas 5-6. Sin embargo, la predicción más exacta de la futura respuesta coral a estas amenazas ambientales, será necesario que se establezca una &quot;línea de base&quot; histológico, que define la morfología del tejido y la composición celular y la distribución de los corales &quot;aparentemente sanos&quot;. A su vez, &quot;impactados&quot; corales pueden compararse cuantitativamente. Además, esta línea de base debe ser establecido para corales aparentemente sanos bajo una variedad de condiciones ambientales, por lo que &quot;respuesta saludable&quot; también se puede medir a través de gradientes ambientales. Como un primer paso hacia el establecimiento de esta línea de base, un estudio en 3D de alta resolución se ha llevado a cabo de la forma aparentemente tejido de los pólipos de coral saludablela morfología y la composición celular responde a los aumentos en la profundidad del agua (WD) y disminuciones que se acompañan en la luz del sol irradiancia. Resultados se pueden utilizar para establecer una comprensión mecanicista más completo de la adaptación de coral, así como para obtener una perspectiva de la evolución-coral simbionte y el mejoramiento de la recolección de luz. Los corales pétreos (Scleractinia) son animales invertebrados marinos coloniales que acogen a un complejo conjunto de otros microorganismos, denominados colectivamente como el coral holobionte 7-10. La investigación llevada a cabo en el presente estudio busca utilizar un conjunto de tecnologías de imagen de vanguardia para seguir simultáneamente los cambios a medida que aumenta la profundidad del agua en los tejidos y pigmentos zooxantelas de los corales anfitriones aparentemente sanos. Esto establecerá el tejido celular comparativo &quot;línea de base&quot; necesaria a través de un gradiente batimétrico para los corales aparentemente sanos y actúan como indicadores de hea corallth 10. Pigmentos de coral, llamados cromatóforos, actúan para absorber, reflejar, de dispersión, refractan, difractan, o interferir con la radiación solar incidente 11. La relación endosimbiótica-zooxantelas chromatophore ha permitido a la coevolución de estratégicamente ventajosa optimización captador de luz y las estrategias de crecimiento del esqueleto, así como la plasticidad trófica (estrategias de alimentación desplazamiento de ida y vuelta desde autotrofia a heterotrofía) para el animal coral 12. El sur de la isla caribeña de Curaçao (antes parte de las Antillas Neerlandesas) está a 65 km al norte de Venezuela dentro de la tendencia este-oeste Aruba-La Blanquilla archipiélago (Figura 1A). La costa sur de 70 kilometros de largo de Curaçao contiene una antigua franja tracto arrecife de coral continua moderno y Mioceno-Plioceno-Pleistoceno-Holoceno 13,14. SST media anual en Curazao varía de aproximadamente 3 ° C unanuamente, que van desde un mínimo de 26 ° C a finales de enero a un máximo de 29 ° C a principios de septiembre, con una temperatura media anual de 27,5 ± 0,5 º C (SST datos NOAA Establece, 2000-2010). El arrecife de coral en Playa Kalki (12 ° 22&#39;31.63 &quot;N, 69 ° 09&#39;29.62&quot; W), situada cerca de la punta noroeste de Curazao (Figura 1A), fue elegido para el muestreo, ya que ha sido previamente bien estudiado y la ecosistema marino en este lugar se baña en el agua de mar fresca 7,15-19 no contaminados. . Dos especies de coral escleractinios estrechamente relacionados, M. annularis y M faveolata, fueron elegidos para la experimentación y el análisis en este estudio porque cada especie: (1) exposiciones muy diferentes y que no se superponen las distribuciones batimétricas en el tracto arrecife con respecto al borde de la plataforma y la ambientes de depósito sedimentario carbonato asociados (rango annularis M. = 0-10 m WD; M. faveolatarango = 10-20 m WD 20; las figuras 1B, 2A, y 2B); (2) es un coral común constructor marco de arrecifes en todo el Mar Caribe 21; y (3) tiene bien estudiado ecológica, fisiológica y relaciones evolutivas 22. Muestreo de campo para el presente estudio se llevó a cabo usando técnicas estándar de buceo SCUBA en alta mar de Playa Kalki en Curazao. A batimétrico agua transecto-superficial-a lo profundo se estableció que corrió a través de la plataforma, el talud continental, y en los ambientes del arrecife frontal en aguas profundas. Al parecer, luego se identificaron cabezas de coral saludable para el muestreo a lo largo de este transecto batimétrico, incluyendo: (1) tres individuales ~ 1 m cabezas de coral diámetro de M. annularis, todos los cuales estaban en 5 m de profundidad de agua (WD); y (2) tres individuales ~ 1 m cabezas de coral diámetro de M. faveolata, todos los cuales estaban en 12 m WD. Radiación fotosintéticamente activa (PAR) se midió como 33-36% de PAR en 5 m WD y 18-22% PAR a 10 m WD. El muestreo se llevó a cabo en enero, cuando la SST fue de 26 ° C en las profundidades marinas de ambos extremos, 5 my 12 m. Cada uno de estos seis cabezas de coral se tomaron muestras por triplicado en las posiciones espaciales equivalentes (es decir., Aproximadamente 45 ° de latitud norte en cada una de las seis cabezas de coral hemisféricas). Cada muestra individual consistía en una biopsia de 2,5 cm de diámetro coral esqueleto de tejido de núcleo que se recogió con un arco punch limpiado. Tres biopsias de tejido esqueleto de coral se muestrearon en SCUBA estándar con las manos enguantadas de cada una de las cabezas de coral (9 de M. annularis colonias a 5 m WD y 9 de M. faveolata a 12 m WD). Inmediatamente después de la recolección en profundidad, cada muestra de biopsia de núcleo se colocó en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml estéril, con tapa de rosca sellado, y volvió a la superficie. El agua de mar se decantó de cada tubo de centrífuga y luego cada uno de biopsia de núcleo se sumergió, almacenada y transportada en 4% de paraformaldehído. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; imágenes SBFI previamente se ha realizado en una amplia gama de muestras biológicas, incluyendo todo el cerebro y los tejidos humanos de todo el corazón, los embriones de ratón intactas, embriones de pez cebra, y múltiples tipos de muestras de animales con huesos intactos 23-30. La mayoría de estos estudios utilizaron microscopía óptica / luz, ya sea con fluorescencia o técnicas de campo claro. Sin embargo, se han realizado estudios en ultra-grandes aumentos utilizando imágenes de la cara del bloque de serie electrónico de barrido en el pasado 31. En el presente estudio, un protocolo SBFI modificado ha sido desarrollado para y se aplica a los corales por primera vez. Debido a que M. annularis y M. pólipos de coral faveolata son de 1-2 mm de espesor, ninguna de las técnicas de microscopía de luz de rutina sería capaz de penetrar todo el espesor del tejido de los pólipos de coral. Por lo tanto, tenemos SBFI protocolo de preparación de muestra diseñada específicamente para muestras de coral. Además, hemos diseñado a medida un soporte estereoscópico, Que está motorizado para moverse en ambas direcciones x e y. Este aparato toma imágenes de la cara del bloque de la muestra en lugar de la recogida de las secciones usando un microtomo regular en frente del microscopio. También hemos introducido otra técnica microscópica de dos fotones óptica no lineal a la imagen los mismos pólipos de coral a través de todo el espesor de los tejidos de coral. Esto supera las limitaciones impuestas por la SBIF en términos de la descalcificación y la posibilidad de cambios en la morfología de los tejidos y el volumen (contracción) que pueden ser inducidas por la preparación de muestras (deshidratación) y protocolos de tratamiento. Además, los perfiles de emisión de los corales fueron resueltos espectralmente para identificar sus picos de emisiones y las variaciones entre los cromatóforos y las zooxantelas fotosintética. Estos resultados se evaluaron en el contexto del método utilizado y sus ventajas individuales con respecto a tiempo de adquisición, el tiempo de análisis, y la capacidad de resolver detalles finos estructurales sin comprometer strintegridad uctural del tejido del coral.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coral Tissue Skeleton</td>
			<td>None</td>
			<td>None</td>
			<td>2.5 cm Biopsy from natural habitat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arch Punch Coring Device</td>
			<td>C.S. Osborne and Company</td>
			<td>No. 149</td>
			<td>For Coral biopsy collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15700</td>
			<td>16% Pre-diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear/Safeclear II</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 64111-04</td>
			<td>Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene and Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Richard Allen Scientific</td>
			<td>Type H REF 8338</td>
			<td>Infiltration solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybar</td>
			<td>The Candle Maker</td>
			<td>None</td>
			<td>Component of Red Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stearin</td>
			<td>The Candle Maker</td>
			<td>None</td>
			<td>Component of Red Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S667-25</td>
			<td>Red Wax-Opaque background</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin (WGA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>W32466</td>
			<td>For labeling&#160; Coral Mucus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36095</td>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD-35-100</td>
			<td>For two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Motor, Driver and Controller</td>
			<td>Lin Engineering</td>
			<td>211-13-01R0, R325, R256-RO</td>
			<td>XY Translational Movement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>DC-220</td>
			<td>Melting all wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convection Oven</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>DX-600</td>
			<td>Infiltration and Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ASP 300</td>
			<td>Dehydration, Infiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2055</td>
			<td>Disposable knifes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stereolumar V 12</td>
			<td>1.5x (30 mm WD) Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope with ApoTome</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axiovert M 200, ApoTome I System</td>
			<td>Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiocam camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>MRm</td>
			<td>Monochrome camera 1388x1040 pixels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Version 4.8</td>
			<td>Image acquisition program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Photon Laser</td>
			<td>Spectraphysics</td>
			<td>Maitai eHP, pulsed laser (70 fs)</td>
			<td>With DeepSee module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 710 with Spectral Detector</td>
			<td>34 channel PMT detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>2010 or above</td>
			<td>for two-photon and spectral image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Suite Software</td>
			<td>Bitplane, Inc.,</td>
			<td>Version 7.0 or above</td>
			<td>3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal optical microscopy methods reveal polyp tissue morphology and structure in caribbean reef building corals

Un conjunto integrado de las técnicas de imagen se ha aplicado para determinar la morfología tridimensional (3D) y la estructura celular de los tejidos de los pólipos que comprende la corales constructores de arrecifes del Caribe Montastraea annularis y M. faveolata. Estos enfoques incluyen microscopía de fluorescencia (FM), la cara de bloque serial de formación de imágenes (SBFI), y de dos fotones microscopía de barrido láser confocal (TPLSM). SBFI proporciona imágenes de tejido profundo después de seccionamiento física; se detalla la textura de la superficie del tejido y la visualización 3D a profundidades de tejido de más de 2 mm. FM complementaria y rendimiento TPLSM imágenes de ultra-alta resolución de la estructura celular del tejido. Los resultados han: (1) identificaron morfologías no reportados previamente tejido lobulados en la pared exterior de los pólipos de coral individuales y (2) creado el primer mapa de la superficie de la densidad de la distribución y el tejido 3D de cromatóforos y endosimbiontes zooxantelas dinoflagelado similares a algas. Guisante absorción espectralks de 500 nm y 675 nm, respectivamente, sugieren que M. annularis y M. faveolata contienen tipos similares de clorofila y cromatóforos. Sin embargo, M. annularis y M. faveolata exhibir diferencias significativas en la densidad del tejido y la distribución 3D de estos componentes celulares clave. Este estudio se centra en los métodos de imagen indica que SBFI es extremadamente útil para el análisis de grandes muestras mm escala de tejidos de coral descalcificar. FM cortesía y TPLSM revelan cambios sutiles escala submilimétrica en la distribución celular y la densidad en muestras de tejido de coral nondecalcified. La técnica TPLSM proporciona: (1) la preparación mínimamente invasiva de la muestra, (2) la capacidad de seccionamiento óptico superior, y (3) la absorción de luz mínima y la dispersión, permitiendo al mismo tiempo de formación de imágenes de tejido profundo.

Un aparato SBFI diseñado a medida (fabricado específicamente para el presente estudio, figura 3) produjo los primeros mapas detallados 3D digitales de elevación (DEM) de la textura de la superficie exterior y la morfología de la M. annularis y M. Los pólipos de coral faveolature (Figura 4 y SI Videos 1-2). Esto produjo imágenes de lóbulos apilados previamente no descrita de tejido coralino concéntricamente irradia hacia fuera del centr...

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Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Un conjunto integrado de las técnicas de imagen se ha aplicado para determinar la morfología de pólipo y estructura de los tejidos en el Caribe corales Montastraea annularis y M. faveolata. Fluorescencia, cara del bloque de serie y de dos fotones del láser confocal de barrido microscopía han identificado la estructura lobulada, paredes de pólipos, y chromatophore estimado y las densidades de zooxantelas y distribuciones.

Multimodales ópticos Métodos Microscopía Reveal Polyp Tissue Morfología y Estructura del Caribe del filón de construcción corales

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

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Research

JoVE Journal

Environment

12.2K vistas.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Un conjunto integrado de las técnicas de imagen se ha aplicado para determinar la morfología de pólipo y estructura de los tejidos en el Caribe corales Montastraea annularis y M. faveolata. Fluorescencia, cara del bloque de serie y de dos fotones del láser confocal de barrido microscopía han identificado la estructura lobulada, paredes de pólipos, y chromatophore estimado y las densidades de zooxantelas y distribuciones. 

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Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of natural proteins have a molecular mass between 40 - 200 kDa1,2, a robust and high-throughput method with a nanometer resolution capability is needed. Negative staining (NS) electron microscopy (EM) is an easy, rapid, and qualitative approach which has frequently been used in research laboratories to examine protein structure and protein-protein interactions. Unfortunately, conventional NS protocols often generate structural artifacts on proteins, especially with lipoproteins that usually form presenting rouleaux artifacts. By using images of lipoproteins from cryo-electron microscopy (cryo-EM) as a standard, the key parameters in NS specimen preparation conditions were recently screened and reported as the optimized NS protocol (OpNS), a modified conventional NS protocol 3 . Artifacts like rouleaux can be greatly limited by OpNS, additionally providing high contrast along with reasonably high&#8208;resolution (near 1 nm) images of small and asymmetric proteins. These high-resolution and high contrast images are even favorable for an individual protein (a single object, no average) 3D reconstruction, such as a 160 kDa antibody, through the method of electron tomography4,5. Moreover, OpNS can be a high&#8208;throughput tool to examine hundreds of samples of small proteins. For example, the previously published mechanism of 53 kDa cholesteryl ester transfer protein (CETP) involved the screening and imaging of hundreds of samples 6. Considering cryo-EM rarely successfully images proteins less than 200 kDa has yet to publish any study involving screening over one hundred sample conditions, it is fair to call OpNS a high-throughput method for studying small proteins. Hopefully the OpNS protocol presented here can be a useful tool to push the boundaries of EM and accelerate EM studies into small protein structure, dynamics and mechanisms.

More than half of proteins are small proteins (molecular mass &#60;200 kDa) that are challenging for both electron microscope imaging and three-dimensional reconstructions. Optimized negative staining is a robust and high-throughput protocol to obtain high contrast and relatively high resolution (~1 nm) images of small asymmetric proteins or complexes under different physiological conditions.

Optimizado tinción negativa: un protocolo de alto rendimiento para el examen de Estructura Pequeña y asimétrica de proteínas por Microscopía Electrónica

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Investigación

Medio ambiente

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

Los métodos de remuestreo del suelo para controlar los cambios en las concentraciones químicas de los suelos forestales

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Building Double-decker Traps for Early Detection of Emerald Ash Borer

Emerald ash borer (EAB) (Agrilus planipennis Fairmaire), the most destructive forest insect to have invaded North America, has killed hundreds of millions of forest and landscape ash (Fraxinus spp.) trees. Several artificial trap designs to attract and capture EAB beetles have been developed to detect, delineate, and monitor infestations. Double-decker (DD) traps consist of two corrugated plastic prisms, one green and one purple, attached to a 3 m tall polyvinyl chloride (PVC) pipe supported by a t-post. The green prism at the top of the PVC pipe is baited with cis-3-hexenol, a compound produced by ash foliage. Surfaces of both prisms are coated with sticky insect glue to capture adult EAB beetles. Double-decker traps should be placed near ash trees but in open areas, exposed to sun. Double-decker trap construction and placement are presented here, along with a summary of field experiments demonstrating the efficacy of DD traps in capturing EAB beetles. In a recent study in sites with relatively low EAB densities, double-decker traps captured significantly more EAB than green or purple prism traps or green funnel traps, all of which are designed to be suspended from a branch in the canopy of ash trees. A greater percentage of double decker traps were positive, i.e., captured at least one EAB, than the prism traps or funnel traps that were hung in ash tree canopies.

Effective traps to attract and capture the emerald ash borer (EAB) are a key element of detecting and managing this invasive pest. Double-decker traps, placed in full sun near ash trees, incorporate visual and olfactory cues and were more likely to capture EAB than other trap designs in field trials.

Edificio de dos pisos trampas para la detección temprana del barrenador esmeralda del Fresno

Emerald ash borer (EAB) (Agrilus planipennis Fairmaire), the most destructive forest insect to have invaded North America, has killed hundreds of millions ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol for performing in situ juvenile exposure tests within oligotrophic river catchments over one-month and three-month periods. Two methods (in both modifications) are presented to evaluate the juvenile growth and survival rate. The methods and modifications differ in value for the locality bioindication and each has its benefits as well as limitations. The sandy cage method works with a large set of individuals, but only some of the individuals are measured and the results are evaluated in bulk. In the mesh cage method, the individuals are kept and measured separately, but a low individual number is evaluated. The open water exposure modification is relatively easy to apply; it shows the juvenile growth potential of sites and can also be effective for water toxicity testing. The within-bed exposure modification needs a high workload but is closer to the conditions of a natural juvenile environment and it is better for reporting the real suitability of localities. On the other hand, more replications are needed in this modification due to its high-hyporheic environment variability.

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

In situ bioindications enable determination of the suitability of an environment for endangered mussel species. We describe two methods based on the juvenile exposure of freshwater pearl mussels in cages to oligotrophic river habitats. Both methods are implemented in variants for open water and hyporheic water environments.

Bioindicación para el examen de idoneidad del entorno de corriente joven agua dulce mejillones utilizando métodos de exposición In Situ de la perla

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular substrates offer key advantages over cell-based aAPC, including precise control of signal presentation parameters and physical properties of the aAPC surface to modulate its interactions with T cells. aAPC constructed from anisotropic particles, particularly ellipsoidal particles, have been shown to be more effective than their spherical counterparts at stimulating T cells due to increased binding and larger surface area available for T cell contact, as well as reduced nonspecific uptake and enhanced pharmacokinetic properties. Despite increased interest in anisotropic particles, even widely accepted methods of generating anisotropic particles such as thin-film stretching can be challenging to implement and use reproducibly.
To this end, we describe a protocol for the rapid, standardized fabrication of biodegradable anisotropic particle-based aAPC with tunable size, shape, and signal presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo, along with methods to characterize their size, morphology, and surface protein content, and to assess their functionality. This approach to fabricating anisotropic aAPC is scalable and reproducible, making it ideal for generating aAPC for &#34;off-the-shelf&#34; immunotherapies.

Here, we present a protocol to quickly and reproducibly generate biologically inspired, biodegradable articifical antigen presenting cells (aAPC) with tunable size, shape, and surface protein presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo.

Fabricación de Anisotropic antígeno Artificial polimérico que presenta las células para la activación de células T CD8 +

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm morphogenesis, that is the structural diversification of biofilms during community assembly, represents a remarkable challenge across spatial and temporal scales. Here, we present an automated biofilm imaging system based on optical coherence tomography (OCT). OCT is an emerging imaging technique in biofilm research. However, the amount of data that currently can be acquired and processed hampers the statistical inference of large scale patterns in biofilm morphology. The automated OCT imaging system allows covering large spatial and extended temporal scales of biofilm growth. It combines a commercially available OCT system with a robotic positioning platform and a suite of software solutions to control the positioning of the OCT scanning probe, as well as the acquisition and processing of 3D biofilm imaging datasets. This setup allows the in situ and non-invasive automated&#160;monitoring of biofilm development and may be further developed to couple OCT imaging with macrophotography and microsensor profiling.

Microbial biofilms form complex architectures at interphases and develop into highly scale-dependent spatial patterns. Here, we introduce an experimental system (hard- and software) for the automated acquisition of 3D optical coherence tomography (OCT) datasets. This toolset allows the non-invasive and multi-scale characterization of biofilm morphogenesis in space and time.

Tomografía de coherencia óptica 3D automatizada para dilucidar la morfogénesis de Biofilm a grandes escalas espaciales

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm ...

Split Point Analysis and Uncertainty Quantification of Thermal-Optical Organic/Elemental Carbon Measurements

Researchers from myriad fields frequently seek to quantify and classify concentrations of carbonaceous aerosols as organic carbon (OC) or elemental carbon (EC). This is commonly accomplished using thermal-optical OC/EC analyzers (TOAs), which enable measurement via controlled thermal pyrolysis and oxidation under specific temperature protocols and within constrained atmospheres. Several commercial TOAs exist, including a semi-continuous instrument that enables on-line analyses in the field. This instrument employs an in-test calibration procedure that requires relatively frequent calibration. This article details a calibration protocol for this semi-continuous TOA and presents an open-source software tool for data analysis and rigorous Monte Carlo quantification of uncertainties. Notably, the software tool includes novel means to correct for instrument drift and identify and quantify the uncertainty in the OC/EC split point. This is a significant improvement on the uncertainty estimation in the manufacturer&#8217;s software, which ignores split point uncertainty and otherwise uses fixed equations for relative and absolute errors (generally leading to under-estimated uncertainties and often yielding non-physical results as demonstrated in several example data sets). The demonstrated calibration protocol and new software tool enabling accurate quantification of combined uncertainties from calibration, repeatability, and OC/EC split point are shared with the intent of assisting other researchers in achieving better measurements of OC, EC, and total carbon mass in aerosol samples.

This article presents a protocol and software tool for the quantification of uncertainties in the calibration and data analysis of a semi-continuous thermal-optical organic/elemental carbon analyzer.

Análisis de puntodividido y cuantificación de la incertidumbre de las mediciones de carbono orgánico/elemental térmico-óptico

Researchers from myriad fields frequently seek to quantify and classify concentrations of carbonaceous aerosols as organic carbon (OC) or elemental carbon ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Estimación del índice de área hoja utilizando tres métodos distintos en soportes caducifolios puros

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

Bacterias etiquetadas fluorescentes como un rastreador para revelar nuevos caminos de flujo de carbono orgánico en ecosistemas acuáticos

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, or proteostasis. Caenorhabditis elegans occupies a unique and powerful niche for HSR research because the HSR can be assessed at the molecular, cellular, and organismal levels. Therefore, changes at the molecular level can be visualized at the cellular level and their impacts on physiology can be quantitated at the organismal level. While assays for measuring the HSR are straightforward, variations in the timing, temperature, and methodology described in the literature make it challenging to compare results across studies. Furthermore, these issues act as a barrier for anyone seeking to incorporate HSR analysis into their research. Here, a series of protocols is&#160;presented for measuring induction of the HSR in a robust and reproducible manner with RT-qPCR, fluorescent reporters, and an organismal thermorecovery assay. Additionally, we show that a widely used thermotolerance assay is not dependent on the well-established master regulator of the HSR, HSF-1, and therefore should not be used for HSR research. Finally, variations in these assays found in the literature are discussed and best practices are proposed to help standardize results across the field, ultimately facilitating neurodegenerative disease, aging, and HSR research.

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Here, standardized protocols are presented to assess induction of the heat shock response (HSR) in Caenorhabditis elegans using RT-qPCR at the molecular level, fluorescent reporters at the cellular level, and thermorecovery at the organismal level.

Métodos estandarizados para medir la inducción de la respuesta de choque térmico en Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...