We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Cura&#231;ao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.

NOTA: I reagenti devono essere preparati per Serial Block Volto Imaging di Coral Campioni 1 Preinfiltration Cera <ol><li> Sciogliere 3,6 g di fiocchi stearina in un bicchiere di vetro. Mescolare bene su una piastra calda (60-70 ° C). </li><li> Aggiungere 400 mg di Sudan IV (per ridurre al minimo la cera fluorescenza di fondo). Mescolare bene e attendere fino ad ottenere una soluzione trasparente rosso. </li><li> Aggiungere 96 ml di paraffina fusa a caldo (100%) e mescolare bene. </li></ol> 1.2) Embedding Wax <ol><li> Sciogliere 7,2 g di fiocchi stearina in un bicchiere di vetro e mescolare bene su una piastra calda (60-70 ° C). </li><li> Aggiungere 0,8 g di Sudan IV. Mescolare bene e attendere fino ad ottenere una soluzione trasparente rosso. </li><li> Aggiungere granuli di paraffina (162 g) e mescolare fino a quando la paraffina si scioglie completamente. </li><li> Aggiungere 30 g del bianco granulare Vybar e sciogliere completamente nello stesso bicchiere; una volta sciolto, mescolare. </li><li> Liberamente chiudere la bottiglia di vetro con un coperchio. Posizionare la bottiglia di vetro in un 60 ° C convezione ovit per mantenere gli ingredienti in uno stato liquido. Effettuare tutte le infiltrazioni di questo forno. </li><li> Dividere il volume totale della cera rossa 200 ml in due bottiglie di vetro da 100 ml. Utilizzare una aliquota di infiltrazione e l&#39;altro per l&#39;incorporamento finale. </li></ol> 1.3) Incorporare Coral tessuti per Serial Block Viso Imaging <ol><li> Lavare i polipi di corallo raccolti sul campo (SI Video 1) e memorizzati (3-6 mesi a 4-5 ° C in paraformaldeide) in tampone fosfato (3x 5 min) e decalcificazione quando è pronto per essere ripreso. Disincrostare il polipi in soluzione Excal per 24 ore o fino a quando i polipi sono totalmente prive di CaCO 3. Incubare diversi polipi di corallo decalcificata da un singolo blocco di una serie di 25, 50, 75 e 100% etanolo, seguito da 1x sostituto dello xilene a disidratare i campioni. </li><li> Posizionare i polipi trattati in preriscaldato a 65 ° C forno contenente 100% sostituto di xilene. Incubare per 30 minuti due volte da Changing di soluzione fresca. Orientare i polipi in modo tale che la parte superiore dei polipi rivolto verso il basso e la superficie superiore è più piatta possibile. </li><li> Fate soluzioni di 2: 1, 1: 1, e 1: 2 sostituto di xilene e cera preinfiltration (passo 1.1) in 50 ml provette Falcon. </li><li> Incubare polipi corallini con queste tre concentrazioni crescenti di cera preinfiltration, seguita da 3x incubazione in cera preinfiltration 100% per 30-60 minuti ogni volta. </li><li> Nota: A seconda dello spessore dei campioni, a pochi passi 1.3.1-1.3.5 potrebbero essere aumentati con periodi di tempo più lunghi. </li><li> Spostare i campioni per l&#39;incorporamento di cera (vedi punto 1.2.6), dopo incubazione 3x in cera preinfiltration 100%. </li><li> Rimuovere la cera embedding dopo 30 min. Sostituire con cera incorporamento fresco e continuare l&#39;incubazione per un minimo di 4 ore a 65 ° C. </li></ol> 1.4) Incorporare in cera rossa <ol><li> Fotografare il blocco (vassoio in acciaio inox dove la cera bianca è posto e sulla cui sommità della samPLE è collocato). Ciò è necessario perché una volta incorporato nella cera, la posizione del campione diventa invisibile come la cera rossa incorporamento è opaco. </li><li> Mettere piccole gocce di cera alto punto di fusione intorno al nuovo in acciaio inox stampo embedding preriscaldato e lasciarlo raffreddare. Versare una piccola quantità di cera appena fuso integrazione da secondo contenitore, come indicato al punto 1.2.6. </li><li> Posizionare il polipo di corallo rivolto verso il basso rapidamente sopra il puntino cera bianca, quindi inserire un portacampioni plastica sul vassoio di acciaio inossidabile e versare cera più incorporamento in modo che la cera si avvicina alla superficie dello stampo di plastica. </li><li> Prendere l&#39;intera impostazione di 65 ° C forno e lasciare raffreddare su una panchina o su una superficie fredda fino a quando la cera si indurisce completamente. </li><li> Questo può richiedere fino a 6 ore giorno o due. Posizionare il blocco essiccata in frigorifero a 4 ° C, al riparo dalla luce, per la conservazione a lungo termine. </li></ol> 1.5) il sezionamento a Serial Setup Block Viso <ol><li> Trim il blocco e tagliare 1 micron sezioni con un microtomo. Non raccogliere le sezioni in cui diventerà come polvere. Ricordate, stiamo Imaging solo il volto blocco. Il campione appare quando la cera bianca comincia a scomparire. </li><li> Cattura immagini del viso liscia blocco che contiene il campione ogni volta che una sezione viene rimosso. Continuare fino a quando il polipo del corallo scompare come in SI Video 2. </li><li> Record / Cattura le immagini con una macchina fotografica in bianco e nero usando un filtro fluorescente FITC per prendere l&#39;auto-fluorescenza del cromatofori / corallo polipo. Immagine 3-4 nuclei decalcificati di ciascuna specie. </li></ol> 2. Imaging Coralli Sotto due fotoni microscopia a fluorescenza <ol><li> Fissare nuclei polipo di corallo, ciascuno contenente circa 10-12 polipi di circa un centimetro di diametro, in 4% paraformaldeide presso il sito di raccolta (riva del mare) non appena vengono raccolte sotto l&#39;acqua. </li><li> I campioni a 4 ° C fino imaging. Nuclei Lavato sono collocati in the stessa soluzione a testa in giù in un piatto fondo di vetro di copertura (spessore di 0,17 millimetri). </li><li> Utilizzando un laser a due fotoni a 780 nm di eccitazione, immagine 3-4 polipi in due diversi ingrandimenti (zoom digitale) con un (NA 0,3) obiettivo 10X. La forma dei polipi del corallo e l&#39;altezza varia tra i campioni (di solito 1-2 mm) e la profondità delle immagini è anche limitata dalla distanza di lavoro del oggettivo di imaging. </li><li> Utilizzare la modalità di scansione tegola per la raccolta di circa 25-100 (5 x 5 o 10 x 10 piastrelle) immagini al piano focale di 50-100 xy e immagini attraverso l&#39;asse Z a intervalli di 10 o 20 micron, un totale di circa 5.000-10.000 immagini / polipi del corallo. </li><li> Immagine 3-4 aree polipo per rappresentare una specie di base e corallo. NOTA: L&#39;immagine tempo di acquisizione varia tra 2-5 hr zona / polipo. </li><li> Memorizzare tutte le immagini in formato RAW in disco rigido del sistema LSM 5 rendering 3D in una analisi di immagini 3D e software di rendering. </li></ol> 3. 3D Volume Rendering e Visualization di SBFI e due fotoni Spectral fluorescenza dati <ol><li> Ritagliare i dati 2D per ridurre la dimensione del file, concentrandosi su un singolo polipo utilizzando lo strumento di ritaglio quadrato nel programma e compilare come un unico file tiff (ridurre le dimensioni del file anche salvando il file in formato 8 bit) nel software di acquisizione. </li><li> Aprire i file montati dei dati SBFI (raccolti nella fase 1.5.1) o le piastrelle più z-pile di sezioni ottiche a due fotoni (raccolti nella fase 2.1.4) nel programma Imaris modulo Surpass sotto algoritmo di volume. </li><li> Proiettare i dati SBFI resi in 3D utilizzando una proiezione dell&#39;ombra. Creare una modalità isosurface dove i voxel sono thresholded per creare un modello di superficie solida (SI Video 3). </li><li> Visualizza le proiezioni in 3D utilizzando un algoritmo piano di ritaglio a xy, xz, yz e modalità ortogonali per rivelare la struttura 3D e la forma dei coralli. </li><li> Animare le proiezioni con un modulo di un&#39;animazione fotogramma chiave nello stesso programma Imaris (SI Videos 3-7). </li><li> Generare i file video al 5% di compressione e generare un clip filmato in formato avi utilizzando il volume (SI Video 4 e 6), 3D e Isosurface modalità (SI Video 5 e 7). </li></ol>

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	<li>Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -. K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , 1535 (2013).</li><li>Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Coral Reefs &amp; Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, (2004).</li><li>Wilkinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Status of coral reefs of the world. , 1-2 (2004).</li><li>Lough, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climate+records+from+corals.">Climate records from corals.</a> WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).</li><li>Harvell, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropical+Archaea:+diversity+associated+with+the+surface+microlayer+of+corals.">Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals.</a> Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).</li><li>Rosenberg, E., Loya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Coral Health and Disease. , (2004).</li><li>Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+bacteria+associated+with+the+Caribbean+coral+Montastrea+franksi.">Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi.</a> Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).</li><li>Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+bacterial+communities+between+seawater+and+healthy,+black+band+diseased,+and+dead+coral+surfaces.">Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).</li><li>Stanley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+modern+corals+and+their+early+history.">The evolution of modern corals and their early history.</a> Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).</li><li>Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Change+in+zooxanthellae+and+mucocyte+tissue+density+as+an+adaptive+response+to+environmental+stress+by+the+coral+Montastraea+annularis.">Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis.</a> Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).</li><li>Stanley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosymbiosis+and+the+evolution+of+modern+coral+reefs.">Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs.</a> Evolution. 1, 3 (2006).</li><li>Gordon, B. R., Leggat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiodinium&#8212;Invertebrate+Symbioses+and+the+Role+of+Metabolomics.">Symbiodinium&#8212;Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics.</a> Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).</li><li>Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatophore+system+in+the+hermatypic,+deep-water+coral+Leptoseris+fragilis+(Anthozoa:+Hexacorallia).">A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia).</a> Marine Biology. 89, 143-147 (1994).</li><li>Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronostratigraphy+and+dolomitization+of+the+Seroe+Domi+Formation,+Curacao,+Netherlands+Antilles.">Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles.</a> Facies. 35, 293-320 (1996).</li><li>Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacteria+associated+with+coral+black+band+disease+in+Caribbean+and+Indo-Pacific+reefs.">Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).</li><li>Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+community+associated+with+black+band+disease+in+corals.">The bacterial community associated with black band disease in corals.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).</li><li>Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differential+gene+expression+in+bacteria+associated+with+coral+black+band+disease+using+RNA-arbitrarily+primed+PCR.">Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).</li><li>Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+communities+inhabiting+the+healthy+tissues+of+two+Caribbean+reef+corals:+interspecific+and+spatial+variation.">Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation.</a> Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).</li><li>Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+microbial+communities,+zooxanthellae,+and+mucus+along+gradients+of+seawater+depth+and+coastal+pollution.">Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution.</a> Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).</li><li>van Duyl, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , (1985).</li><li>Carricart-Ganivet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+surface+temperature+and+the+growth+of+the+West+Atlantic+reef+building+coral+Montastraea+annularis.">Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis.</a> J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).</li><li>Barnes, D. J., Lough, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+skeletons:+Storage+and+recovery+of+environmental+information.">Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information.</a> Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).</li><li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+volume+data+by+episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos.">Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).</li><li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+heart+development+using+high-resolution+episcopic+microscopy.">Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).</li><li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedding+embryos+for+episcopic+fluorescence+image+capturing+(EFIC).">Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).</li><li>Rosenthal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+high+resolution+three+dimensional+reconstruction+of+embryos+with+episcopic+fluorescence+image+capture.">Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture.</a> Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).</li><li>Slyfield, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+surface+texture+visualization+of+bone+tissue+through+epifluorescence-based+serial+block+face+imaging.">Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging.</a> J. Microsc. 236, 52-59 (2009).</li><li>Weninger, W., Mohun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+transgenic+embryos:+a+rapid+3-D+screening+method+based+on+episcopic+fluorescence+image+capturing.">Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing.</a> Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).</li><li>Weninger, W., Mohun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , 35-46 (2007).</li><li>Gerneke, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+imaging+microscopy+using+an+ultramiller+for+large+volume+3D+reconstruction+of+wax-and+resin-embedded+tissues.">Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues.</a> Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Salih, A., Larkum, A., Cox, G., K&#252;hl, M., Hoegh-Guldberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+pigments+in+corals+are+photoprotective.">Fluorescent pigments in corals are photoprotective.</a> Nature. 408, 850-853 (2000).</li><li>Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+surface+texture+and+shape+of+pollen:+A+comparison+of+microscopy+techniques.">Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques.</a> PloS one. 7 (6), (2012).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li></ol>

The authors declare no conflict of interests.

Ricerca barriera corallina è uno sforzo di ricerca fortemente interdisciplinare, che coinvolge l&#39;analisi della simultanea fisiche, chimiche e fenomeni biologici che operano in ambiente marino. Lo studio di complessi ecosistemi delle barriere coralline è quindi meglio completata entro un &#39;Powers of Ten&#39; quadro contestuale (Figura 10). Questa grafica compilation dimostra che l&#39;ecosistema corallo copre una vasta gamma di dimensioni spaziali (10 -9 a 10 5 m). Inoltre,...

Il riscaldamento globale e di accompagnamento cambiamenti ambientali stanno interessando direttamente la salute e la distribuzione dei coralli tropicali marini 1-4. Sono stati osservati effetti multipli, tra cui sbiancamento dei coralli e la comparsa di malattie infettive 5-6. Tuttavia, la previsione più accurata della futura risposta corallo a queste minacce ambientali richiede che una &quot;linea di base&quot; istologica essere stabilito, che definisce la morfologia dei tessuti e la composizione delle cellule e la distribuzione dei coralli &quot;apparentemente sani&quot;. A sua volta, &quot;influenzati&quot; coralli possono quindi essere confrontati quantitativamente. Inoltre, dovrebbe essere stabilito questa linea di base per i coralli apparentemente sani in una varietà di condizioni ambientali, in modo che &quot;la risposta sana&quot; può essere misurato attraverso gradienti ambientali. Come primo passo verso la creazione di questa linea di base, uno studio 3D ad alta risoluzione è stata intrapresa di come apparentemente polipo tessuto del corallo sanomorfologia e composizione cellulare risponde agli aumenti di profondità d&#39;acqua (WD) e diminuzioni di accompagnamento alla luce del sole irraggiamento. I risultati possono poi essere utilizzati per stabilire una più completa comprensione meccanicistica di adattamento corallo, nonché al fine di conoscere l&#39;evoluzione corallo simbionte e il miglioramento della raccolta della luce. Coralli duri (Scleractinia) sono coloniali animali invertebrati marini che ospitano un complesso assemblaggio di altri microrganismi, indicate collettivamente come il corallo holobiont 7-10. La ricerca condotta nel presente studio si propone di utilizzare una suite di tecnologie di imaging all&#39;avanguardia per monitorare contemporaneamente le modifiche con l&#39;aumentare della profondità dell&#39;acqua nei tessuti e pigmenti zooxantelle simbionti dei coralli ospitanti apparentemente sani. Questo stabilirà il tessuto comparativa cella &quot;di base&quot; necessaria attraverso un gradiente batimetrico per i coralli apparentemente sani e fungono da indicatori di corallo health 10. Pigmenti corallo, chiamato cromatofori, agiscono per assorbire, riflettere, dispersione, rifrangere, diffrangere, o in altro modo interferire con radiazione solare incidente 11. Il rapporto endosimbiontica zooxantelle-chromatophore ha permesso la coevoluzione di strategicamente vantaggiosa ottimizzazione della luce-raccolta e strategie di crescita scheletrica, nonché di plasticità trofica (strategie di alimentazione spostando avanti e indietro da autotrofia a eterotrofia) per il corallo animale 12. Il sud dei Caraibi isola nazione di Curaçao (ex parte delle Antille olandesi) si trova a circa 65 km a nord del Venezuela nel nord-ovest trend Aruba-La Blanquilla arcipelago (Figura 1A). Il lungo 70 km costa meridionale di Curaçao contiene un continuo moderno e Miocene-Pliocene-Pleistocene-Olocene antico fringing reef di corallo tratto 13,14. SST media annuale su Curaçao varia di circa 3 ° C unnualmente, che vanno da un minimo di 26 ° C alla fine di gennaio ad un massimo di 29 ° C all&#39;inizio di settembre, con una temperatura media annua di 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST Data Set, 2000-2010). La barriera corallina a Playa Kalki (12 ° 22&#39;31.63 &quot;N, 69 ° 09&#39;29.62&quot; W), situata vicino alla punta nord-occidentale di Curaçao (Figura 1A), è stato scelto per il campionamento perché è stato già ben studiato e la ecosistema marino in questa località è immersa in acqua di mare fresco nonpolluted 7,15-19. . Due strettamente legate specie di coralli Scleractinia, M. annularis e M faveolata, sono stati scelti per la sperimentazione e l&#39;analisi in questo studio perché ogni specie: (1) mostre nettamente diversi e non sovrapposti distribuzioni batimetriche sul tratto di barriera rispetto alla rottura scaffale e l&#39; ambienti deposizionali carbonato sedimentari associati (gamma annularis M. = 0-10 m WD; M. faveolatarange = 10-20 m WD 20; figure 1B, 2A, e 2B); (2) è un costruttore quadro barriera corallina comune in tutto il Mar dei Caraibi 21; e (3) ha ben studiato ecologico, fisiologico, e le relazioni evolutive 22. Campo di campionamento per il presente studio è stato condotto utilizzando tecniche standard di immersioni subacquee al largo di Playa Kalki su Curaçao. A poco a profondità batimetriche acqua transetto è stato stabilito che attraversava la mensola, durante la pausa scaffale, e negli ambienti di scogliera anteriori in acque profonde. A quanto pare teste di corallo sano sono stati poi identificati per il campionamento lungo questo transetto batimetrico, tra cui: (1) tre singoli ~ 1 m di diametro teste di corallo di M. annularis, tutti erano a 5 m di profondità d&#39;acqua (WD); e (2) tre singoli ~ 1 m di diametro teste di corallo di M. faveolata, tutti erano a 12 m di WD. Fotosinteticamente radiazione attiva (PAR) è stata misurata come 33-36% PAR a 5 m di WD e il 18-22% PAR a 10 m di WD. Il campionamento è stato condotto nel mese di gennaio, quando il SST era 26 ° C alle profondità dell&#39;acqua sia del 5 me 12 m. Ciascuno di questi sei teste di corallo è stato campionamento in triplice copia a posizioni spaziali equivalenti (es., Circa 45 ° N di latitudine su ciascuna delle sei teste di corallo emisferiche). Ogni singolo campione consisteva di un corallo biopsia tessuto di base-scheletro 2,5 centimetri di diametro che è stato raccolto con un pugno arco pulito. Tre biopsie di tessuto-scheletro di corallo sono stati campionati in serie SCUBA con le mani guantate di ciascuna delle teste di corallo (9 da M. annularis colonie a 5 m di WD e 9 da M. faveolata a 12 m WD). Subito dopo la raccolta in profondità, ogni campione biopsia è stata posta in una sterile 50 ml provetta per centrifuga in polipropilene, tappo a vite sigillato, e tornò in superficie. L&#39;acqua di mare è stato decantato da ciascuna provetta per centrifuga e ogni biopsia nucleo è stato poi immerso, immagazzinato e trasportato in paraformaldeide al 4%. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; immagini SBFI è già stato eseguito su una vasta gamma di campioni biologici, tra cui tutto il cervello e tessuti umani tutto-cuore, embrioni di topo intatti, embrioni di pesce zebra, e diversi tipi di campioni animali con le ossa intatte 23-30. La maggior parte di questi studi utilizzati microscopia ottica / luce sia con fluorescenza o tecniche in campo chiaro. Tuttavia, sono stati condotti studi in ultra-alto ingrandimento con blocco elettronico a scansione seriale volto di imaging nel passato 31. Nel presente studio, un protocollo SBFI modificato è stato sviluppato e applicato alla coralli per la prima volta. Perché M. annularis e M. faveolata polipi corallini sono 1-2 mm di spessore, nessuna delle tecniche di microscopia luce di routine sarebbe in grado di penetrare l&#39;intero spessore del tessuto del corallo polipi. Pertanto, abbiamo SBFI protocollo di preparazione del campione specificamente progettato per i campioni di corallo. Inoltre, abbiamo personalizzato progettato un titolare stereomicroscopio, Che è motorizzato per muoversi in entrambe le direzioni x ed y. Questo apparecchio prende immagini del volto blocco del campione piuttosto che raccogliere le sezioni utilizzando un microtomo regolare davanti al microscopio. Abbiamo anche introdotto un altro ottico a due fotoni tecnica microscopica non lineare per l&#39;immagine degli stessi polipi corallini attraverso l&#39;intero spessore dei tessuti di corallo. Questo supera le limitazioni imposte dalla SBFI in termini di decalcificazione e la possibilità di cambiamenti nella morfologia del tessuto e del volume (contrazione) che possono essere indotte dalla preparazione del campione (disidratazione) e protocolli di trattamento. Inoltre, i profili di emissione dei coralli sono spettralmente risolte per identificare le loro emissioni picchi e variazioni tra i cromatofori e zooxantelle fotosintetica. Questi risultati sono stati valutati nel contesto del metodo utilizzato e loro vantaggi individuali riguardanti tempo di acquisizione, tempi di analisi, e la capacità di risolvere dettagli fini strutturali senza compromettere structural integrità del tessuto del corallo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coral Tissue Skeleton</td>
			<td>None</td>
			<td>None</td>
			<td>2.5 cm Biopsy from natural habitat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arch Punch Coring Device</td>
			<td>C.S. Osborne and Company</td>
			<td>No. 149</td>
			<td>For Coral biopsy collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15700</td>
			<td>16% Pre-diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear/Safeclear II</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 64111-04</td>
			<td>Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene and Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Richard Allen Scientific</td>
			<td>Type H REF 8338</td>
			<td>Infiltration solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybar</td>
			<td>The Candle Maker</td>
			<td>None</td>
			<td>Component of Red Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stearin</td>
			<td>The Candle Maker</td>
			<td>None</td>
			<td>Component of Red Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S667-25</td>
			<td>Red Wax-Opaque background</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin (WGA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>W32466</td>
			<td>For labeling&#160; Coral Mucus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36095</td>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD-35-100</td>
			<td>For two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Motor, Driver and Controller</td>
			<td>Lin Engineering</td>
			<td>211-13-01R0, R325, R256-RO</td>
			<td>XY Translational Movement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>DC-220</td>
			<td>Melting all wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convection Oven</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>DX-600</td>
			<td>Infiltration and Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ASP 300</td>
			<td>Dehydration, Infiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2055</td>
			<td>Disposable knifes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stereolumar V 12</td>
			<td>1.5x (30 mm WD) Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope with ApoTome</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axiovert M 200, ApoTome I System</td>
			<td>Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiocam camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>MRm</td>
			<td>Monochrome camera 1388x1040 pixels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Version 4.8</td>
			<td>Image acquisition program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Photon Laser</td>
			<td>Spectraphysics</td>
			<td>Maitai eHP, pulsed laser (70 fs)</td>
			<td>With DeepSee module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 710 with Spectral Detector</td>
			<td>34 channel PMT detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>2010 or above</td>
			<td>for two-photon and spectral image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Suite Software</td>
			<td>Bitplane, Inc.,</td>
			<td>Version 7.0 or above</td>
			<td>3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal optical microscopy methods reveal polyp tissue morphology and structure in caribbean reef building corals

Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare il tridimensionale (3D), morfologia e struttura cellulare dei tessuti polipo che comprende la costruzione di coralli dei Caraibi barriera corallina Montastraea annularis e M. faveolata. Questi approcci includono microscopia a fluorescenza (FM), blocco di serie faccia di imaging (SBFI), e due fotoni laser microscopio confocale a scansione (TPLSM). SBFI fornisce l&#39;imaging dei tessuti profondi dopo il sezionamento fisico; dettaglia la struttura della superficie del tessuto e la visualizzazione 3D per profondità tissutali di più di 2 mm. FM complementare e resa TPLSM immagini ad altissima risoluzione della struttura cellulare dei tessuti. I risultati sono: (1) identificato precedentemente non dichiarata morfologie del tessuto lobate sulla parete esterna dei singoli polipi corallini e (2) ha creato le prime mappe superficiali della distribuzione e del tessuto 3D densità di cromatofori e endosimbionti dinoflagellato alghe zooxantelle-like. Pisello assorbimento spettraleks di 500 nm e 675 nm, rispettivamente suggeriscono che M. annularis e M. faveolata contiene tipi simili di clorofilla e cromatofori. Tuttavia, M. annularis e M. faveolata presentano differenze significative nella densità dei tessuti e la distribuzione 3D di questi componenti cellulari fondamentali. Questo studio incentrato sui metodi di imaging indica che SBFI è estremamente utile per l&#39;analisi di campioni di grandi dimensioni mm scala di tessuti di corallo decalcificata. FM gratuito e TPLSM rivelano sottili cambiamenti di scala submillimeter nella distribuzione cellulare e la densità in campioni di tessuto del corallo nondecalcified. La tecnica TPLSM offre: (1) la preparazione minimamente invasiva del campione, (2) la capacità sezionamento ottico superiore, e (3) l&#39;assorbimento della luce minima e dispersione, pur permettendo l&#39;imaging dei tessuti profondi.

Un apparato SBFI progettato su misura (realizzato appositamente per il presente studio, Figura 3) ha prodotto le prime dettagliate mappe 3D digitali di elevazione (DEM) della struttura della superficie esterna e la morfologia del M. annularis e M. polipi corallini faveolature (Figura 4 e SI Video 1-2). Questo ha prodotto immagini di lobi sovrapposti precedentemente non descritta di tessuto del corallo concentrica irradia verso l&#39;esterno da...

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Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare polipo morfologia e struttura del tessuto in coralli dei Caraibi Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescenza, blocco faccia seriale, e due fotoni laser microscopio confocale a scansione hanno identificato struttura lobate, pareti polipo, e chromatophore stimato e densità di zooxantelle e distribuzioni.

Multimodali ottici Metodi Microscopia Reveal Polyp Tissue morfologia e struttura in Caribbean Reef costruzione Coralli

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

multimodal-optical-microscopy-methods-reveal-polyp-tissue-morphology

Research

JoVE Journal

Environment

12.2K Views.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare polipo morfologia e struttura del tessuto in coralli dei Caraibi Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescenza, blocco faccia seriale, e due fotoni laser microscopio confocale a scansione hanno identificato struttura lobate, pareti polipo, e chromatophore stimato e densità di zooxantelle e distribuzioni. 