Este protocolo facilita la identificación y el aislamiento de poblaciones vivas de células de coral a un nivel descriptivo que antes no era posible. La principal ventaja de esta técnica es que permite el acceso a un nivel de especificidad celular que hasta ahora ha sido en su mayoría inalcanzable. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Shannon Saigh, un investigador asociado del recurso compartido de citometría de flujo en el Centro Integral de Cáncer de Sylvester.
Para configurar el citómetro de flujo para la clasificación de células de coral en vivo, abra una nueva plantilla de proyecto en el software del citómetro de flujo y seleccione los láseres adecuados para el análisis en el panel láser. A continuación, cree un gráfico de dispersión lateral frente a dispersión hacia delante en las gráficas adecuadas para configurar la estrategia de medición y análisis. Para el análisis citométrico de flujo y la clasificación de las células de coral vivas, cargue la muestra celular no manchada de control en la cámara de muestra del citómetro e inicie el proceso de lectura.
Dado que las células de coral son particularmente frágiles, mantenga la presión del citometro baja para prevenir la lelisis celular. En la gráfica de dispersión, ajuste el voltaje del multiplicador de fotos para centrar los puntos y comience a grabar los eventos. En la gráfica de dispersión hacia delante frente a lado, cree una puerta alrededor de las celdas alrededor de la marca 10 a la 4a en el eje X de dispersión hacia delante.
Reemplace la muestra de control por la primera muestra de celdas manchadas y registre aproximadamente 10.000 celdas antes de pausar. A continuación, puerta y los eventos que son exclusivos del grupo de muestra manchado. Para clasificar las células de coral vivas, después de seleccionar la población celular de interés en el software del citómetro de flujo, coloque un tubo de microcentrífuga que contenga 250 a 500 microlitros de la solución de recolección adecuada en la cámara de recolección de citómetros para que cada población la clasife.
Una vez que haya pasado una cantidad apropiada de tiempo para eliminar los escombros, comience a clasificar la población deseada para recoger entre 10.000 y varios millones de células. Cada vez que se utilice una nueva mancha, especie o clasificador, clasif sino 20.000 células de interés en 500 microlitros de medios de tinción para permitir que se realice un control de pureza en la población de interés y reanalice las celdas ordenadas para confirmar que los eventos se están leyendo dentro de la puerta utilizada para la clasificación inicial. Para estudios in vitro, almacene las células ordenadas en hielo hasta que se transfieran a una incubadora o a un entorno esterilizado.
Para traer otras partículas no celulares que no comparten la misma forma o granularidad que las células de coral se pueden eliminar del análisis mediante la creación de una selección de puerta en una gráfica de dispersión hacia adelante y lateral. Las células muertas se pueden excluir comparando la señal DAPI de las suspensiones de celdas no manchadas y manchadas utilizando un histograma y sacando las celdas altas que expresan DAPI. Paralelamente, las células que alojan la simbieneasia autofluorescencia se pueden eliminar mirando contra las células con la señal alta en el canal rojo lejano.
Después de este proceso iterativo de gating, las células restantes representan las poblaciones intactas de células de coral vivas que carecen de simbideneasia. Estas células se pueden clasificar en diferentes subpoblaciones celulares mediante la tinción de características tales como la actividad reactiva de especies de oxígeno y / o contenido lisosoma. Es fundamental recordar que algunas células son más frágiles que otras y ejecutar este proceso con el mayor cuidado posible.
Una vez que se han aislado células específicas, se pueden utilizar para ensayos funcionales x-vivo, como el establecimiento de cultivos celulares y la creación de perfiles transcriptómicos.
