Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.

El protocolo consta de tres pasos principales: la primera etapa comprende la preparación de extracto de material compuesto en medios de cultivo; el segundo se refiere la Primaria Humanos fibroblastos gingivales (HGF) de cultivo de células, el contacto de las células con los extractos compuestos y tinción de células; la tercera etapa consiste en la formación de imágenes confocal y el análisis de la señal fluorescente. Para tejidos gingivales tomando, el protocolo fue aprobado en cumplimiento de la legislación francesa, el consentimiento informado y el comité de ética local. 1. Extractos Compuesto Preparación Utilice medio de Dulbecco modificado Eagle (DMEM) como el medio de elución. Asegúrese de que la relación entre el área superficial de las muestras y el volumen de medio de extracción está en el nivel más bajo de los requisitos de la norma ISO 10993/12. El procedimiento se describe recientemente 11 y esbozó brevemente a continuación: <ol><li> Formar muestras esféricas de material compuesto no curado dental utilizando una retención a medidaer. El tamaño titular es 2 mm de radio, que está de acuerdo con la profundidad de curado generalmente se recomienda en el tratamiento clínico oral. </li><li> Preparar pocillos de la placa, cada uno conteniendo 1 ml de medio de cultivo (DMEM), con una mezcla de 5% de penicilina / estreptomicina y 1% de la anfotericina pero sin suero bovino fetal (FBS). </li><li> Muestras de curación en el medio DMEM que contiene bien utilizando una lámpara de luz LED con un 1,070 mW cm -2 intensidad (λ = 465-475 nm) durante 40 segundos. Asegúrese de que la distancia entre la punta de curado y las muestras está en el intervalo de 0,5 mm. Utilice este modo de curado para simular el contacto temporal entre el diente y el material compuesto no curado dental. En la situación clínica, el contacto se produce cuando el compuesto de restauración se coloca en la cavidad oral. </li><li> Incubar las muestras (composites especímenes en medio DMEM) a 37 ° C en ambiente humidificado de 5% de CO 2 en el aire. Incubar medio DMEM (sin muestras compuestas) para las células de control en las mismas condiciones. </li></ol> 2. HGF Cultivo Celular, Compuesto Extractos Pruebas y tinción de las células <ol><li> Crecimiento y mantenimiento de cultivos de células Aislar fibroblastos gingivales humanos de biopsias de tejidos gingivales sanos de pacientes tomadas durante las extracciones de ortodoncia de rutina. <ol><li> Cultivar fibroblastos gingivales humanos en DMEM en presencia de 10% de FBS, 5% de penicilina / estreptomicina y 1% anfotericina B. mantener las células a 37 ° C en una incubadora bajo una atmósfera humidificada de 5% de CO2 en aire. </li><li> Medianas cambian cada 3 días, y de paso las células cada 5 días. Después de alcanzar la confluencia, las células de la cosecha por tripsinización. </li><li> Centrifugar las células a 90 xg durante 5 minutos y volver a suspender en el medio de cultivo. Recuento de células con un contador de células automatizado de mano cetro. </li><li> Seed suspensión de células a una densidad celular de 2,5 x 10 4 células / ml en un sistema de cámara de diapositivas. Permitir la incubación de las células durante la noche a 37 ° C en una atmósfera de 5%. </li></ol></li><li> La adición de extractos de compuestos a las células en cultivo <ol><li> Reemplazar los medios de comunicación de dos pocillos de la cámara de diapositivas por 1 ml de los extractos compuestos ensayados (después de 24 h de incubación). </li><li> Mantener los dos pozos restantes (células de control) en las mismas condiciones. </li><li> Incubar el portaobjetos cámara que contiene los cuatro pozos a 37 ° C en la incubadora, en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 en aire. </li></ol></li><li> La tinción fluorescente Utilice el Live / Dead mancha de citotoxicidad para las células eucariotas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: el kit proporciona un ensayo fluorescente de dos colores rápida para determinar la viabilidad de las células en una población basada en la integridad de la membrana plasmática y la actividad esterasa. La mancha distinguir en vivo de las células dañadas por el etiquetado simultáneamente con verde fluorescente calceína-AM para indicar la actividad de la esterasa intracelular y de etidio rojo fluorescente homodímero-1 (EthD-1) para indicar la pérdida de membrane integridad. <ol><li> Preparar una solución de trabajo de los dos reactivos de tinción que contienen 2 mM de calceína AM y 4 M EthD-1 (concentración final notificado para ser adecuado para la tinción de fibroblastos). Añadir la mancha para las células adherentes cultivadas en la presencia o ausencia de los extractos compuestos seleccionados. </li><li> Observar directamente y rápidamente las poblaciones de células teñidas en el menos 15 minutos después de la tinción y por medio de la proyección de imagen de lapso de tiempo. No centrífuga y no fixe las células teñidas. </li></ol></li></ol> Lapso de tiempo 3. confocal de imágenes y Análisis de Señales El sistema utilizado está equipado con un cuatro unidades de láser de diodo y una imagen multi-manchado durante un máximo de cuatro tintes fluorescentes para cada espécimen. El sistema puede realizar una imagen de mapeo (magnificación 10X) que da una visión general de la muestra de ensayo en la que uno se puede mover para observar una región de interés (aumento 600X). <ol><li> Proyección de imagen Lapso de tiempo <ol><li> Coloca las specimens (la diapositiva cámara que contiene las muestras teñidas) en el cuarto oscuro de la incubadora integrada confocal (37 ° C, 5% de CO 2 y la atmósfera húmeda). </li><li> Seleccione los láseres correspondientes. Utilice las dos fuentes de láser 473 nm (15 mW) y 559 nm (18 mW) para excitar Calceína y EthD-1. </li><li> Utilice un modo de dos secuencial para adquirir imágenes a través de secuencias de línea y sin interferencia en la imagen con los dos colorantes fluorescentes usados. </li><li> Utilice un detector con un espectro recientemente desarrollado para ajustar automáticamente las condiciones de conformidad con el colorante de fluorescencia en la unidad de exploración. </li><li> Optimizar los anchos de banda de la fluorescencia detectada para cada canal al máximo. Registre todas las adquisiciones de forma secuencial para evitar posibles cruz-parlante. </li><li> Seleccione las condiciones de formación de imágenes más adecuados basados ​​en la selección colorante fluorescente utilizando el software de adquisición. </li><li> Adquirir una imagen de mapa que se crea de forma automática desde el centro en forma de espiral,con el área de interés de ser seleccionado para un examen más fácilmente. </li><li> Seleccione el modo de observación. Seleccione hasta cinco tipos de modos de observación, incluyendo time-lapse, Z-pila, y multi-zona, según sea necesario. Use una combinación de modos de time-lapse Z-pila y en el presente estudio y completar rápidamente la captura de imágenes, </li><li> Cambiar y cambiar el tinte fluorescente. Alternativamente, superponer el fluorescente y las imágenes de contraste de luz entre sí. Observe la imagen en vivo usando el punto seleccionado en la pantalla del mapa inferior izquierdo. </li><li> Determinar el área de formación de imágenes mediante el uso de la formulación y zoom funciones. Opcionalmente, cambiar entre las pantallas para cada tipo de colorante fluorescente. NOTA: El microscopio usado en este protocolo tiene la misma funcionalidad que un alto confocal convencional en un diseño compacto. El microscopio está equipado con objetivos de inmersión en agua invertidas que se adaptan de forma óptima para estable time-lapse de células vivas con una incubadora integrado simplificado. </lyo&gt; </ol></li><li> Análisis de la señal y la cuantificación <ol><li> Utilice el software de imágenes para cuantificar la señal de fluorescencia. Obtener cinco imágenes de mapa con el objetivo de 10X, tanto para la muestra y la celda de control probado. </li><li> Obtenido 1.024 × 1.024 píxeles imágenes regulares, con un tamaño de 0.231 × 0.231 píxeles micras micras. Almacenar imágenes en formato de imagen Olympus (OIF) para el análisis de señales. Este formato permite almacenar varios ajustes de los parámetros y las imágenes juntos. Utilizar diferentes herramientas de análisis (medición de perfil de intensidad, relación de intensidad entre los dos canales utilizados). </li><li> Guarde las imágenes de proyección máximas como archivos TIFF de 12 bits / pixel. </li><li> Preforma análisis estadísticos utilizando el software R comandante. Analizar las diferencias utilizando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) con una prueba de repetición. Informe de resultados de la desviación estándar como media (± DE) y la significación estadística de p &lt;0,05. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests, they have nothing to disclose.

Comportamiento del material biocompatibilidad es el parámetro más requisito previo para ser evaluados antes de su uso médico. Las normas internacionales cubren los dispositivos médicos ISO 10993 33 y específicamente los materiales dentales ISO 7405 34. La ausencia de los efectos tóxicos a las células circundantes es la norma fundamental en la evaluación de la biocompatibilidad de estos materiales. Es por eso que las pruebas de citotoxicidad tiene tal importancia en la evaluación de la biocompatibilidad material dental 35-37. La ISO sugirió métodos de prueba podrían basarse en la actividad metabólica o integridad de la membrana. Puntos finales seleccionados deben seguir condiciones específicas para la clasificación de efectos adversos inducidos por un material de ensayo con el fin de minimizar el tiempo y el costo de los ensayos de evaluación. El método actual de investigación (imágenes por lapso de tiempo confocal 3D) es la integridad de la membrana basada. La evaluación de la citotoxicidad a través de este punto final parece ser un valioso marcador de biocompa celulartibilidad con materiales probados y que es también la ISO aprobó punto final. In vitro pruebas están diseñadas para determinar cómo una muestra de material afecta a un tipo de célula particular. El ensayo colorimétrico MTT fue descrito originalmente por Mossman (1983) como un método útil para la medición de la citotoxicidad in vitro y la proliferación celular. La prueba de MTT se basa en la conversión de la sal de tetrazolio en cristales de formazán por las células activas, que determina la actividad mitocondrial. Esto se puede traducir por bajos viabilidad 38. Gupta y colaboradores informaron de que la prueba de MTT es el método más ampliamente utilizado para medir la citotoxicidad de las resinas compuestas. Deshidrogenasa succínico y respuestas de fosfatasa alcalina también se han utilizado para el mismo propósito 39. Sin embargo, las células de destino no puede ser objeto de seguimiento, puesto que el ensayo de MTT requiere matar las células en cada punto de tiempo de medición. Con el fin de seguir más de cerca el comportamiento de las células teñidas en el estudio actual, diSe llevó a cabo la observación de células vivas rect, gracias a imágenes CLSM lapso de tiempo combinado con una tinción protocolo corto, análisis de imágenes automatizado y cuantificación de la señal fluorescente. Materiales compuestos dentales vienen en estrecho contacto con los tejidos orales, especialmente células de la encía y la pulpa. Los fibroblastos serían el blanco de los componentes liberados de estos compuestos restauradores 40-41. Además, varios estudios han informado de que las células inmortalizadas y células primarias pueden tener diferentes respuestas celulares en contacto con biomateriales. Se encontraron células primarias para ser más apropiada para evaluar los efectos biomateriales 42. Esto explica el uso de células de fibroblastos gingivales humanos primarios como modelo de células para la evaluación de la citotoxicidad del material compuesto dental probada en el estudio actual. El potencial toxicidad de las sustancias liberadas a partir de composite dental ha sido ampliamente estudiado 43-44. A fin de evaluar tél potencial citotóxico de los materiales, dos células modelo de contacto se podrían realizar. En el sistema modelo de contacto directo el material se coloca directamente con las células diana, mientras que en el sistema de contacto indirecto, las células diana están en contacto con eluye de medios biológicos. En las aplicaciones clínicas y para los procedimientos de restauración, compuesto dental se colocan en contacto indirecto con los tejidos gingivales. Por esta razón, el protocolo experimental actual se centra en el sistema de contacto indirecto con fibroblastos gingivales humanos (células en presencia de los extractos compuestos ensayados). Como se informó anteriormente por Dahl y colaboradores, las respuestas de citotoxicidad se clasificaron como graves (&lt;30%), moderada (30-60%), leve (60-90%) o no citotóxico (&gt; 90%), basado en la actividad relativa a los valores obtenidos para los controles 45. Por lo tanto, según este ranking, ya la luz de los resultados obtenidos (Tabla 1), compuesto ELS adicional baja contracción podría ser clasificado como very ligeramente citotóxica y mostró un comportamiento comparable con las células control durante todo el período de lapso de tiempo. Utilizando el mismo método de investigación, precisamente, los resultados de este estudio podrían ser comparados con los de un estudio recientemente publicado. El extra de compuesto de baja contracción ELS demostró la biocompatibilidad superior en comparación con los dos compuestos ensayados previamente utilizados para la misma aplicación clínica que es la restauración directa 11. Otros estudios son aún necesarios para establecer una comparación más completa. Al decidir que la citotoxicidad de ensayo para aprobar una evaluación específica de punto final, es importante entender las ventajas y las limitaciones de cada ensayo. El propósito principal de formación de imágenes confocal es lograr una arquitectura de 3-D de las células y órganos. La técnica es capaz de revelar no sólo la superficie de una muestra, sino también su subsuelo. El protocolo se describe en este documento pone de relieve el uso de 3D CLSM tiempo de imagen confocal lapso, como sensitiva método para evaluar el comportamiento de biocompatibilidad in vitro de un material compuesto dental. Sin embargo, a fin de evitar las limitaciones encontradas en este trabajo, estaciones de trabajo anti-vibración podrían ser utilizados con el fin de permitir que la imagen más estable y más largo lapso de tiempo; el tablero de la mesa podría aislar el sistema confocal utilizado por los efectos perjudiciales que las vibraciones en el laboratorio pueden causar. Además, los materiales que se utilizarán en la cavidad oral idealmente debería ser inocuo para los tejidos gingivales y no deben contener sustancias que podrían causar toxicidad sistémica. De acuerdo con la metodología utilizada y los resultados obtenidos en el presente estudio se puede concluir que el compuesto probado (ELS adicional baja contracción) no es citotóxica en las presentes condiciones experimentales. Como el método MBRC sensibilidad puede dar la velocidad inicial de células viables, otras posibilidades podrían preverse para evaluar más puntos finales. En particular, como se ha informado recientemente que los monómeros compuestos afectan a las células thrOugh especies reactivas de oxígeno (ROS) 46- 48, se necesita más investigación para evaluar si los hay correlaciones entre la citotoxicidad redes y la producción de ROS señalización. El futuro protocolo podría ser diseñado para evaluar simultáneamente la producción de ROS (H 2 O 2 y / o O 2 - tinción) y la relación de la citotoxicidad (tinción en vivo / muerto) utilizando imágenes CLSM lapso de tiempo.

Una de las principales normas citadas en las recomendaciones de la ISO para definir biocompatibilidad es la ausencia de toxicidad de material a las células. Compuestos dentales a base de resina pueden liberar componentes de la matriz resinosa, que podría ser debido inicialmente a la polimerización parcial, y / o más tarde debido a procesos de degradación con el tiempo 1-4. Estos componentes liberados entrar en contacto con los tejidos orales y pueden tener varios inconvenientes como las reacciones de urticaria y mucosas 5, el desarrollo de las reacciones alérgicas y de hipersensibilidad en los pacientes 6, modificaciones de la morfología de fibroblastos gingivales y la reducción en la proteína colágeno de tipo I 7, de inmunosupresión o inmunoestimulación en mitógeno impulsada por la proliferación de los linfocitos T purificados y células de bazo 8 y el daño del ADN en los fibroblastos gingivales humanos primarios, lo que subraya su potencial genotóxico 9. Muchos parámetros pueden afectar la toxicidad compuesto dental, como la sombra de la composite, la luz de curado, la composición química del monómero de la resina, el relleno y el grado de conversión de 10 13. Desde potencial tóxico in vitro de materiales puede predecir en situaciones in vivo y podría ser comparado con situaciones clínicas por el estudio de algunas variables relevantes. La citotoxicidad de compuestos dentales y sus componentes han sido ampliamente evaluado utilizando sistemas de cultivo celular 14- 16. Estos sistemas in vitro se han desarrollado para evaluar compuestos dental biocompatibilidad en términos de: crecimiento celular, y la apoptosis celular utilizando THP-1monocytes como las células 17, la citotoxicidad en fibroblastos gingivales humanos 18, el potencial inflamatorio en queratinocitos HaCaT como las células 2, la funcionalidad de células odontoblast- como 23 MDPC células 19, la reducción de los niveles de ARN total, y aumento significativo en la inducción de la apoptosis de queratinocitos gingival humano 20 yDaño en el ADN en fibroblastos gingivales y pulpa de células 21. Diferentes metodologías se sugieren para investigar la biocompatibilidad de los materiales compuestos dentales. Ensayos colorimétricos, que implican colorantes específicos y medidas de adsorción de luz, siguen siendo los más utilizados, debido a su relativa simplicidad y bajo costo 22- 26. Análisis de Microscopía de contraste de luz con frecuencia consume más tiempo e incurre en mayores costos. Sin embargo, estas técnicas de microscopía tienen algunas ventajas importantes. La observación de la estructura celular proporciona información ampliada sobre los efectos tóxicos experimentados, proporcionando así datos más relevantes y sensibles. En particular, la introducción de la microscopía confocal 27 ha permitido para la observación de estructuras biológicas con la mejora de la resolución axial en comparación con el de campo amplio tradicionales microscopios de fluorescencia de imágenes. Por lo tanto, la imagen confocal se ha convertido en una poderosa herramienta de investigación en diferentes campos de lainvestigaciones médicas y científicas. En contraste con las técnicas de microscopía electrónica, microscopía de barrido confocal ofrece la capacidad de visualizar los distintos componentes de las células mediante la incorporación de marcadores fluorescentes específicos. La mayoría de estos trazadores específicos son estables en un entorno acuoso, sensiblemente medible, barato y no tóxico 28, lo que permite su uso en clínica, así como los estudios de investigación de laboratorio. Por otra parte, el secado y fijación de muestras requerido para el análisis de microscopía electrónica convencional no es necesaria para la formación de imágenes confocal lapso de tiempo, la adquisición de este modo dependiente del tiempo también es posible en muestras. En comparación con la formación de imágenes de dos dimensiones, el principio de formación de imágenes confocal permite una visualización del subsuelo muestra y la estructura tridimensional de reconstrucción de las diferentes imágenes de profundidad obtenidos; detalles que dan como resultado, más precisos y más estructurales 29, 30. El presente estudio de vídeo es un ejemplo de la utilización de tres dimensiones de intervalos de tiempo Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-CLSM) combinada con etiquetado Live / Dead fluorescente y la cuantificación de la señal como un método innovador. La técnica presentada en este documento tiene la ventaja de permitir la evaluación y el lapso de tiempo sensible de imágenes de células vivas sin cambiar la estructura de la célula evaluado. No se requieren pasos de preparación antes del análisis confocal. Anteriormente, la misma tinción se utilizó para evaluar la viabilidad del cultivo núcleos de hueso esponjoso 31 pero sin confocal de lapso de tiempo siguiente. Del mismo modo se utilizó el mismo procedimiento confocal de lapso de tiempo para evaluar la actividad de letalidad eritromicina en las bacterias de lodos activados de acuerdo a su tipo de Gram 32 utilizando una bacteria específica Vivir / tinción muertos. Estos métodos se han adaptado y utilizado para comparar la toxicidad de compuestos dentales basados ​​en monómeros de metacrilato de 11 recientemente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Olympus Fluoview FV10i&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O2/Co2 Incubator</td>
			<td style="width:71px;">Pnasonic</td>
			<td style="width:119px;">MCO 5M</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Live/Dead&#174; Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MP 03224</td>
			<td>Stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ELS extra low shrinkage&#174;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Saremco&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Dental composite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D 6046</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1426</td>
			<td>harvesting cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chamber slide system&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">14220040X</td>
			<td>Culture chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">A11-101</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">00110230TP1</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal time lapse imaging as an efficient method for the cytocompatibility evaluation of dental composites

Es generalmente aceptado que la interacción in vitro de material celular en es un criterio útil en la evaluación de biocompatibilidad material dental. El objetivo de este estudio fue utilizar 3D CLSM tiempo de imagen confocal lapso para evaluar la biocompatibilidad in vitro de compuestos dentales. Este método proporciona una indicación exacta y sensible de la tasa de células viables en contacto con extractos de compuestos dentales. El ELS adicional baja contracción, un compuesto dental utilizado para la restauración directa, se ha tomado como ejemplo. En la evaluación in vitro se realizó en células de fibroblastos gingivales humanos en cultivo primario mediante la tinción de Live / Dead. Las imágenes se obtuvieron con el sistema biológico FV10i confocal invertido y analizados con el Software 3.1 FV10-ASW. Análisis de la imagen mostró una muy ligera citotoxicidad en presencia del compuesto de prueba después de 5 horas de lapso de tiempo. Una ligera disminución de la viabilidad celular se muestra en contacto con el compuesto de extractos compar probadoed con las células control. Los resultados pusieron de relieve el uso de 3D CLSM imágenes lapso de tiempo como un método sensible para evaluar cualitativa y cuantitativamente el comportamiento de biocompatibilidad de materiales compuestos dentales.

La figura 1 muestra una vista general de las células teñidas de vivos / muertos en imágenes obtenidas de mapeo (objetivo 10X), tanto para el control y las células expuestas a los extractos compuestos ensayados (ELS muy baja contracción). La estructura tridimensional de las células puede ser visualizado en la 600X aumentos. Visualización de células recogidas en la cámara de control y de las células recogidas en la cámara en presencia de los extractos compuestos ensayados se presenta en la Figura 2. La proyección máxima (60X objetivo) muestra el destino de las poblaciones celulares seleccionadas en el comienzo de el lapso de tiempo (a 15 min) y al final del período de tiempo transcurrido (en 5 h). Cincuenta y siete pilas de imágenes (tomografía xyzt mod, 39 imágenes por pilas, voxel de profundidad 1,00 m) se obtuvieron durante este periodo. Una ligera disminución en la señal fluorescente verde y muy ligera variación en el fluorescente de color rojo se obtuvieron en las células expuestas. No se observó variación significativa para el control delas células. Células expuestas extractos compuestos supone la morfología del huso similar a las células de control; morfología no fue alterada en estas condiciones experimentales (a pesar de la disminución de la señal verde y el aumento de la señal roja en la presencia del compuesto probado). El análisis de imágenes se realizó en cinco diferentes pilas de imágenes seleccionadas correspondientes a diferentes poblaciones de células a partir de las imágenes obtenidas para el compuesto probado en comparación con células de control negativo para la señal de tanto verde y rojo. El perfil de intensidad de las células teñidas se ilustra en la Figura 3; la evolución de la señal verde y rojo de las células en contacto con el compuesto probado fue comparable a las de las células de control. Calceína y EthD-1 intensidades de emisión de fluorescencia se midieron en células de control y en las células expuestas compuestos. La medición se realizó a intervalos de una hora durante un máximo de cinco horas. La proporción verde / rojo de fluorescencia (basado en las intensidades integradas de la verde 495-515 nm y 620-650 nm señales rojas) Se calculó durante el período de lapso de tiempo. Las proporciones de viabilidad para el control y las células expuestas a los extractos de ELS adicional baja contracción se muestran en la T abla 1. En la presencia del compuesto de prueba, se encontró que el porcentaje de células vivas para disminuir ligeramente de 100% a 93,9% después de 1 h de contacto. Se observó una diferencia significativa entre el compuesto probado y el control negativo (células sin ningún extractos compuestos) después de 5 horas del período de lapso de tiempo indicado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg" /> Figura 1: Vista general de mapeo de imagen mostró células en objetivo de 10X, las células de control (A) y (B) las células teñidas en presencia de extractos de compuestos (ELS muy baja contracción) en el comienzo del período de tiempo transcurrido (t = 15 min). Las áreas verdes son células vivas y las zonas rojas son las células dañadas. En estecondiciones del experimento, no de variación (tanto para la fluorescencia verde y rojo) se observó para los compuestos expuestos células en comparación con células de control negativo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg" /> Figura 2: imágenes CLSM en objetivo 60X de una población celular de (A) y la cámara de control (B) cámara de extractos de compuestos en el comienzo y el final del período de exposición de lapso de tiempo (I: 15 min y II: 5 hr, respectivamente ). Las áreas verdes son células vivas y las zonas rojas son las células dañadas. El panel de las imágenes demostró ligero cambio en la señal de intensidad (ligero descenso en la señal verde y muy ligero incremento en el rojo). No se observaron alteraciones en la morfología celular en presencia de extractos de material compuesto; exponer células mantenido su morfología en forma de huso y fibroblástica como las células de control. Figura 3: Perfil Línea de células observadas en microscopía de lapso de tiempo las células (A) de control (B) células extractos compuestos expuestos, (I) a los 15 min y (II) a las 5 h.. Ninguna variación visible en la evolución de la señal verde en presencia de compuesto probado independientemente el tiempo de contacto. Sin embargo, se observó ligero aumento de la señal de color rojo en presencia de compuesto después de 5 h de contacto. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> El tiempo de contacto (horas) </td><td colspan="5"> Viabilidad celular (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Las células de control </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 &lt;/ Td&gt; <td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> ELS adicional baja contracción ® </td><td> 93,9 ± 7 </td><td> 91,3 ± 5 * </td><td> 89,5 ± 3 * </td><td> 87,6 ± 2 * </td><td> 87,7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> Tabla 1:. Tasa de HGF en vivo evolución células después de 1, 2, 3, 4 y 5 hr de contacto con los extractos compuestos se ensayó la viabilidad celular mediante la tinción utilizando el kit de citotoxicidad Live / Dead. Los datos muestran valores medios ± DE de cinco imágenes apila análisis. Los valores son significativamente diferentes de las células de control en p &lt;0,05.

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Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

El aspecto más estudiado de la biocompatibilidad de los materiales compuestos dentales es su citotoxicidad 3D CLSM imágenes lapso de tiempo combinado con la cuantificación de la señal fluorescente permite la evaluación sensible del destino celular en el tiempo. Utilizando este método podría ser una herramienta eficaz para evaluar la cytocompatibility de composites dentales.

Confocal Lapso de tiempo de imágenes como un método eficaz para la Evaluación Cytocompatibility de composites dentales

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

confocal-time-lapse-imaging-as-an-efficient-method-for

Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K vistas.  UMR CNRS 5615, Université Lyon1.  El aspecto más estudiado de la biocompatibilidad de los materiales compuestos dentales es su citotoxicidad 3D CLSM imágenes lapso de tiempo combinado con la cuantificación de la señal fluorescente permite la evaluación sensible del destino celular en el tiempo. Utilizando este método podría ser una herramienta eficaz para evaluar la cytocompatibility de composites dentales. 

Video: Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Investigación

Medicina

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

los<em&gt; En Ovo</em&gt; Chick corioalantoidea de membrana (CAM) Ensayo como un modelo de xenoinjerto eficiente de carcinoma hepatocelular

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Un método mejorado para la rápida intubación de la tráquea en ratones

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle screws after spinal surgery, which is a serious concern. To address this problem, diverse types of pedicle screws have been examined to identify those with good fixation strength and osseointegration in spine bone. The porcine spine is a good alternative for the human spine in the evaluation of pedicle screws due to the anatomical size, mechanical characteristics, and cost. Although several studies have reported that pedicle screws are efficient in the porcine model, no study has described detailed protocols for the evaluation of a pedicle screw using the porcine model. Here, we describe a detailed method for evaluating transpedicular screws using an in vivo porcine lumbar spine model. The technical details for anesthesia, spine surgery, and harvest provided here will facilitate with the evaluation of the transpedicular screw fixation model.

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Here, we introduce a method to evaluate transpedicular screws by using an in vivo porcine lumbar spine model.

Anestesia, Cirugía y Método de Cosecha para la Evaluación de Tornillos Transpediculares Usando un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de columna lumbar porcina

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

Segunda generación armónica las señales en esclera de conejo como una herramienta para la evaluación del tejido terapéutico Cross-linking (TXL) para la miopía

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful compared to other more aggressive methods such as retro-orbital plexus sample collection. However, this blood collection method is sometimes limited by an unsatisfactory success rate. Here, we introduce a method for blood collection through the subclavian vein puncture. The subclavian vein is located just under the clavicle and this vein is large enough to fulfill the volume requirements of blood collection. Our results show that this method is safe and applicable for blood collection sampling with the required blood volume. Blood collection through the subclavian vein puncture could serve as an alternative blood collection method in case of failed tail vein blood sampling in rats.

Here, we present a protocol to collect blood samples from the rat subclavian vein.

Punción de la vena subclavia como método alternativo de recogida de muestras de sangre en las ratas

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

In vitro Time-lapse live-cell imaging para explorar la migración celular hacia el órgano de Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Guided Endodontics: Three-Dimensional Planning and Template-Aided Preparation of Endodontic Access Cavities

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, pulpitis or apical periodontitis may develop in the long term. Root canal treatment of teeth with severe PCO and pulpal or periapical pathosis is challenging for general practitioners and even for well-equipped endodontic specialists. To ensure detection of the calcified root canal and avoid excessive loss of tooth structure or root perforation, static navigation using templates ("Guided Endodontics") was introduced a few years ago. The general workflow includes three-dimensional imaging using cone-beam computed tomography (CBCT), a digital surface scan, and superimposition of both in a planning software. This is followed by virtual planning of the access cavity and the design of a template that will guide the drill to the desired target point. To do this, a true-to-scale virtual image of the drill must be placed in a way that the tip of the drill reaches the orifice of the calcified root canal. Once the template has been fabricated using computer-aided design and computer-aided manufacturing (CAD/CAM) or a 3D printer, guided preparation of the access cavity can be performed clinically. For research purposes, a postoperative CBCT image can be used to quantify the accuracy of the access cavity performed. This work aims to present the technique of static guided endodontics from imaging to clinical implementation.

Guided endodontics describes a template-aided approach for access cavity preparation. The procedure requires cone-beam computed tomography and a surface scan to produce a template. An incorporated sleeve guides the drill to the target point. This allows the preparation of minimally invasive endodontic access cavities in calcified teeth.

Endodoncia guiada: planificación tridimensional y preparación asistida por plantillas de cavidades de acceso endodóntico

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, ...