This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

1 Preparación de Cámaras de migración <ol><li> Preparar una jalea de cera de parafina / petróleo (1: 1) mezcla y calentar hasta que la mezcla se haya derretido. El uso de un cepillo de pintura y dibujar 2-3 capas de la jalea de cera de parafina / petróleo (1: 1) mezclar en el medio de la lámina de vidrio de acuerdo a las figuras 1B-1D. NOTA: Estamos utilizando portaobjetos de vidrio común (76 x 26 x 1,0 a 1,5 mm (W / D / H)) </li><li> Aplique la mezcla de gelatina de cera de parafina / petróleo derretido rápidamente en el portaobjetos de vidrio para evitar la solidificación mientras dibuja. Asegúrese de que la capa de jalea de cera de parafina / petróleo es de alrededor de 2-2,5 cm de longitud y 0,3-0,5 cm de ancho. El espesor de la capa de gelatina de cera de parafina / petróleo debe ser de aproximadamente 0,1-0,15 cm. </li><li> Añadir un cubreobjetos a la cera de parafina solidificada / mezcla de vaselina y sellarlo con dos o tres capas de parafina jalea mezcla de cera / petróleo (Figuras 1E, 1F). Utilice 4-8 cámaras de migración para un experimento de migración celular común. Cámaras Lugar de migración in una posición vertical en un rack. </li></ol> 2. preparación de la suspensión de la mezcla de la célula de colágeno <ol><li> Cosecha (por ejemplo, con 0,25% de tripsina / EDTA) y contar las células de interés. Resuspender las células en medio completo que contenía suero de ternera fetal (FCS), antibióticos y suplementos recomendados. Preparar 4-8 1,5 ml tubos de reacción y 20 l de suspensión celular que contiene 4-6 x 10 4 células (el número total de células depende del tipo de célula a analizar) y rellenar hasta 50 l con medio completo. NOTA: Los compuestos adicionales (por ejemplo, factores de crecimiento, quimiocinas, inhibidores, etc) se añaden a la suspensión celular. Utilice soluciones madre apropiadas de tal manera que el volumen final de suspensión de células no exceda de 50 l. </li><li> Preparar una cantidad total de 452 l de suspensión final de colágeno durante cuatro experimentos de migración celular. Añadir 50 l de 10x MEM (pH 5.1 a 5.5) y 27 l de solución de bicarbonato de sodio 7,5% (pH 9,0-9,5) A un tubo de reacción de 1,5 ml y mezclar bien. Observe el cambio de color de la solución de color amarillo-naranja a púrpura intenso (pH 9,0 a 9,5). Añadir 375 l de suspensión de colágeno líquido a la solución de bicarbonato de 10x MEM / sodio y mezclar bien. El pH de la suspensión de colágeno final debería ser de aproximadamente 7,5 (indicado por un color púrpura claro). NOTA: Verifique el pH de la solución de bicarbonato de sodio al 7,5%. Si el pH es de aproximadamente 7,5 a cabo la solución de bicarbonato de sodio con una tapa abierta en una incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para ser saturada con CO 2 y aumentar el pH (aproximadamente 9,0 a 9,5). El pH de la mezcla de células en suspensión de colágeno es crucial para la estabilidad de la red de colágeno. Si es demasiado baja, la red de colágeno se derrumbará durante el experimento la migración celular. NOTA: Para este protocolo, utilizar colágeno líquido (pH 1.9 a 2.2) de hind bovina (2,9-3,3 mg / ml de colágeno, y el 95% de colágeno tipo I, 5% de colágeno tipo IV). Ejemplos de protocolos de preparación de celosía más de colágeno utilizandocolágeno tipo I procedente de otras fuentes, tales como porcino o rata, se dan en 32,33. No cambie los volúmenes de las soluciones utilizadas o modificará la última concentración de colágeno de 1,67 mg / ml de la red. Una concentración de colágeno mayor o menor tiene un impacto en la densidad de las fibras de colágeno y la distancia media entre ellos concomitante con las células comportamiento migratorio 34. </li><li> Añadir 100 l de la suspensión de colágeno final a 50 l de suspensión celular y mezclar thoroughly.The suspensión de colágeno final (1,67 mg / ml de colágeno) es ligeramente viscosa. Para transferir la cantidad correcta (100 l), la pipeta la solución de colágeno final una vez arriba y abajo antes de transferirla a la suspensión celular. NOTA: Una vez que la mezcla de células en suspensión de colágeno se combina con la solución de bicarbonato de sodio / 10x MEM y el valor del pH ha cambiado a 7,5 las fibras de colágeno comienzan inmediatamente para polimerizar. </li><li> Transferir la mezcla de células en suspensión final de colágeno de Thtubos de reacción e para las cámaras de migración. Golpear suavemente la cámara de migración para distribuir por igual la mezcla de células en suspensión de colágeno en la parte inferior de la cámara de la migración (Figura 1H). Colocar las cámaras de migración en una posición vertical en un bastidor y se incuba durante aproximadamente 30 min (37 ° C, 5% CO 2) para permitir la polimerización de las fibras de colágeno. </li><li> Observe que la red de colágeno polimerizado es ligeramente turbia pero aún siendo la luz de color púrpura. Llenar las cámaras de migración con medio completo o medio completo con suplementos de interés y sellar la cámara de la migración con la mezcla de gelatina de cera de parafina / petróleo (figuras 1I, 1J). </li></ol> 3. registro y análisis de la migración celular En esta sección se describe la grabación de la migración celular por microscopía de vídeo time-lapse y el análisis de la migración celular por el seguimiento manual de células. <ol><li> Encienda el microscopio y el hea platina del microscopioter. Ajustar la temperatura a 37 ° C. Utilice un objetivo de 10X. Coloque cámara de migración bajo un microscopio y enfocar aproximadamente 50 células o más en el campo de visión. </li><li> Migración celular Record en modo de lapso de tiempo utilizando una aplicación de software de vídeo vigilancia multicámara. Guarde las películas de migración celular en un formato adecuado, por ejemplo, &quot;* avi&quot; o &quot;* Mov&quot;. Enlace los archivos de película de migración celular a una base de datos que contiene información de apoyo, tales como el tipo de células y las condiciones experimentales. NOTA: Estamos grabando linfocitos y HSPCs para un máximo de 2 horas usando un factor de lapso de tiempo de 1:80, lo que significa que 0,75 segundos en tiempo-lapse es igual a 1 min en tiempo real. Las células tumorales son células que se mueven lentamente y por lo tanto se registran por lo menos durante 16 horas utilizando un factor de lapso de tiempo de 1: 1800 (0,5 segundos en tiempo-lapse es igual a 15 minutos en tiempo real). </li><li> Analizar películas migración celular utilizando una aplicación de software de seguimiento celular apropiada, como plugins de software ImageJ(Una visión general se da en 18). Para un análisis imparcial que es de crucial importancia que las células serán seleccionados al azar sin el conocimiento si las células son migratorias activo o no. NOTA: Estamos utilizando una aplicación de software libre desarrollado para rastrear manualmente los caminos de al menos 30 células por experimento siguiendo las células en movimiento con precisión con el cursor del ratón (que se sitúa en el núcleo). Mientras que el seguimiento, los xy coordenadas de las células de orugas se determinan automáticamente de acuerdo al modo de lapso de tiempo utilizado. Para linfocitos / HSPCs coordenadas xy se determinan cada 0,75 seg (igual a 1 min de tiempo real), mientras que para las células tumorales las coordenadas xy se determinan cada 0,5 seg (igual a 15 min de tiempo real). </li><li> Determinar un total de 60 xy coordenadas por célula para un experimento típico de la migración celular. Esto es igual a 1 hr en tiempo real para los linfocitos / HSPCs y 15 hr en tiempo real para las células tumorales. A &quot;,&quot; indica que una célula no se ha movido entre two puntos de tiempo, mientras que un &quot;valor numérico&quot; indica la distancia en &quot;píxeles&quot; una célula ha movido entre 2 puntos de tiempo (Figura 2a). NOTA: seguimiento celular manual requiere experiencia. Particularmente células que migran rápido son difíciles de rastrear y cada tipo de células exhiben un comportamiento migratorio distinto que podría ser desencadenada por factores suplementados. En caso de división celular mientras que el seguimiento, elegir al azar una célula hija para el seguimiento continuo. Las células que migran fuera del campo de visión o mueren mientras que el seguimiento no se han descuidado, pero se consideran para el análisis. </li></ol> Análisis 4. Datos <ol><li> Analizar los datos de seguimiento de células mediante el uso de una aplicación de software apropiada, por ejemplo, un programa de hoja de cálculo. <ol><li> Analizar los datos de seguimiento de células copiando la célula de seguimiento de datos en bruto (Figura 2A), en una plantilla de hoja de cálculo de diseño propio. Multiplique suma de los &quot;valores numéricos&quot;, que representala distancia total de una célula ha migrado con un factor de corrección para convertir &quot;pixel&quot; en &quot;m&quot;. </li><li> Determinar dos parámetros de migración celular: la actividad locomotriz (que es equivalente a la tasa de migración) y el tiempo de movimiento activo (Figuras 2C, 2D). </li><li> Identificar las células que han migrado menor que 25 micras (nivel de umbral para reducir el número de células positivas falsas) como células que no se mueva. Vuelva a colocar los &quot;valores numéricos&quot; de estas células con &quot;,&quot;. NOTA: El parámetro &quot;actividad locomotriz&quot; (o tasa de migración) representa el porcentaje de células de la población de células seguimiento que se han movido entre dos puntos de tiempo (Figura 2D). Un &quot;valor numérico&quot; se define como una célula en movimiento, mientras que &quot;,&quot; se define como una célula no en movimiento. El parámetro &quot;tiempo de movimiento activo&quot; (tiempo activo) representa el porcentaje del tiempo total de una célula ha migrado en Remento a los plazos del período de observación (Figura 2C). Un &quot;valor numérico&quot; indica que una célula se ha movido, mientras que &quot;,&quot; indica que una célula no se ha movido. Este parámetro se utiliza además para determinar el número de células que no se ha movido. </li></ol></li><li> Calcular la significación estadística y visualización de datos de migración celular. <ol><li> Calcular la significación estadística de la actividad locomotriz media de la células (tasa de migración) mediante la prueba de Mann-Whitney. Considere el valor de p &lt;0,05 como significativo. </li><li> Mostrar la actividad locomotriz medio de células como xy-diagrama, diagrama DiagramaCaja, o como un diagrama de barras. Mostrar los datos basados ​​en células individuales, tales como el tiempo de movimiento activo o la velocidad, como un diagrama de barras o como un histograma. NOTA: Si la aplicación de software de hoja de cálculo elegido no contiene una tabla o gráfico de histograma herramienta DiagramaCaja una búsqueda en línea se debe realizar para buscar adecuado matorials. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La capacidad de migrar es una característica de las células tumorales 4. Sin la capacidad de desprenderse del tumor primario y para migrar a través de las células tumorales del tejido conectivo circundante no será capaz de sembrar lesiones secundarias, que son la principal causa de muerte de casi todos los pacientes con cáncer. Debido a esta relación muchos estudios se centran en la migración de células de cáncer. El objetivo de estos estudios es la identificación de nuevas moléculas diana y las v...

Al igual que la fusión celular (para una revisión ver 1,2) la migración celular es otro fenómeno biológico que está involucrado en una plétora de procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas y las respuestas inmunes (para una revisión véase 3). Sin embargo, la capacidad de migrar es también un requisito previo para las células tumorales metastatizan a (para revisión ver 3,4). La migración celular es un complejo, proceso aún no completamente entendido que está dirigida por la interacción de varias vías de transducción de señales iniciada por varios ligando (por ejemplo, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas, componentes de la matriz extracelular) del receptor (por ejemplo, tirosina quinasas receptoras, receptores de quimioquinas, integrinas) interacciones 5 en última instancia provocan la reorganización del citoesqueleto de actina concomitante con de- y montaje de complejos de adhesión focal y la integrina mediada por la señalización 6. in vitro y en ensayos de migración celular in vivo se han desarrollado en las últimas décadas, incluyendo el ensayo Boyden cámara / transwell 7, cero ensayo / cicatrización de heridas ensayo de 8-10, en tres dimensiones ( 3D) ensayo de migración de matriz de colágeno 11, así como intravital de imágenes / microscopía (para revisión ver 12). Cada uno de estos ensayos de migración celular tiene ventajas y desventajas, por ejemplo, en relación con los costos y la necesidad de equipos, manipulación o fiabilidad de los datos obtenidos. Tanto la cámara de ensayo Boyden / transwell y el ensayo ensayo de rayado / cicatrización de heridas son fáciles, de bajo costo y ensayos bien desarrollados para medir la migración de células in vitro 7-10. En la cámara de Boyden / Transwell células de ensayo se siembran en la parte superior de un inserto que contiene poros (alrededor de 8 micras de diámetro) - el llamado compartimiento superior 7. Opcional, el inserto podría ser recubierto con m extracelularAtrix componentes, por ejemplo, fibronectina, colágeno, etc, para imitar un entorno más fisiológico. Del mismo modo, las células endoteliales podrían ser cultivadas en la parte superior del inserto, imitando de ese modo una barrera de células endoteliales 13. Aquellas células que han pasado a través de los poros durante un intervalo de tiempo definido en el compartimiento inferior que alberga medios de comunicación y los suplementos, tales como factores de crecimiento y quimiocinas, se utilizan como un dispositivo de lectura para cuantificar la migración celular (o extravasación). En el ensayo de rayado / curativas células de ensayo de la herida se siembran en placas y se cultivan hasta la confluencia 10. En dependencia de las placas de ajuste experimentales podría ser pre-recubierto con componentes de la matriz extracelular, tales como fibronectina. Después de crear un rasguño / herida por raspado de las células individuales en monocapa de células de cada lado del arañazo / herida puede migrar en el espacio, llenando así / curarla 10. La distancia entre los dos lados de los arañazos / heridas se determinaen dependencia del tiempo y se usa como un dispositivo de lectura para la actividad migratoria de las células 10. Sin embargo, para discriminar entre la proliferación celular (que podría resultar también en el llenado / curación del cero / herida) y la migración celular se recomienda combinar el ensayo con microscopía de vídeo de lapso de tiempo y de una sola célula de seguimiento 10. Sin embargo, tanto la cámara de Boyden / ensayo Transwell y cero ensayo / ensayo de cicatrización de la herida, son más bien imperfecta relativa a un entorno celular-como fisiológico. En la cámara de Boyden / células de ensayo Transwell tienen que migrar a través de un poro de plástico, mientras que en el ensayo de rayado / cicatrización de heridas células de ensayo se sembró en una placa de plástico pre-recubierto de dos dimensiones. Asimismo, es bien reconocido que el comportamiento migratorio difiere notablemente entre un medio ambiente de dos dimensiones y 3D 3. Por ejemplo, las adherencias en tres dimensiones de matriz de fibroblastos se diferencian de las adhesiones focales fibrilares y caracterizados en dossustratos -dimensionales en su contenido de α5β1 y integrinas αvβ3, paxilina, otros componentes del citoesqueleto, y la fosforilación de tirosina quinasa de adhesión focal 14. Del mismo modo, las células embebidas dentro de un entorno 3D también muestran un comportamiento migratorio alterada 15. Así, para analizar la migración de células con más precisión un ensayo de migración se recomienda permitir para medir la migración de células individuales dentro de un entorno fisiológico o fisiológico-como 3D. Intravital de imágenes / microscopía es el estándar de oro para la medición de la migración de células dentro de un contexto fisiológico 3D. Esto no sólo pertenecen a las interacciones célula-matriz extracelular, sino también a las interacciones entre los diferentes tipos de células, tales como células tumorales y las células endoteliales durante la extravasación 16 o el tráfico de linfocitos en el ganglio linfático 17, que, hasta la fecha, es posible debido a mejora de las técnicas de microscopía de fluorescencia, tales como 2-fotónmicroscopía de barrido láser confocal, el uso de colorantes fluorescentes vitales y cepas de ratones transgénicos que expresan proteínas fluorescentes derivados 12,16,17. Además, intravital de imágenes / microscopía podría combinarse con el seguimiento de células manual y automatizado 18. Sin embargo, debido a la necesidad de un 2-fotón láser confocal de microscopía de barrido, así como animales (y modelos de animales transgénicos adecuados) intravital de imágenes / microscopía es una técnica bastante onerosa. Para superar las limitaciones de la cámara de ensayo Boyden / transwell y el ensayo de curación de cero ensayo / herida y para analizar la migración de diferentes tipos de células dentro de un entorno 3D el ensayo de migración de matriz de colágeno 3D fue desarrollado 11,19. De esta manera, las células que migran están incrustados dentro de una red de fibras de colágeno en 3D, lo que más se asemeja a la situación in vivo. Conjuntamente, debido al time-lapse video microscopía migración celular verdadero se mide lo que permite la deternación de varios parámetros de migración, así como sus alteraciones en respuesta a factores pro-migratorias o inhibidores. Varios tipos de células podrían ser analizados usando esta técnica, incluyendo linfocitos y leucocitos 11,20 madre hematopoyéticas, células progenitoras / 21-24, y las células tumorales 5,25-29. Además de las células individuales también cúmulos celulares o esferoides pueden ser incrustados dentro de la matriz de colágeno concomitante con el análisis de la emigración de las células individuales del grupo de células / esferoide en el colágeno celosía 30,31. Este protocolo presenta una visión general acerca de una técnica sencilla, pero de gran alcance para analizar el comportamiento migratorio de diferentes tipos de células dentro de un entorno 3D - un método in vitro ceder en los resultados que están cerca de la situación in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Leica DM IL inverted microscope</td>
			<td style="width:192px;">Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Microscope stage heater</td>
			<td style="width:192px;">Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">JVC C1431 video camera</td>
			<td style="width:192px;">JVC, Bad Vilbel, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Axis 241Q video server</td>
			<td style="width:192px;">Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Mac G5 Computer</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">iMac</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">FileMaker Pro</td>
			<td style="width:192px;">FileMaker GmbH, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td>
			<td style="width:192px;">Bensoftware, London, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Runtime Revolution Media 2.9.0</td>
			<td style="width:192px;">RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Paraffin</td>
			<td style="width:192px;">Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">A4264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Petrolatum jelly</td>
			<td style="width:192px;">local drug store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Purecol (liquid collagen)</td>
			<td style="width:192px;">Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">10x MEM</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">7.5% Sodium Bicarbonate solution</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">EGF</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">U73122</td>
			<td style="width:192px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662035</td>
			<td>dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

La capacidad de migrar es un sello de diversos tipos de células y juega un papel crucial en diversos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, y la respuesta inmune. Sin embargo, la migración celular también es un mecanismo clave en el cáncer permitiendo estas células cancerosas para desprenderse del tumor primario para iniciar la diseminación metastásica. En los últimos años se han desarrollado varios ensayos de migración celular para analizar el comportamiento migratorio de diferentes tipos de células. Debido a que el comportamiento de locomoción de las células difiere notablemente entre una de dos dimensiones (2D) y tres dimensiones medio ambiente (3D) se puede suponer que el análisis de la migración de las células que están incrustados dentro de un entorno 3D produciría en la migración celular más significativo datos. La ventaja del ensayo de migración de matriz de colágeno 3D descrito es que las células están incrustadas dentro de una red 3D fisiológica de las fibras de colágeno que representan el componente principal de la matriz extracelular. Debido alapso de tiempo de microscopía de vídeo real de la migración celular se mide permitiendo la determinación de varios parámetros de migración, así como sus alteraciones en respuesta a factores pro-migratorias o inhibidores. Varios tipos de células podrían ser analizados usando esta técnica, incluyendo linfocitos / leucocitos, células madre, y células tumorales. Del mismo modo, también grupos de células o esferoides pueden ser incrustados dentro de la matriz de colágeno concomitante con el análisis de la emigración de las células individuales del grupo de células / esferoide en la red de colágeno. Llegamos a la conclusión de que el ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es un método versátil para analizar la migración de células dentro de un entorno 3D-como fisiológico.

El ensayo de migración de matriz 3D-colágeno utilizado combinado con lapso de tiempo de video-microscopía y seguimiento celular asistida por ordenador permite la determinación de diversos parámetros de migración celular, incluyendo tanto parámetro basado en la población (por ejemplo, la media de la actividad locomotriz) y parámetros basados ​​en células individuales (por ejemplo, el tiempo de movimiento activo, velocidad, distancia migró). Un ejemplo de los conjuntos de datos de seguimie...

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Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

La migración celular es un fenómeno biológico que está involucrada en una gran cantidad de fisiológicos, tales como la curación de heridas y las respuestas inmunitarias, y los procesos fisiopatológicos, como el cáncer. El ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es una herramienta versátil para analizar las propiedades migratorias de diferentes tipos de células dentro de un entorno fisiológico-como 3D.

Análisis de la migración de células dentro de una matriz de colágeno tridimensional

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.5K vistas.  Witten/Herdecke University.  La migración celular es un fenómeno biológico que está involucrada en una gran cantidad de fisiológicos, tales como la curación de heridas y las respuestas inmunitarias, y los procesos fisiopatológicos, como el cáncer. El ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es una herramienta versátil para analizar las propiedades migratorias de diferentes tipos de células dentro de un entorno fisiológico-como 3D. 

Video: Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Impresión plana y tridimensional de tintas conductoras

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Investigación

Bioingeniería

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Células vivas imágenes de la migración de las células que expresan proteínas de fluorescencia etiquetado en una matriz tridimensional

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Tridimensional de la célula modelo de cultivo para medir los efectos del flujo del fluido intersticial en la invasión de células tumorales

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Gel System Concentric para estudiar el papel de Biofísica de Matrix Microambiente en la migración de células en 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Sistema de Difusión de degradado para Investigar quimiotaxis en una matriz de colágeno 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper composition, targeted modulus, and well-defined architectural features. Biomaterials that recapitulate the intrinsic architecture of in vivo tissue are vital for studying diseases as well as to facilitate the regeneration of lost and malformed soft tissue. A novel biofabrication technique was developed which combines state of the art imaging, three-dimensional (3D) printing, and selective enzymatic activity to create a new generation of biomaterials for research and clinical application. The developed material, Bovine Serum Albumin rubber, is reaction injected into a mold that upholds specific geometrical features. This sacrificial material allows the adequate transfer of architectural features to a natural scaffold material. The prototype consists of a 3D collagen scaffold with 4 and 3 mm channels that represent a branched architecture. This paper emphasizes the use of this biofabrication technique for the generation of natural constructs. This protocol utilizes a computer-aided software (CAD) to manufacture a solid mold which will be reaction injected with BSA rubber followed by the enzymatic digestion of the rubber, leaving its architectural features within the scaffold material.

An innovative biofabrication technique was developed to engineer three-dimensional constructs that resemble the architectural features, components, and mechanical properties of in vivo tissue. This technique features a newly developed sacrificial material, BSA rubber, which transfers detailed spatial features, reproducing the in vivo architectures of a wide variety of tissues.

Tridimensional Tecnología Biomimética: Novel biorubber Crea Definido micro y macro escala Arquitecturas de colágeno hidrogeles

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Preparación y análisis de<em&gt; In Vitro</em&gt; Tres de mama Carcinoma de dimensiones Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.