Damos las gracias al Dr. Grant Sumida para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un Premio al Investigador Joven Beckman (SY), el Premio Hellman Familia Nueva Facultad (SY), EUREKA NIH, la Universidad de California de Investigación del Cáncer del Comité de Coordinación.

1. Generación de línea celular estable (por ejemplo, las células MDCK) <ol><li> Células de la placa a 80-90% de confluencia en una placa de p35. No permita que las células del 100% de monocapa, lo que reducirá la eficiencia de transfección. </li><li> Transfectar las células con el plásmido de interés utilizando Lipofectamine 2000. Optimizar las condiciones de transfección utilizando el protocolo del fabricante. </li><li> Al día siguiente, el paso de las células en dos p150 placas de Petri. El plato grande se recomienda dejar suficiente espacio entre las colonias estables. </li><li> Al día siguiente, cambio de los medios de comunicación y añadir 500 g / ml de G418 para cada plato. La concentración G418 deben ser optimizados para las líneas de células individuales. </li><li> Cambiar los medios de comunicación todos los días durante aproximadamente 2 semanas. Después de 2 semanas, G418 resistentes a las colonias que comienzan a formarse, y será visible por el ojo desnudo. </li><li> Utilizando un microscopio de fluorescencia invertido, identificar las colonias de GFP positivos. Marcar estas colonias en la placa con un rotulador. </li><li> A selectivamente trypsinize las colonias de la placa de cultivo de tejidos, aspirar a los medios de comunicación, y se lavan las células dos veces con PBS o solución de tripsina. En el segundo lavado, no aspirar a que toda la solución. Deja una fina capa de líquido en la parte inferior de la placa para evitar que las células se sequen. </li><li> Para cada colonia marcada: usar un hisopo de algodón esterilizados para limpiar lo más cerca posible de todo el borde de la colonia. Esto creará una isla de la zona húmeda que contiene la colonia de células. Pipeta de 10 l de tripsina en la colonia. Repita la operación para todas las colonias, y proceder con rapidez para evitar la desecación. Un investigador con experiencia por lo general puede tomar aproximadamente 12 colonias por placa p150. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C durante 5-10 minutos hasta que las células se desprenden de la placa y aparecen todo el año. </li><li> Para cada colonia: Pipetear 10 l de tripsina en la colonia, y la pipeta hacia arriba y abajo un par de veces para separar las células de la placa. A continuación, una pipeta de todas las células de la colonia en un solo pozo en un plato de 24 pocillos. </li> &lt;li&gt; Después de colonias estables han crecido, la expresión de proteínas de cada colonia se analiza el uso estándar occidental blot e inmunofluorescencia. Ampliar estas líneas de células para su posterior análisis. </li></ol> 2. Modificación de superficies del plato con fondo de cristal para la unión de colágeno óptima (Opcional) <ol><li> Para silanizar el cristal, una pipeta 300 l de 2% 3-aminopropiltrimetoxisilano solución en la parte de vidrio de cada plato p35 con una abertura de 10 mm. Ver Figura 1 para la silanización y entrecruzamiento de esquemas. 3-aminopropiltrimetoxisilano se diluye en el agua filtrada. </li><li> Se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar la solución de 3 aminopropiltrimetoxisilano y lavar con agua filtrada tres veces durante 10 minutos cada uno. </li><li> Aspirar a los platos de agua y colocar en un plato caliente ajustado a 50 ° C durante 1,5 horas. Tapas lugar de platos un poco del plato para que la humedad en el plato se puede escapar. </li><li> Sacar los recipientes de fuego y se deja arrullarl. </li><li> Pipeta de 300 l de solución de glutaraldehído al 2% en la parte de vidrio de cada plato. El glutaraldehído se diluye en PBS. </li><li> Incubar durante 1 hora. </li><li> Aspirar la solución de glutaraldehído y lavar los platos con PBS tres veces durante 10 minutos cada uno. </li><li> Esterilizar los platos a la exposición a los rayos UV durante 1 hora. Los platos silanizada se puede almacenar a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Preparación de gel de colágeno en 3D con partículas de trazador <ol><li> Lávese las partículas fluorescentes del marcador al girar por 100 l de acciones partículas trazadoras (10 10 partículas / ml) en una centrífuga a 15.000 rpm durante 5 minutos, se aspira el líquido y añadir 500 l de los medios de comunicación. Repita 5 veces. Tras el último lavado, las partículas se resuspenden en 30 l de los medios de comunicación. </li><li> Trypsinize células GFP expresar, como de costumbre. </li><li> Resuspender pellet de células de aproximadamente 2 x 10 6 células / ml. </li><li> Pipeta de 240 l de medio de cultivo en un tubo Eppendorf. </li><li> Añadir 12,6 l de Hepes 1M, 20 l de agua filtrada, 50 l de solución de la célula, de 10 l de partículas fluorescentes. </li><li> Por último, añadir 167 l de colágeno dermis bovina que la solución (para obtener una concentración de trabajo de 1 mg / ml). </li><li> Mezcle la solución a fondo, después pipeta de 80 l de la solución en la parte de vidrio del plato con fondo de cristal silanizado. </li><li> Introducir la cápsula en la incubadora y permitir que el gel se polimeriza a 37 ° C durante 30 minutos. Ver Figura 1A de gel de colágeno típico en un recipiente de vidrio p35 inferior. </li><li> Añadir 2 ml de medio de crecimiento con cuidado para cada plato. </li></ol> 4. Procedimiento para la adquisición de la imagen de lapso de tiempo <ol><li> Encienda el control de la temperatura del recinto microscopio y deja que la cámara alcance equilibre a una temperatura de estado estacionario a 37 ° C. Ver Figura 2 para un ejemplo de sistema de imágenes de células vivas. </li><li> Cambiar los medios de comunicación a los nuevos medios suplementado con 25 mM Hepes para mantener un pH neutro. ParaDIC imágenes, el intercambio de la parte superior del plato con uno que tiene una tapa de cristal. Utilizando una tira fina de parafina, la cubierta del lado del plato para evitar la evaporación de los medios de comunicación. </li><li> Para un objetivo de inmersión en aceite, coloque una gota de líquido de inmersión en el objetivo. </li><li> El gel de colágeno que contiene un plato sobre platina del microscopio, y asegúrese de que el plato se pone en contacto con el líquido de inmersión. </li><li> El enfoque de la muestra y la búsqueda de las células de interés para la imagen. Para minimizar la deriva de la etapa, permitirá plato que conformarse con unos 45 minutos antes de comenzar una captura de largo. </li><li> Especificar los parámetros de adquisición de imágenes. Minimizar la exposición al láser, lo que podría dañar las células, mediante la modulación de la potencia del láser, el tiempo de exposición, la frecuencia y la duración de tiempo de captura. Los parámetros reales pueden variar con el sistema de microscopio y el tipo de células. </li><li> Durante la adquisición de lapso de tiempo, un inhibidor puede ser añadido. Para el experimento además de inhibidores, no sella el recipiente con parafilm. <ol><li> Preparaciónse Hepes complementado los medios de comunicación con las drogas a una concentración de trabajo deseada. </li><li> Cuando esté listo para añadir fármacos a los medios de comunicación, una pausa en la captura de la imagen, y retirar con cuidado la parte superior plato sin alterar el plato. </li><li> Aspirar a los medios de comunicación en el plato, y la pipeta de la droga que contienen los medios de comunicación en el plato. A continuación, vuelva a colocar cuidadosamente la parte superior plato. </li><li> La muestra puede estar fuera de foco debido a la adición de los nuevos medios, reajustar el enfoque. </li><li> Reiniciar la captura, a continuación, control de las capturas para los próximos 30 minutos, y reajustar el enfoque según sea necesario. Ver Figura 4 para un ejemplo de experimento de drogas además. </li></ol></li></ol> 5. FRAP procedimiento y el análisis <ol><li> La configuración del FRAP varía entre los sistemas, siga las instrucciones del fabricante. </li><li> Configurar los parámetros de células vivas imágenes. </li><li> Configurar los parámetros de photobleaching. Utilice la potencia del láser suficiente para photobleach la señal fluorescente, sin dañar la célula. Prueba de estos parameters en las células de la práctica. </li><li> Iniciar la captura de imágenes, y permitir por lo menos 5 cuadros de captura de la imagen antes de photobleaching la región de interés. </li><li> Continuar la captura y el tiempo de recuperación debe ser suficiente para captar la recuperación de fluorescencia completa. Véase la Figura 5 muestra un ejemplo de experimento FRAP. </li><li> Analizar la recuperación de fluorescencia mediante la medición de la intensidad media de fluorescencia de la zona photobleached (antes y después de photobleaching) a través del tiempo. El uso de un software de análisis estadístico (por ejemplo, Excel), el ajuste de la curva de recuperación de la ecuación exponencial: I = I f (1-e-kt), donde I es la intensidad, I f es la intensidad final, t es el tiempo, y τ ½ es el tiempo que tarda la intensidad para llegar a la mitad del valor final: τ = ½ ln (2) / k. El medio tiempo es una medida de la tasa de movilidad de la proteína. </li><li> Obtener los parámetros, la mitad de tiempo y la intensidad final de la curva exponencial de ajuste. Calcular ªe móvil fracción tomando la relación de la final para inicial la intensidad de fluorescencia. </li></ol> 6. Resultados representante Un ejemplo de la imagen en vivo de las células sanas de las células epiteliales dentro de la matriz se muestra en la Figura 3. Las células sanas presentan una membrana suave y continua, y núcleo diferenciado, mientras que las células enfermas a menudo tienen una membrana interrumpido, y un excesivo número de vacuolas. En una matriz 3D, solo las células epiteliales migran 1, y en el transcurso de varios días, las células epiteliales de forma tridimensional, esférico, multicelulares quistes dentro de la matriz 2. Las células también son muy dinámicos, y migran dentro del quiste (Figura 3). La deformación de la matriz como consecuencia de las fuerzas de tracción ejercida por la migración de las células se analiza a través del desplazamiento de las partículas de trazador incrustados en la matriz circundante (Figura 4). Los movimientos de las partículas del trazador se muestran como una imagen de proyección máximo de diferenciadiferentes puntos de tiempo, y cada momento es pseudo-color para indicar el tiempo (Figura 4B). Por otra parte, las imágenes de una partícula de trazador individuales se muestran como un montaje para mostrar el movimiento de la partícula de trazador en el tiempo (Figura 4C). Todos los análisis de imágenes se realizó con ImageJ. Estas evaluaciones cualitativas de la deformación de la matriz, y por lo tanto, las fuerzas ejercidas por las células que migran, son primera aproximación útil de la distribución de fuerza de tracción. La estimación cuantitativa de las fuerzas de tracción ejercida por la migración de células en 3D está fuera del alcance de este protocolo y se describe en otro 3,4. Un típico de recuperación después de fluorescencia photobleaching experimento se muestra en la Figura 5. La región de interés debe ser photobleached con los ajustes optimizados por láser para que la intensidad de la fluorescencia es visiblemente menor en comparación con los niveles de fondo (para maximizar la relación señal-ruido), mientras que mantiene las células sanas y en buen estado. La configuración óptima que be determinada empíricamente, ya que cada instalación FRAP es diferente (por ejemplo, FRAP mediante láser confocal de barrido del sistema). La exposición y el intervalo de tiempo de adquisición de imágenes post-FRAP deben ser cuidadosamente controlados para evitar photobleaching fondo. El uso de la potencia del láser más bajo, corto tiempo de exposición, y el uso de la cámara óptica de alta sensibilidad y eficientes son esenciales para obtener imágenes de alta calidad FRAP. Si la fluorescencia de blanqueo durante la adquisición de la imagen es importante, este desvanecimiento de fondo debe ser cuantificado y normalizado a partir de la recuperación de la intensidad de fluorescencia observado. Debido a la naturaleza 3D del medio ambiente, la componente z de la recuperación de la intensidad de fluorescencia puede ser importante. Por lo tanto, es importante definir un volumen photobleached mediante la adopción de pre y post-stack en 3D las imágenes de la región photobleached. Su posterior análisis y modelización de la recuperación de la fluorescencia se discute en otra parte 5,6. La combinación única de imágenes de células vivas, techniques: las buenas prácticas agrarias para seguir la dinámica de las proteínas del citoesqueleto, la fluorescencia roja partículas de seguimiento para controlar la deformación de la matriz, y la adición de los inhibidores, se pueden utilizar simultáneamente para el análisis de la dinámica de las proteínas, la fuerza de tracción y las vías moleculares. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" /> Figura 1. Preparación de gel de colágeno. A) la matriz de colágeno polimerizado en un plato con fondo de vidrio. El color rosado del gel se debe a las partículas fluorescentes incrustados. B) Procedimiento para el tratamiento de los platos de fondo de cristal para entrecruzar el gel de colágeno de la superficie del vidrio. En primer lugar, el plato de fondo de cristal se trata con 3 aminopropiltrimetoxisilano solución, solución de glutaraldehído que crosslinks la matriz de colágeno de la copa. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" /> Figura 2. Esquema de la configuración del microscopio confocal / FRAP. El confocalmicroscopio se basa en un AxioObserver Zeiss con un CoolSnap cámara CCD HQ II y completamente automatizado por Slidebook software (Intelligent innovaciones de imagen). La unidad confocal es personalizado y basado en la unidad de disco giratorio CSU10 Yokogawa y dos láseres de estado sólido (488 nm con 50 mW y 561 nm, con 40 mW) con acústico-óptico sintonizable filtro (AOTF) para permitir el cambio entre dos milésimas de segundo láser. Los filtros de emisión nm 525/50 y 620/60 nm (# 118661 # 118085 y, Chroma Technology) y espejo dicroico es 488-568 Brightline banda dual (Semrock). Los objetivos son una larga distancia de trabajo 40x C-Apochromat objetivo con NA 1.1 y distancia de trabajo de 0,62 mm, y un 63x Plan-Apochromat objetivo con NA 1.4 y una distancia de trabajo de 0,19 mm. El microscopio también incluye un sistema de fotoablación FRAP, que consiste en una fibra de bombeo óptico láser de colorante, una posición ordenador haz controlado e intensidad, y un tamaño de spot de difracción limitada. Además, el microscopio está equipado conuna etapa XY motorizado que incluye 0,1 micras codificadores lineales en cada eje. Durante el time-lapse, la temperatura ambiente se mantiene por una cámara del microscopio diseñado y un calentador con control de temperatura de retroalimentación. Para aislar el ruido y las vibraciones, el sistema de microscopio entero es de una vibración libre de la tabla. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" /> Figura 3. En vivo de imágenes de células de las células epiteliales que expresan GFP-actina. Estas células forman un quiste después de 4 días de cultivo en una matriz de colágeno en 3D. Algunas células se mueven a lo largo de la superficie del quiste (punta de flecha amarilla), mientras que otros emigran en el interior del quiste (rojo punta de flecha). Barra de escala 10 micras, el tiempo en horas. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" /> Figura 4. El efecto de la inhibición de la Rho-kinasa en la fuerza de tracción. A) Imagen DIC de una célula de la migración de MDCK expresar GFP etiquetados marcador nuclear. La imagen fue tomada inmediatamente antes del tratamiento de la Rho-kinasa inhibidor de la Y-27632. Barra de escala 10 micras. B) el desplazamiento de partículas resultantes de la adición de Y-27632. Las posiciones de las partículas en diversos puntos temporales (0 - 52 min) fueron pseudo-color de acuerdo a la escala de intensidad, proyecta en una sola imagen. La región de blanca es el núcleo GFP positivos en la migración de las células. Barra de escala 10 micras. Tiempo en minutos. C) La partícula de movimiento en el borde de salida de la celda (ver flecha en B). Asterisco indica el último fotograma capturado antes de Y-27632 además. La partícula de trazador se trasladó hacia y desde fuera del borde de salida de la celda de la migración de antes y después de la adición de Y-27632, respectivamente. Barra de escala 1 micra. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" /> Figura 5. FRAP análisis de GFP-actina expresión de la migración de células en una matriz tridimensional. A) las imágenes Timelapse de la GFP-actina de la célula que expresa antes y después del photobleaching. Una pequeña región de la GFP-actina acumulada en la parte trasera de células se photobleached (rojo punta de flecha) en el punto de tiempo 0. Tiempo en segundos, la barra de escala 5 micras. B) La intensidad media de fluorescencia de la región photobleached (línea continua), y el ajuste exponencial de la recuperación de fluorescencia (círculos) en función con el tiempo. La intensidad de fluorescencia se normalizaron al valor inicial antes de photobleaching.

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	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Aquí se describe un método para el uso de células vivas de imagen para estudiar los mecanismos de migración de las células en una matriz tridimensional. El éxito de esta técnica depende de la obtención de &quot;buenos&quot; clones que expresan establemente GFP-etiquetados proteínas. El bajo nivel de las proteínas GFP requerirá una exposición excesiva excitación que compromete la salud de las células, mientras que el nivel demasiado alto, las buenas prácticas agrarias tienen efectos secundarios indeseables...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Colágeno, bovino, Tipo I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Archivo es de aproximadamente 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropiltrimetoxisilano </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Diluir en agua </td></tr><tr><td> glutaraldehído </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 340855 </td><td> Diluir en PBS </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Poliestireno Fluospheres microesferas de 1 micra, fluorescencia roja (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticina (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Los medios de cultivo componentes: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> El suero fetal bovino </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Tradicionalmente, la migración celular se ha estudiado en dos dimensiones, las superficies de plástico rígido. Sin embargo, durante los procesos biológicos como la cicatrización de heridas, regeneración de tejidos y metástasis del cáncer, las células deben navegar a través de complejos de tres dimensiones del tejido extracelular. Para comprender mejor los mecanismos detrás de estos procesos biológicos, es importante examinar las funciones de las proteínas responsables de conducir la migración celular. Aquí, se describe un protocolo para estudiar los mecanismos de migración celular utilizando la línea de células epiteliales (MDCK), y en tres dimensiones, fibroso, la auto-polimerización de la matriz como un sistema modelo. Esta matriz extracelular ópticamente claro es fácilmente susceptible de estudios de imágenes de células vivas y una mejor imita el entorno fisiológico, los tejidos blandos. Este informe demuestra una técnica para visualizar de manera directa la localización de proteínas y la dinámica, y la deformación de los alrededores en tres dimensiones de la matriz. Examenmen de localización de la proteína y la dinámica en los procesos celulares proporciona información clave en las funciones de las proteínas. Genéticamente codificados etiquetas fluorescentes proporcionan un método único para la observación de localización de la proteína y la dinámica. Usando esta técnica, podemos analizar la acumulación subcelular de la clave, la fuerza generadora de los componentes del citoesqueleto en tiempo real como las maniobras de la célula a través de la matriz. Además, el uso de múltiples etiquetas fluorescentes con diferentes longitudes de onda, podemos examinar la localización de las proteínas de forma simultánea, lo que nos permite poner a prueba, por ejemplo, si las diferentes proteínas tienen funciones similares o divergentes. Además, la dinámica de las proteínas marcadas con fluorescencia se puede cuantificar el uso de recuperación después de photobleaching fluorescente (FRAP) el análisis. Esta medición de la movilidad de los ensayos de proteína y cómo de manera estable las proteínas están obligados a la red del citoesqueleto. Mediante la combinación de imágenes de células vivas con el tratamiento de los inhibidores de la función de la proteína,podemos analizar en tiempo real los cambios en la distribución de las proteínas y la morfología de las células que migran. Además, también se combinan imágenes de células vivas con el uso de partículas de trazador fluorescente integrado dentro de la matriz para visualizar la deformación de la matriz durante la migración celular. Por lo tanto, podemos visualizar cómo una célula migrar distribuye la generación de la fuerza de las proteínas, y donde las fuerzas de tracción que se ejerce la matriz circundante. A través de estas técnicas, se puede obtener información valiosa sobre el papel de proteínas específicas y sus contribuciones a los mecanismos de migración celular.

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Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Procesos celulares, tales como la migración celular tradicionalmente han sido estudiados en dos dimensiones, las superficies de plástico rígido. Este informe describe una técnica para visualizar de manera directa la localización de proteínas y el análisis de la dinámica de proteínas en las células que migran de una manera más fisiológicamente relevantes, matriz tridimensional.

Células vivas imágenes de la migración de las células que expresan proteínas de fluorescencia etiquetado en una matriz tridimensional

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

live-cell-imaging-migrating-cells-expressing-fluorescently-tagged

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K vistas.  University of California, Davis. Procesos celulares, tales como la migración celular tradicionalmente han sido estudiados en dos dimensiones, las superficies de plástico rígido. Este informe describe una técnica para visualizar de manera directa la localización de proteínas y el análisis de la dinámica de proteínas en las células que migran de una manera más fisiológicamente relevantes, matriz tridimensional.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Investigación

Bioingeniería

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Impresión plana y tridimensional de tintas conductoras

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universal de mano-tridimensional optoacústica Imaging Sonda de Tejido Profundo Angiografía Humano y Estudios preclínicos funcionales en Tiempo Real

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Análisis de la migración de células dentro de una matriz de colágeno tridimensional

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Generación de una tridimensional grosor de la piel completa y automatizada Equivalente Heridas

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Escritura de Electrospinning de andamios Poly(ε-caprolactone) tridimensional con morfologías controlables para aplicaciones de ingeniería de tejidos del derretimiento

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...