Name: cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system
Uploaded: 2014-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System at JoVE.com

This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.

1. Login <ol><li> Encienda el biorreactor. Haga clic en cualquier lugar para abrir la página de inicio de sesión. Seleccione el nombre de usuario y escriba la contraseña y haga clic en &quot;Iniciar sesión&quot;. </li></ol> 2. Calibración <ol><li> Calibrar sensor de pH (2 puntos antes de la esterilización en autoclave). </li><li> Inspeccione sensor de pH y confirme la punta del sensor se llena con solución electrolítica. Prepare dos vasos con soluciones de calibración pH (electrolitos) pH 4 y pH 7 y disponer de una botella de lavado con agua destilada. </li><li> Conectar el cable de pH para el sensor de pH. Vaya a la pestaña &quot;Acciones&quot; en la interfaz de Hola y haga clic en &quot;calibrar&quot;. Ingrese temperatura del tampón en el campo de temperatura solución de calibración. </li><li> Coloque el sensor de pH en tampón 1 (pH 4) e introduzca el valor en el campo &quot;cero&quot;. Espere a que el gráfico se estabilice y el clic en el botón &quot;calibrar 1&quot;. Enjuague el sensor de pH con agua destilada. </li><li> Coloque el sensor en tampón 2 (pH 7). Ingrese búfer2 valor en el campo &quot;span&quot;. Espere a que se estabilice el gráfico y haga clic en la calibración de 2 botones. </li><li> Haga clic en &quot;Guardar&quot; y luego haga clic en &quot;Cerrar&quot;. </li><li> Calibrar el sensor de oxígeno disuelto (OD). </li><li> Asegúrese de que el sensor de oxígeno se ha polarizado al ser conectado al sistema durante varias horas. Vaya a la pestaña &quot;Acciones&quot; en la interfaz de Hola y haga clic en Calibrar. Haga clic en el botón &quot;HACER A&quot;. </li><li> Desconecte el sensor de oxígeno y escriba 0 en el campo &quot;cero&quot;. Espere a que el gráfico se estabilice y el clic en el botón &quot;Calibrar 1&quot;. </li><li> Vuelva a conectar el sensor de oxígeno y escriba 100 en el campo &quot;Span&quot;. Espere a que el gráfico se estabilice y el clic en el botón &quot;Calibrar 2&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;Guardar&quot; y luego haga clic en &quot;cerrar&quot;. </li></ol> 3. Autoclave e instalación de sensores y recipientes de reactivos <ol><li> Después de la calibración, los sensores de lugar y así térmica en autocLave y bolsas de autoclave durante 30 min a 121 ° C, 15 psi. </li><li> Desinfectar las bolsas de autoclave con 70% alcohol isopropílico (IPA) y bolsas de transferencia a cabina de seguridad biológica (BSC). Retire el embalaje exterior del buque. </li><li> Desinfectar envase interior con un 70% de IPA y transferir buque cabina de seguridad biológica (BSC). Retire el embalaje interior e inspeccionar el buque y la tubería por los daños infligidos durante el envío. </li><li> Instale el pH y DO sensores en los dos puertos frontales. Instale el bienestar térmico en el puerto lateral izquierdo. Abra la tapa del sensor. </li><li> Guía del sensor a través del puerto del sensor. Pase el sensor firmemente en el puerto. </li><li> Transferencia recipiente de BSC. </li><li> Cuelgue la DO y cables de los sensores de pH fuera de la manga del vaso y compruebe que no hay nada en la manga. Deslice el recipiente dentro de la funda, los pies por delante. </li><li> Coloque con cuidado el sensor de temperatura en el pozo termal buque. Asegúrese de que el fondo del recipiente se apoya contra los calentadores. </li><li> Retirela tubería fija de sus bolsas. Partido codificación de color en el tubo a los conectores correspondientes y bombas en la unidad de control biorreactor. </li><li> Instale la línea de gas principal presionando el conector en su salida de gas. Instale la línea de gas micro girando el conector hacia la derecha en la salida de gas. Instale el tubo de filtro de escape: </li><li> Abrir la estufa filtro. Asegure el filtro de escape en el canal en U de modo que su tubo pasa por los dos ganchos al filtro y fuera del horno. </li><li> Instale el tubo de la bolsa de condensador en el soporte de la tubería. Cierre la puerta. </li><li> Ruta líneas adición de A y B, ambas líneas de comunicación, y la línea de cosecha detrás del sensor de oxígeno y en el banco junto a la unidad de control de bioreactor. </li><li> Conecte los cables a los sensores de oxígeno y pH. </li></ol> 4. Añadir medianas y micro-portadores <ol><li> Vaya a la pestaña &quot;acciones&quot; y haga clic en &quot;Control de Bombas&quot; en la interfaz de la computadora. </li><li> Formar un esterilizadorLe conexión entre una línea sin usar medio de adición (1 banda naranja) y la fuente de la botella / bolsa de medio por soldadura el tubo o el uso de accesorios Luer. </li><li> Haga clic en el control deslizante para encender la bomba de los medios de comunicación en. Haga clic en el control deslizante para activar los medios de comunicación de la bomba después de adición deseada cantidad de medio. </li><li> Coloque microportadoras cuentas en Ca 2 +, Mg 2 + PBS libre durante 3 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavar perlas varias veces con Ca 2 +, Mg 2 + PBS libre. </li><li> Autoclave durante 15 min a 115 ° C, 15 psi. NOTA: Añadir 3 g / L (peso en seco) en este experimento. </li><li> Bomba en micro-soportes que han sido hidratadas, lavados y esterilizados en autoclave en el reactor de la misma manera se añadió el medio en el paso 4.1. </li></ol> 5. de equilibrado y de un punto de calibración HACER <ol><li> Establecer los controladores a Automático e introducir los puntos de ajuste deseados. Aquí, utilice Agitación Set Point (SP) = 15 rpm, temperatura SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Espere a que el parámetros se equilibren. </li><li> Confirmar sensor es completamente polarizada. Confirmar DO valor actual se ha estabilizado. </li><li> Vaya a la pestaña &quot;Acciones&quot; y haga clic en &quot;calibrar&quot;. Haga clic en &quot;DO A&quot;, haga clic en &quot;One-punto&quot;. </li><li> Introduzca &quot;100&quot; en el campo &quot;Span&quot;. Haga clic en el botón &quot;Calibrar 1&quot;, haga clic en &quot;Guardar&quot; y haga clic en &quot;cerrar&quot;: </li></ol> 6. de iniciar una ejecución <ol><li> Vaya a la pestaña Acciones. Haga clic en &quot;lotes&quot;. Utilice el teclado en pantalla o un teclado externo para ingresar un nombre de lote de 16 caracteres o menos. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Ocultar&quot; del teclado en pantalla. Haga clic en &quot;Iniciar lote&quot; confirme haciendo clic en &quot;Inicio&quot; en la superposición. </li></ol> 7. inoculan con células <ol><li> Formar una conexión estéril entre un (banda naranja 1) línea de adición de medio sin usar y la botella de células / fuente bolsa por soldadurael tubo o el uso de los accesorios Luer. </li><li> Instale la sección de silicona de la tubería en la bomba de los medios de comunicación por lo que la flecha apunte hacia la tubería entre la bomba y el recipiente. </li><li> Compruebe pinza de la línea está abierta y su pinza de la línea ramificada está cerrado. Haga clic en el control deslizante para encender la bomba de los medios de comunicación en y haga clic en &quot;No&quot;, después de la adición de las células. </li><li> Vaya a la pestaña &quot;Acciones&quot; y haga clic en &quot;Bombas de control&quot;. </li></ol> 8. Muestreo <ol><li> Después de inocular y tan frecuentemente como se desee para controlar la cultura, extraer una muestra de la cultura de la siguiente manera: </li><li> Vaya a la pestaña &quot;acciones&quot; y haga clic en &quot;tomar la muestra&quot;. Coloque el tubo de muestreo en la bomba de muestreo y manipular la llave de paso de muestreo de acuerdo con las instrucciones de la pantalla. </li><li> Realizar al menos una observación microscópica diario y recuento de células en estas muestras. </li><li> Cuando las células han alcanzado la densidad deseada, en este cASE 1,2 x 10 6 células / ml, infectar las células con la adición de un inóculo de virus. </li><li> Agregar asépticamente el inóculo a una jeringa de 20 ml, y conectar la jeringa a uno de los puertos de adición de repuesto en el reactor. Introducir el inóculo en el reactor presionando en el émbolo de la jeringa. </li><li> Continuar el muestreo y el análisis de la cultura de la concentración de partículas intracelulares adenovirus. </li></ol>

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Autores D. Giroux y Y. Hashimura son empleados de PBS Biotech que produce reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.

Este sistema de biorreactor de un solo uso es relativamente sencillo de usar y proporciona análisis en tiempo real para la monitorización y el análisis reactor. Está muy bien adecuado para el cultivo de células de mamíferos y de insectos con densidades celulares que llegan a más de 30 millones de células / ml. Además de las células A549 describen en este informe 11, hemos crecido SF-9 células de insectos en el biorreactor también. La mezcla suave proporcionado por la rueda de aire neumático reduce el daño celular. Varios pasos son críticos al establecer este reactor. Primera calibración, apropiado del pH y DO sensores es importante para la vigilancia óptima de la cultura y para la adición de reactivos para ajustar el pH o el oxígeno en el sistema. En segundo lugar, los frascos de reactivos y de semillas deben ser llenados y los accesorios Luer realizan en un ambiente estéril, como un BSC. Una vez que los frascos de reactivos se mueven fuera del ambiente estéril, las conexiones a las líneas de alimentación de biorreactores deben hacerse con cuidado para evitar la contaminación microbiana. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Si bien este sistema de biorreactor funciona bien para las líneas de células de mamíferos e insectos que no está diseñado para los cultivos bacterianos. El sistema no puede proporcionar la mezcla rápida y la oxigenación que se requiere para células bacterianas. El crecimiento bacteriano se realiza mejor en un biorreactor de tanque agitado. En comparación con otros biorreactores de un solo uso para el cultivo de células de mamífero o insecto, este sistema es fácil de usar, proporciona datos suficientes para el análisis de pistas, y tiene el crecimiento celular similar o mejor que el otro sistema de un solo uso que hemos evaluado. El uso único sistema biorreactor neumático tiene el potencial para satisfacer muchas de las investigaciones y aplicaciones clínicas en los campos de bioterapéuticos, vacunas, las células madre y la medicina personalizada 4. Además, la flexibilidad de este sistema permite por lotes, Fed-batch, la perfusión, y las aplicaciones de biorreactores de transfección basado 5. Por último, de un solo uso sistemas de biorreactores desechables tienen el potenciales para satisfacer las necesidades de la producción industrial a gran escala y para cumplir con las directrices y recomendaciones de los organismos reguladores nacionales e internacionales 10.6.

Líneas de células de mamíferos se pueden clasificar en una de tres categorías basadas en sus características de crecimiento: células que crecen en suspensión, las células que crecen en forma de agregados, y las células que crecen anclado a un sustrato. Aunque el biorreactor de aire de la rueda demostrado en este video es capaz de crecer los tres tipos de células, este video demostrará el uso del biorreactor para cultivar células dependientes de anclaje en micro-soportes. Células de mamíferos dependientes de anclaje pueden ser cultivadas con el propósito de producir más células - donde las propias células son el producto. Por ejemplo, las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana están siendo cultivadas con el propósito de recoger las células e inyectarlas en el tejido enfermo. El biorreactor neumático demostrado en este vídeo ha demostrado ser adecuado para la producción de dichas células madre mesenquimales para esta aplicación (Serra et al., Comunicación personal, 2013). Anchorage depcélulas de mamífero se cultivan típicamente endent pequeña escala en recipientes de cultivo 2D tales como placas de cultivo celular, frascos de cultivo de células, o botellas de rodillos, donde se adhieren a una superficie de crecimiento especialmente tratado 1. Cuando se desean más células, las placas o frascos se pueden ampliar mediante el uso de más o grandes vasos. Sin embargo, para un cultivo más rentable de grandes cantidades de células dependientes de anclaje, aumentando el área superficial para la fijación celular que se puede lograr mediante el uso de pequeñas perlas sólidas llamados micro-soportes. Dependiendo de las características de fijación de la célula, diferentes tipos de micro-soportes están disponibles comercialmente, tal como dextrano, un péptido, o colágeno recubierto. Micro-soportes tienen una gran área superficial a volumen que proporciona una mayor superficie para el crecimiento celular; y los micro-soportes se pueden mantener en suspensión con agitación, lo que permite que las células se cultivan a altas densidades en sistemas de biorreactores 2. Actualmente, los tipos de bioreactors donde las células adherentes se cultivan en micro-vehículos incluyen matraces rotativos y sistemas de tanque agitado, que utilizan hélices axiales para mantener la suspensión de las células recubierto micro-soportes. Varios factores son importantes para el cultivo con éxito de células, incluyendo la tensión de oxígeno, la tensión de cizallamiento, la matriz de superficie, y de nutrientes y las concentraciones de metabolitos. El uso de biorreactores permite la monitorización en tiempo real de las condiciones de crecimiento y el potencial de significativamente más bajos costos de producción 1. Hay varios diseños de biorreactores común para el cultivo in vitro de células incluyendo, suspensión agitada, recipiente de pared giratorio, de fibra hueca, la bolsa de biorreactor en una plataforma de balancín, y sistemas de lecho fluidizado 3. Muchos de estos sistemas presentan problemas únicos para el cultivo de células y la escala -up, tales como el alto costo, los gradientes de concentración de nutrientes, cizallamiento hidrodinámico, la agregación de células, y la dificultad en el muestreo, monitoreo y control de cell de escala. Varias líneas de células adherentes se utilizan en la producción de virus, ya sea en la producción de vacunas virales o para la producción de vectores virales para aplicaciones de terapia génica. En este video, usando el sencillo uso neumática (aire-ruedas) sistema de biorreactor, se demuestra la cultura de células de carcinoma de pulmón humano (A549) las células en micro-soportes para la producción de un adenovirus oncolítico. El diseño del biorreactor neumática utiliza una rueda de agitación vertical que es alimentado por la flotabilidad del gas burbujeado en la parte inferior del biorreactor. Este método de agitación suave limita las fuerzas de cizallamiento hidrodinámico, pero aún asegura medio y óptima de la célula de mezcla 4. En comparación con el reactor de tanque agitado, el reactor neumático tiene una baja tensión de cizallamiento, incluso con sistemas de biorreactor de aire de la rueda de alto volumen (Figura 1). En contraste con los biorreactores de tanque agitado, el impulsor vertical de este reactor único uso está activado por una corriente de burbujas de gas dentro deel recipiente, lo que permite suave y uniforme de mezcla medio (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>PBS 3&amp;nbsp;</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Use Assembly</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Lung Carcinoma Cells (A549)</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA, 0.25%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 1 Microcarriers</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam C</td><td>Sigma</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

En la Figura 3, se muestran los parámetros para el inicio de la carrera biorreactor. Esta figura muestra la pantalla antes de establecer los parámetros de temperatura, oxígeno disuelto, pH y agitación. Una vez que los parámetros se establecen, los parámetros de ejecución son monitoreados continuamente y se pueden hacer ajustes para mantener las condiciones requeridas. El software produce una lectura continua que permite una fácil identificación de problemas. En este experimento utilizando 2,5 L de DMEM que contenía 10% de FBS, 250 ppm de SAFC anti-espuma C, 2 mM L-glutamina y 3 g / L de micro-soportes, el sistema se estabiliza por lo que el porcentaje de oxígeno es 50%, el temperatura es 37 ° C, y el pH es 7,2. El reactor es inoculado con células A549 a una concentración de 7 x 10 4 células / ml (o 10 células / micro-portadoras). Los parámetros elegidos para esta ejecución resultaron en la mayoría de las células que se adhieren a los micro-soportes dentro de 2 horas (Figura 4). Después de 12 h, las células son demoniossignos trating de aplanamiento y la difusión en la superficie micro-portadora (Figura 5). Por 24 horas, micro-soportes tienen una distribución relativamente uniforme de las células, sin micro-soportes sin células y no hay grandes grupos de células en los micro-soportes (Figura 6). El porcentaje de colonización micro-portador por las células A549 es de 75% en 24 horas y el 90% a partir de entonces (Figura 7). Las células continuaron creciendo exponencialmente a ~ 1 millón de células / ml después de 48 horas (Figura 8). Después de la infección con una dosis de adenovirus oncolítico (2 x 10 8 viriones / ml) a 50 h, la densidad aumentó a 1.2 millones de células / ml y luego comenzó a disminuir a medida que la infección lítica progresó. Había ~ 10.000 amplificación pliegue del inóculo viral. En experimentos anteriores, se ha encontrado que el control y regulación del caudal de gas es crítica para maximizar el crecimiento celular (datos no publicados). El rápido crecimiento de las células pueden agotar el sistema de oxígeno con<html> el nivel de OD de caer a cero. Mientras que las células continuaron creciendo, fue a un ritmo mucho más lento. Es crítico para controlar y ajustar el flujo de oxígeno para satisfacer las demandas celular durante la fase de crecimiento logarítmico. Cada serie se puede analizar para un óptimo crecimiento comparando el pH, DO, y la temperatura con recuentos de células diarias. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" /> Figura 1. Dinámica de Fluidos del sistema biorreactor neumático (PBS) en comparación con el tanque biorreactor Agitador medición de fuerzas de cizallamiento de pared en varios volúmenes de reactor. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" /> Figura 2. neumática Aire rueda impulsor reactor. <html> 52008 / 52008fig3highres.jpg &quot;/&gt; Figura 3. software de ruedas Aire neumático captura de pantalla de los parámetros para iniciar la carrera biorreactor. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" /> Figura 4. colonización Micro-portador con células A549 2 horas después de la inoculación. (Diámetro medio de micro-portador ~ 180 m.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" /> Figura 5. 12 horas después del inicio del cultivo, las células A549 están otorgando, aplanar, y la difusión en los micro-soportes.5highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" /> Figura 6: Micro-portadoras recubiertas con células después de 24 horas en la cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" /> Figura 7. Porcentaje de colonización micro-portadora por las células A549 después de la inoculación. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" /> Figura 8. El número de células A549 viables en cultivo antes y después de la infección con adenovirnosotros. Tenga en cuenta que el paso de la infección viral se produjo a las 50 h.

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Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

El cultivo de células de mamífero utilizando un solo uso Sistema Neumático biorreactor

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Basada en el chip tridimensional de cultivo celular en perfundido Micro-biorreactores

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Investigación

Biología

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

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Bioingeniería

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Una plataforma automatizada versátil para Micro escala experimentos de estimulación celular

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nutriente Reglamento mediante la alimentación continua de expansión a gran escala de células de mamífero en esferoides

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

The functional behavior of cells in culture can be improved by culturing in more in vivo-like 3-dimensional culture environments16-21. This manuscript describes the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for in vivo-like mammalian tissue culture.

Biorreactores de fibra hueca para<em&gt; En Vivo</em&gt; -como Cultivo de tejidos de mamíferos

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

Optimización de procesos mediante microbiorreactores automatizados de alto rendimiento en el cultivo de células de ovario de hámster chino

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This work has developed a low-cost perfusion bioreactor system that allows culture medium to be continuously perfused into a cell culture module and fractionated in a downstream module to measure dynamics on this scale. The system is constructed almost entirely from commercially available parts and can be parallelized to conduct independent experiments in conventional multi-well cell culture plates simultaneously. This video article demonstrates how to assemble the base setup, which requires only a single multichannel syringe pump and a modified fraction collector to perfuse up to six cultures in parallel. Useful variants on the modular design are also presented that allow for controlled stimulation dynamics, such as solute pulses or pharmacokinetic-like profiles. Importantly, as solute signals travel through the system, they are distorted due to solute dispersion. Furthermore, a method for measuring the residence time distributions (RTDs) of the components of the perfusion setup with a tracer using MATLAB is described. RTDs are useful to calculate how solute signals are distorted by the flow in the multi-compartment system. This system is highly robust and reproducible, so basic researchers can easily adopt it without the need for specialized fabrication facilities.

This paper presents a method to construct and operate a low-cost, multichannel perfusion cell culture system for measuring the dynamics of secretion and absorption rates of solutes in cellular processes. The system can also expose cells to dynamic stimulus profiles.

Biorreactor de perfusión multiflujo integrado con fraccionamiento de salida para cultivo celular dinámico

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Producción en sistema cerrado de células adherentes basadas en microportadores solubles

Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To address the primary shortcomings of the two-dimensional (2D) planar culturing system, we innovatively developed an automated closed industrial scale cell production (ACISCP) platform based on a GMP-grade, dissolvable, and porous microcarrier for the 3D culture of adherent cells, including human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs), HEK293T cells, and Vero cells. To achieve large-scale expansion, a two-stage expansion was conducted with 5 L and 15 L stirred-tank bioreactors to yield 1.1 x 1010 hMSCs with an overall 128-fold expansion within 9 days. The cells were harvested by completely dissolving the microcarriers, concentrated, washed and formulated with a continuous-flow centrifuge-based cell processing system, and then aliquoted with a cell filling system. Compared with 2D planar culture, there are no significant differences in the quality of hMSCs harvested from 3D culture. We have also applied these dissolvable porous microcarriers to other popular cell types in the CGT sector; specifically, HEK293T cells and Vero cells have been cultivated to peak cell densities of 1.68 x 107 cells/mL and 1.08 x 107 cells/mL, respectively. This study provides a protocol for using a bioprocess engineering platform harnessing the characteristics of GMP-grade dissolvable microcarriers and advanced closed equipment to achieve the industrial-scale manufacturing of adherent cells.

Autor destacado: Avance en la fabricación de terapias celulares con microportadores solubles 

Here, we present a protocol to achieve the large-scale manufacturing of adherent cells through a fully closed system based on GMP-grade dissolvable microcarriers. The cultivation of human mesenchymal stem cells, HEK293T cells, and Vero cells was validated and met both quantity demands and quality criteria for the cell and gene therapy industry.

Producción celular a gran escala basada en microportadores porosos solubles de grado GMP

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To ...

El cultivo de células de mamífero utilizando un solo uso Sistema Neumático biorreactor

Resumen

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Basada en el chip tridimensional de cultivo celular en perfundido Micro-biorreactores

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Una plataforma automatizada versátil para Micro escala experimentos de estimulación celular

Nutriente Reglamento mediante la alimentación continua de expansión a gran escala de células de mamífero en esferoides

Biorreactores de fibra hueca para

Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO

Optimización de procesos mediante microbiorreactores automatizados de alto rendimiento en el cultivo de células de ovario de hámster chino

Biorreactor de perfusión multiflujo integrado con fraccionamiento de salida para cultivo celular dinámico

Producción celular a gran escala basada en microportadores porosos solubles de grado GMP

Producción celular a gran escala basada en microportadores porosos solubles de grado GMP