This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.

1. الدخول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السلطة حتى مفاعل حيوي. انقر في أي مكان لفتح صفحة تسجيل الدخول. حدد اسم المستخدم وإدخال كلمة السر وانقر على &quot;تسجيل الدخول&quot;. </li></ol> 2. المعايرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة جهاز استشعار درجة الحموضة (2 نقطة قبل التعقيم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد استشعار درجة الحموضة وتأكيد يمتلئ استشعار طرف مع حل بالكهرباء. إعداد اثنين من الأكواب مع حلول الحموضة المعايرة (بالكهرباء) الرقم الهيدروجيني 4 و 7 درجة الحموضة ولها المتاحة زجاجة غسل بالماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بتوصيل كابل الرقم الهيدروجيني للاستشعار درجة الحموضة. انتقل إلى &quot;تطبيقات&quot; علامة على واجهة مرحبا وانقر على &quot;معايرة&quot;. أدخل درجة الحرارة عازلة في مجال معايرة درجة الحرارة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع جهاز استشعار درجة الحموضة في المخزن 1 (الرقم الهيدروجيني 4) وأدخل القيمة في حقل &quot;الصفر&quot;. انتظر الرسم البياني لتحقيق الاستقرار وانقر على زر &quot;معايرة 1&quot;. شطف استشعار درجة الحموضة بالماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان حساس في المخزن 2 (درجة الحموضة 7). أدخل عازلة2 القيمة في حقل &quot;العمر&quot;. انتظر الرسم البياني لتحقيق الاستقرار وانقر زر معايرة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;حفظ&quot; ثم انقر فوق &quot;إغلاق&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة الأوكسجين المذاب (DO) الاستشعار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان استشعار DO تم الاستقطاب من قبل أن يكون متصلا إلى النظام لعدة ساعات. انتقل إلى &quot;تطبيقات&quot; علامة على واجهة أهلا وانقر معايرة. انقر على &quot;قيام&quot; الزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل استشعار DO وأدخل 0 في الميدان &quot;الصفر&quot;. انتظر الرسم البياني لتحقيق الاستقرار وانقر على زر &quot;معايرة 1&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة الاتصال أجهزة الاستشعار DO وأدخل 100 في حقل &quot;سبان&quot;. انتظر الرسم البياني لتحقيق الاستقرار وانقر على زر &quot;معايرة 2&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;حفظ&quot; ثم انقر فوق &quot;إغلاق&quot;. </li></ol> 3. الأوتوكلاف وتركيب مجسات والسفن الكاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد المعايرة، وأجهزة الاستشعار الحراري المكان وكذلك في autocالحقائب اغتسل والأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية، و 15 رطل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الحقائب الأوتوكلاف مع 70٪ الآيزوبروبيل الكحول (IPA) ونقل الحقائب إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC). إزالة التغليف الخارجي للسفينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير التعبئة والتغليف الداخلي مع 70٪ IPA ونقل السفينة إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC). إزالة التغليف الداخلي وتفتيش السفينة وأنابيب للالضرر أثناء الشحن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت أجهزة استشعار درجة الحموضة وDO في اثنين من الموانئ الأمامية. تثبيت البئر الحراري إلى ميناء الظهير الايسر. فتح الغطاء الاستشعار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه استشعار عبر ميناء الاستشعار. كاتب استشعار بإحكام في منفذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل السفينة من BSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتعطل DO والكابلات استشعار درجة الحموضة خارج الأكمام السفينة وتأكد من أن لا شيء في الأكمام. حرك سفينة في كم والقدمين أولا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب بعناية استشعار درجة الحرارة في البئر الحراري السفينة. تأكد من أن الجزء السفلي من السفينة تقع ضد سخانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالةيحدد أنابيب من حقائبهم. مباراة الترميز اللوني على أنابيب إلى الموصلات المناظرة ومضخات على وحدة التحكم مفاعل حيوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت خط الغاز الرئيسي عن طريق الضغط على الرابط في منفذ الغاز. تثبيت خط الغاز الصغيرة قبل التواء في اتجاه عقارب الساعة موصل بمأخذ الغاز. تثبيت أنابيب العادم مرشح: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الفرن التصفية. تأمين مرشح العادم على U-قناة حتى يذهب أنابيب من خلال اثنين من السنانير إلى تصفية والخروج من الفرن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت الأنابيب بواسطة كيس المكثف في حامل الأنابيب. أغلق الباب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوط الطريق بالإضافة A و B، كلا الخطين وسائل الإعلام، والخط الحصاد وراء استشعار DO وعلى مقاعد البدلاء بجوار وحدة التحكم مفاعل حيوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل الكابلات إلى DO ودرجة الحموضة أجهزة الاستشعار. </li></ol> 4. إضافة المتوسطة ومتناهية حاملات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى &quot;إجراءات&quot; علامة التبويب وانقر على &quot;مراقبة مضخات&quot; على واجهة الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل steriلو اتصال بين خط غير المستخدمة بالإضافة المتوسط ​​(1 الفرقة البرتقالية) ومصدر زجاجة / كيس المتوسط ​​عن طريق لحام الأنابيب أو استخدام التجهيزات يور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر شريط التمرير لتشغيل المضخة وسائل الإعلام على. انقر شريط التمرير لتحويل وسائل الإعلام ضخ قبالة بعد إضافة مبلغ المطلوب من المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حبات microcarrier في كا 2+، المغنيسيوم 2+ PBS مجانا لمدة 3 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات عدة مرات مع الكالسيوم 2+، المغنيسيوم 2+ PBS الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة عند 115 درجة مئوية، و 15 رطل. ملاحظة: إضافة 3 جرام / لتر (وزن جاف) في هذه التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ في ناقلات الصغيرة التي تم رطب، وغسلها وتعقيمها في مفاعل بنفس الطريقة تم إضافة المتوسطة في الخطوة 4.1. </li></ol> 5. موازنة ونقطة واحد لا معايرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين وحدات التحكم في السيارات وأدخل setpoints المطلوب. هنا، استخدم الانفعال تعيين نقطة (SP) = 15 دورة في الدقيقة، درجة الحرارة SP = 37.0 درجة مئوية، ودرجة الحموضة = 7.2، DO = 100٪. انتظر عarameters للتوازن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد استشعار هو المستقطب بشكل كامل. تأكيد DO القيمة الحالية قد استقرت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى &quot;تطبيقات&quot; علامة التبويب وانقر على &quot;معايرة&quot;. انقر على &quot;قيام&quot;، انقر فوق &quot;نقطة واحدة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال &quot;100&quot; في الميدان &quot;سبان&quot;. انقر على زر &quot;معايرة 1&quot;، انقر فوق &quot;حفظ&quot; ثم انقر على &quot;إغلاق&quot;: </li></ol> 6. بدء تشغيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى علامة التبويب إجراءات. انقر على &quot;دفعة&quot;. استخدام لوحة المفاتيح التي تظهر على الشاشة أو لوحة مفاتيح خارجية لإدخال اسم الدفعة 16 حرفا أو أقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على زر لوحة المفاتيح التي تظهر على الشاشة في &quot;إخفاء&quot;. انقر على &quot;ابدأ دفعة&quot; تأكيد بالنقر على &quot;ابدأ&quot; في تراكب. </li></ol> 7. تلقيح مع خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل اتصال العقيمة بين خط غير المستخدمة بالإضافة المتوسط ​​(1 الفرقة برتقالي) وزجاجة خلية / المصدر حقيبة بواسطة اللحامأنابيب أو باستخدام التجهيزات يور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت قسم السيليكون للأنابيب في مضخة وسائل الإعلام بحيث يشير السهم نحو الأنابيب بين المضخة والسفينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق أنابيب المشبك مفتوح ومغلق تشعبت المشبك الأنابيب لها. انقر شريط التمرير لتحويل مضخة وسائل الإعلام على وانقر على &quot;إيقاف&quot; بعد إضافة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى &quot;تطبيقات&quot; علامة التبويب وانقر على &quot;مضخات السيطرة&quot;. </li></ol> 8. أخذ العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد بتلقيح وبالتواتر المطلوب لمراقبة الثقافة، واستخلاص عينة من الثقافة على النحو التالي: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى &quot;إجراءات&quot; علامة التبويب وانقر على &quot;اتخاذ عينة&quot;. وضع أنابيب أخذ العينات في مضخة أخذ العينات والتلاعب محبس أخذ العينات وفقا للتعليمات التي تظهر على الشاشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء لا يقل عن الملاحظة المجهرية اليومية وعدد خلايا على هذه العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما وصلت كثافة الخلايا المطلوب، في هذا جبورصة عمان 1.2 × 10 6 خلية / مل، تصيب الخلايا مع إضافة اللقاح الفيروس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جو معقم و مطهر إضافة إلى اللقاح حقنة 20 مل، وتوصيل حقنة لأحد منافذ بالإضافة الغيار على المفاعل. إدخال اللقاح إلى المفاعل عن طريق الضغط على المكبس حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل أخذ العينات وتحليل الثقافة لاتش تركيز الجسيمات داخل الخلايا. </li></ol>

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods.">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li><li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies.">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li><li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application.">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).</li><li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing.">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li><li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities.">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li><li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures.">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li><li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization.">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).</li></ol>

الكتاب D. جيرو وY. Hashimura هم موظفون من برنامج تلفزيوني للتكنولوجيا الحيوية التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

هذا النظام مفاعل حيوي تستخدم مرة واحدة بسيطة نسبيا للاستخدام، ويقدم تحليلات في الوقت الحقيقي لرصد وتحليل المفاعل. وتناسب بشكل جيد للغاية للثقافة خلايا الثدييات والحشرات ذات الكثافة خلية تصل إلى أكثر من 30 مليون خلية / مل. بالإضافة إلى خلايا A549 وصفت في هذا التقرير 11، لقد نمت SF-9 خلايا الحشرات في مفاعل حيوي أيضا. اختلاط اللطيف تقدمها عجلة الهواء الهوائية يقلل من تلف الخلايا. عدة خطوات حاسمة عند إعداد هذا المفاعل. الأولى، معايرة درجة الحموضة والقيام مجسات مهمة لرصد الأمثل للثقافة وإضافة الكواشف لضبط درجة الحموضة أو الأكسجين في النظام. ثانيا، يجب أن تملأ الكاشف والبذور الزجاجات والمرفقات بالتركيبة المحرز في بيئة معقمة مثل BSC. مرة واحدة يتم نقل الزجاجات كاشف للخروج من بيئة معقمة، يجب أن يتم على الاتصالات إلى خطوط تغذية مفاعل حيوي مع الحرص على تجنب التلوث الميكروبي. <pالطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; ورغم أن هذا النظام مفاعل حيوي يعمل بشكل جيد لخطوط خلايا الثدييات والحشرات ليست مصممة لأنها الثقافات البكتيرية. لا يمكن للنظام توفير خلط السريع والأوكسجين اللازم للخلايا البكتيرية. هو أفضل إنجاز نمو البكتيريا في خزان مفاعل حيوي أثار. بالمقارنة مع غيرها من المفاعلات الحيوية تستخدم مرة واحدة لزراعة الخلايا الثديية أو الحشرات، وهذا النظام سهل الاستخدام، يوفر بيانات كافية لتحليل أشواط، والنمو خلية مماثلة أو أفضل من استخدام نظام واحد آخر لدينا تقييم. استخدام نظام مفاعل حيوي هوائي واحد لديه القدرة على تلبية العديد من البحوث والتطبيقات السريرية في مجالات biotherapeutics، واللقاحات، والخلايا الجذعية، والطب الشخصي 4. بالإضافة إلى ذلك، مرونة هذا النظام يسمح للدفعة، بنك الاحتياطي الفيدرالي دفعة، الإرواء، وترنسفكأيشن التطبيقات القائمة على مفاعل حيوي 5. أخيرا، تستخدم مرة واحدة أنظمة مفاعل حيوي المتاح لديها الهياجللمحاكمة لتلبية احتياجات الإنتاج الصناعي على نطاق واسع والتمسك مبادئ توجيهية وتوصيات الهيئات التنظيمية الوطنية والدولية 6-10.

خطوط خلايا الثدييات يمكن تصنيفها إلى واحدة من ثلاث فئات على أساس الخصائص نموها: الخلايا التي تنمو في التعليق، والخلايا التي تنمو المجاميع والخلايا التي تنمو ترتكز على هذه الركيزة. على الرغم من أن مفاعل حيوي عجلة الهواء موضح في هذا الفيديو هو قادرة على النمو عن ثلاثة أنواع من الخلايا، وهذا الفيديو يظهر استخدام مفاعل حيوي لزراعة الخلايا التابعة مرسى على حاملات الدقيقة. يمكن زراعة خلايا الثدييات تعتمد مرسى لغرض إنتاج المزيد من الخلايا - حيث الخلايا نفسها هي نتاج. على سبيل المثال، يجري حاليا زراعة نخاع المستمدة الخلايا الجذعية الوسيطة العظم البشري بغرض حصاد الخلايا وحقنها داخل الأنسجة المريضة. وقد ثبت مفاعل حيوي هوائي موضح في هذا الفيديو مناسبة لإنتاج مثل هذه الخلايا الجذعية الوسيطة لهذا التطبيق (سيرا آخرون، اتصال شخصي 2013). مرسى إقلاعوعادة ما تزرع خلايا الثدييات endent نطاق صغير في الأوعية ثقافة 2D مثل لوحات ثقافة الخلية، قوارير زراعة الخلايا، أو زجاجات الأسطوانة، حيث تلتزم سطح النمو معاملة خاصة 1. عندما يتم المطلوب المزيد من الخلايا، لوحات أو قوارير يمكن توسيعها باستخدام أكثر أو أكبر السفن. ومع ذلك، لزراعة فعالة من حيث التكلفة أكثر من كميات كبيرة من الخلايا التابعة مرسى، زيادة مساحة السطح لمرفق الخلية ويمكن تحقيق ذلك باستخدام حبات صلبة صغيرة تسمى الناقلات الصغيرة. اعتمادا على خصائص مرفق الخلية، عدة أنواع مختلفة من الناقلات الصغيرة متوفرة تجاريا، مثل ديكستران، الببتيد، أو الكولاجين المغلفة. حاملات الصغيرة لديها مساحة كبيرة لنسبة حجم توفير مساحة أكبر لنمو الخلايا. وشركات الطيران الصغيرة يمكن الحفاظ في تعليق مع الانفعالات، مما يسمح للخلايا لزراعتها إلى كثافة عالية في أنظمة مفاعل حيوي 2. حاليا، وأنواع bioreactors حيث تزرع الخلايا الملتصقة على حاملات القوارير الصغيرة تشمل الدوار والنظم خزان أثار، والتي تستخدم الضواغط المحورية للحفاظ على تعليق الخلية المغلفة شركات الصغيرة. عدة عوامل مهمة لنجاح زراعة الخلايا بما في ذلك التوتر الأكسجين، وإجهاد القص، مصفوفة السطح، والمواد الغذائية وتركيزات المستقلب. استخدام المفاعلات الحيوية يسمح للرصد في الوقت الحقيقي من ظروف النمو والقدرة على أقل بكثير من تكاليف الإنتاج 1. هناك العديد من التصاميم مفاعل حيوي مشترك لزراعة الخلايا في المختبر بما في ذلك، أثار تعليق، سفينة الدورية جدار، أجوف الألياف، حقيبة مفاعل حيوي على منصة الروك، وأنظمة قاعدة مميعة 3. العديد من هذه الأنظمة يمثل مشكلة فريدة من نوعها لزراعة الخلايا وتوسيع نطاق -حتى، مثل التكلفة العالية والتدرجات تركيز المغذيات، والقص الهيدروديناميكية، تجميع الخلايا، وصعوبة في أخذ العينات والرصد والسيطرة على سلل نطاق المتابعة. وتستخدم العديد من خطوط الخلايا الملتصقة في إنتاج الفيروسات، سواء في إنتاج اللقاحات الفيروسية أو لإنتاج النواقل الفيروسية لتطبيقات العلاج الجيني. في هذا الفيديو، وذلك باستخدام استخدام هوائي واحد (الهواء بعجل) نظام مفاعل حيوي، ونحن لشرح ثقافة خلايا سرطان الرئة الإنسان (A549) الخلايا على ناقلات الدقيقة لإنتاج اتش حال الورم. تصميم مفاعل حيوي يستخدم هوائي عجلة التحريض العمودي الذي هو مدعوم من قبل الطفو من الغاز sparged في الجزء السفلي من مفاعل حيوي. يحد هذا الأسلوب التحريك لطيف قوى القص الهيدروديناميكية، ولكن لا يزال يضمن المتوسطة الأمثل وخلية خلط 4. بالمقارنة مع مفاعل أثار خزان، المفاعل هوائي لديه منخفضة التوتر جدار القص حتى مع أنظمة مفاعل حيوي الهواء عجلة كبيرة الحجم (الشكل 1). على النقيض من المفاعلات الحيوية خزان أثار، يتم تشغيل المكره العمودي هذا المفاعل استخدام مرة واحدة من قبل تيار من فقاعات الغاز داخلالسفينة، والذي يسمح لطيف وموحدة خلط المتوسطة (الشكل 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 3&#160;</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single Use Assembly</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Human Lung Carcinoma Cells (A549)</td>
			<td style="width:124px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">&#160;CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose Medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA, 0.25%</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytodex 1 Microcarriers</td>
			<td style="width:124px;">GE</td>
			<td align="right">3781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifoam C</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

في الشكل 3، وترد المعلمات لبدء المدى مفاعل حيوي. ويظهر هذا الرقم على الشاشة قبل تعيين المعلمات من درجة الحرارة والأكسجين الذائب، ودرجة الحموضة والانفعالات. حالما يتم تعيين المعلمات، ويتم رصد مستمر على المدى المعلمات ويمكن إجراء تعديلات على الحفاظ على الشروط المطلوبة. البرنامج ينتج قراءات مستمرة تسمح لسهولة تحديد المشاكل. في هذه التجربة باستخدام 2.5 لتر من DMEM تحتوي على 10٪ FBS، 250 جزء في المليون من SAFC مكافحة رغوة C، 2 مم L-الجلوتامين و 3 غرام / لتر من الناقلات الصغيرة، واستقر النظام بحيث الأكسجين في المئة هو 50٪، و درجة الحرارة 37 درجة مئوية، ودرجة الحموضة 7.2. يتم تلقيح المفاعل مع خلايا A549 بتركيز 7 × 4 10 خلية / مل (أو 10 خلية / الجزئي الناقل). أسفرت المعلمات الذي تم اختياره لهذا المدى في معظم الخلايا التمسك شركات الطيران الصغيرة في غضون 2 ساعة (الشكل 4). بعد 12 ساعة، والخلايا هي الشياطينعلامات trating من تسطيح وتنتشر على سطح حاملة الصغيرة (الشكل 5). قبل 24 ساعة وناقلات الصغيرة نسبيا حتى يكون التوزيع من الخلايا، مع عدم وجود شركات الصغيرة دون الخلايا وعدم وجود كتل كبيرة من الخلايا على الناقلات الصغيرة (الشكل 6). نسبة صغيرة من الخلايا الناقل الاستعمار A549 هي 75٪ من 24 ساعة و 90٪ بعد ذلك (الشكل 7). واستمرت الخلايا لتنمو باطراد إلى ~ من 1 مليون خلية / مل بعد 48 ساعة (الشكل 8). بعد العدوى عن طريق جرعة من اتش حال الورم (2 × 10 8 virions / مل) في 50 ساعة، زادت الكثافة إلى 1.2 مليون خلية / مل ثم بدأت في الانخفاض مع تقدم العدوى التحللي. كان هناك ~ 10،000 التضخيم أضعاف من اللقاح الفيروسي. في التجارب السابقة، وجدنا أن مراقبة وضبط تدفق الغاز أمر بالغ الأهمية لتعظيم نمو الخلية (بيانات غير منشورة). بسرعة خلايا المتزايد يمكن أن تستنفد نظام الأكسجين مع<html> مستوى DO انخفض إلى الصفر. بينما استمرت الخلايا في النمو، كان بمعدل أبطأ بكثير. فمن الأهمية بمكان لرصد وضبط تدفق الأكسجين لتلبية مطالب الخلايا خلال مرحلة النمو لوغاريتمي. ويمكن تحليل كل تشغيل للنمو الأمثل وذلك بمقارنة الرقم الهيدروجيني، DO، ودرجة الحرارة مع تعداد خلايا اليومية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" /> الرقم 1. ديناميات الموائع نظام مفاعل حيوي هوائي (PBS) مقارنة مع خزان مفاعل حيوي النمام قياس قوى القص في أحجام جدار المفاعل المختلفة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" /> الشكل 2. الهوائية الهواء عجلة مفاعل المكره. <html> 52008 / 52008fig3highres.jpg &quot;/&gt; الرقم 3. الهوائية الهواء عجلة البرمجيات الشاشة لقطة من المعلمات لبدء تشغيل مفاعل حيوي. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" /> الرقم 4. مايكرو الناقل الاستعمار مع خلايا A549 2 ساعة آخر التلقيح. (متوسط ​​قطرها الصغير الناقل ~ 180 ميكرون.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" /> الرقم 5. 12 ساعة بعد الشروع في الثقافة والخلايا A549 وربط، وتسطيح، وتنتشر على شركات الطيران الصغيرة.5highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _ على بياض &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" /> الرقم 6. مايكرو حاملات المغلفة مع الخلايا بعد 24 ساعة في الثقافة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" /> الرقم 7. نسبة صغيرة الناقل الاستعمار من قبل خلايا A549 بعد التلقيح. <img alt="الرقم 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" /> الرقم 8. عدد الخلايا A549 قابلة للحياة في الثقافة قبل وإصابة آخر مع adenovirعلينا ملاحظة أن الخطوة العدوى الفيروسية وقعت في 50 ساعة.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System at JoVE.com

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

زراعة خلايا الثدييات عن طريق استخدام المفرد نظام هوائي تفاعلات الاحيائية

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

cultivation-mammalian-cells-using-single-use-pneumatic-bioreactor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.2K Views.  Johns Hopkins University. Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells. 

Video: Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

الطعوم الوعائية الهندسة البيولوجية ، عن طريق بناء مفاعل حيوي نابض

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

زراعة خلايا العصبية السلف في هيدروجيل 3 الابعاد الذاتي تجميع الببتيد

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

تشغيل الفوق تفاعلات الاحيائية

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

مفاعل حيوي رواية لزراعة ارتفاع كثافة المجتمعات الميكروبية متنوعة

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.

خلايا الثدييات التغليف في أحجار الجينات باستخدام سفينة أثارت بسيطة

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.

المؤتلف الكولاجين أنا ميكروكاريرس الببتيد لتوسيع الخلية وإمكانية استخدامها كنظام إيصال خلية في مفاعل حيوي نموذج

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

المداري تهز ثقافة خلايا الثدييات في السفن على شكل س لإنتاج المجاميع الموحدة

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. This work describes the key steps leading to the construction of efficient sgRNA vectors using a strategy that allows the efficient detection of the positive colonies by PCR prior to DNA sequencing. Since efficient genome editing using the CRISPR system requires a highly efficient sgRNA, a preselection of candidate sgRNA targets is necessary to save time and effort. A dual luciferase reporter system has been developed to evaluate knockout efficiency by examining double-strand break repair via single strand annealing. Here, we use this reporter system to pick up the preferred xCas9/sgRNA target from candidate sgRNA vectors for specific gene editing. The protocol outlined will provide a preferred sgRNA/CRISPR enzyme vector in 10 days (starting with appropriately designed oligonucleotides).

Here, we present a protocol describing a streamlined method for the efficient generation of plasmids expressing both the CRISPR enzyme and associated single guide RNA (sgRNAs). Co-transfection of mammalian cells with this sgRNA/CRISPR vector and a dual luciferase reporter vector that examines double-strand break repair allows evaluation of knockout efficiency.

بناء من CRISPR Plasmids والكشف عن كفاءة خروج المغلوب في خلايا الثدييات من خلال نظام مراسل Luciferase مزدوجة

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

توليد الظروف البيئية الديناميكية باستخدام جهاز Microfluidic عالي الإنتاجية

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...