This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.

1。ログイン<ol><li>バイオリアクターをパワーアップ。ログインページを開くには、任意の場所をクリックします。ユーザー名を選択し、パスワードを入力して「ログイン」をクリックします。 </li></ol> 2キャリブレーション<ol><li> pHセンサ（オートクレーブの前に2ポイント）を校正します。 </li><li> pHセンサを点検し、センサチップは電解液で満たされていることを確認します。 pH校正ソリューション（電解質）をpH4とpH7の二つのビーカーを用意し、蒸留水で使用可能な洗浄ボトルを持っています。 </li><li> pHセンサのpHケーブルを接続します。 Helloインタフェースの「アクション」タブに移動し、「キャリブレーション」をクリックします。キャリブレーション溶液の温度フィールドにおけるバッファの温度を入力します。 </li><li>バッファ1液（pH 4）中のpHセンサを配置し、「ゼロ」のフィールドに値を入力します。安定させ、「キャリブレーション1」ボタンをクリックし、グラフを待ちます。蒸留水でpHセンサーをすすぐ。 </li><li>バッファ2（pH7）にセンサを配置します。バッファを入力してください「スパン」フィールドに2の値。安定させ、2ボタンを校正クリックし、グラフを待ちます。 </li><li>クリックして &quot;閉じる&quot;をクリックして「保存」。 </li><li>溶存酸素（DO）センサーを校正します。 </li><li>確保DOセンサは、数時間のためにシステムに接続されることにより偏光されている。 Helloインタフェースの「アクション」タブに移動し、キャリブレーションをクリックします。 「DO」ボタンをクリックしてください。 </li><li> DOセンサーを外し、「ゼロ」フィールドに0を入力してください。安定させ、「校正1」ボタンをクリックし、グラフを待ちます。 </li><li> DOセンサーを再接続し、「スパン」フィールドに100と入力します。安定させ、「校正2」ボタンをクリックし、グラフを待ちます。 </li><li>クリックして &quot;閉じる&quot;をクリックして「保存」。 </li></ol>センサーおよび試薬容器を3オートクレーブしてからインストール<ol><li> AUTOC校正、場所センサおよびサーマルウェルの後溶岩パウチ及び121℃、15psiで30分間オートクレーブ。 </li><li>生物学的安全キャビネット（BSC）と70％イソプロピルアルコール（IPA）と転送パウチオートクレーブパウチを消毒。容器の外箱を取り出します。 </li><li> 70％IPAで内装を消毒し、生物学的安全キャビネット（BSC）の容器に移す。内装容器を取り出し、輸送中に与えた損害の容器と配管を点検します。 </li><li> pHをインストールし、2つのフロントポートにセンサーをDO。左バックポートにサーマルウェルをインストールします。センサーキャップを開きます。 </li><li>センサーポートを介してセンサガイド。ポートにしっかりとセンサーを通します。 </li><li> BSCの外容器に移す。 </li><li>容器のスリーブの外DOおよびpHセンサケーブルを掛け、何もスリーブになっていないことを確認してください。まず、スリーブに足を容器をスライドさせます。 </li><li>慎重に容器サーマルウェルに温度センサーを取り付けます。容器の底部ヒータに支えていることを確認してください。 </li><li>削除する彼らのバッグからチューブセット。バイオリアクターコントロールユニット上の対応するコネクタやポンプに配管のマッチングのカラーコーディング。 </li><li>そのガス出口にコネクタを押して、メインガスラインをインストールします。ガスコンセントにコネクターを時計回りにねじることによってマイクロガスラインをインストールします。排気フィルタチューブをインストールします。 </li><li>フィルタオーブンを開きます。そのチューブはフィルタにし、オーブンから2フックを通過するように、U-チャネル上で排気フィルタを固定します。 </li><li>チューブホルダーにコンデンサー袋でチューブを取り付けます。ドアを閉じます。 </li><li>次のバイオリアクター制御ユニットに経路追加ラインAとB、両方のメディア線、DOセンサーの背後にあるとベンチの上に採取ライン。 </li><li> DOおよびpHセンサにケーブルを接続します。 </li></ol> 4。中·マイクロキャリアを追加する<ol><li> 「アクション」タブに移動し、クリックしてコンピュータインタフェースの「コントロールポンプ」。 </li><li>殺菌フォーム未使用のメディア添加ライン（1オレンジバンド）とチューブを溶接するか、ルアーフィッティングを使用して、ミディ​​アムボトル/バッグ·ソースとの間の接続ル。 </li><li>上のメディアポンプをオンにスライダーをクリックしてください。メディアは培地の添加所望量後にオフポンプにするスライダをクリックしてください。 </li><li> RTで3時間、のCa 2 +のMg 2 +を含まないPBSをマイクロキャリアビーズを配置します。 </li><li>洗浄は、Ca 2 +、Mgを2 +フリーPBSで数回ビーズ。 </li><li> 115°C、15 psiので15分間オートクレーブ。 注：この実験では3グラム/ L（乾燥重量）を追加します。 </li><li>同様に、反応器に、水和し洗浄し、オートクレーブ処理されたマイクロキャリア媒体中のポンプは、ステップ4.1で追加されました。 </li></ol> 5。平衡とワンポイントDO校正<ol><li>オートにコントローラを設定し、必要な設定値を入力します。ここで、= 15 rpmで、温度SP = 37.0°C、pHは= 7.2、= 100％DO攪拌セットポイント（SP）を使用します。 Pを待ち平衡化arameters。 </li><li>センサーが完全に偏光していることを確認します。 DO現在価値が安定したことを確認します。 </li><li> 「アクション」タブに移動し、「キャリブレーション」をクリックします。 「DO A」をクリックし、「ワンポイント」をクリックしてください。 </li><li> 「スパン」の欄に「100」と入力します。 、クリックして「保存」と「閉じる」をクリックし「キャリブレート1」ボタンをクリックしてください： </li></ol> 6ファイル名を指定して実行を開始する<ol><li> [アクション]タブに移動します。 「バッチ」をクリックします。バッチ名を16文字以内で入力してオンスクリーンキーボードまたは外付けキーボードを使用してください。 </li><li>オンスクリーンキーボードの「非表示」ボタンをクリックしてください。オーバーレイで「開始」をクリックして確認し、「バッチを起動」をクリックしてください。 </li></ol> 7細胞で接種する<ol><li>未使用のメディア添加ライン（1オレンジバンド）と溶接による細胞ボトル/バッグ·ソースとの間の無菌接続を形成配管またはルアー継手を使用する。 </li><li>メディアポンプでチューブのシリコーン部分を取り付け、ポンプと容器との間のチューブに向かって矢印のようにします。 </li><li>管クランプが開いており、その分枝状管クランプが閉じているか確認してください。上のメディアポンプを回してセルを追加した後に「オフ」をクリックし、スライダーをクリックします。 </li><li> 「アクション」タブに移動し、「コントロールポンプ」をクリックします。 </li></ol> 8サンプリング<ol><li>として頻繁に文化を監視するために、必要に応じて接種した後、以下のように培養物からサンプルを描く。 </li><li> 「アクション」タブに移動し、「サンプルを取る」をクリックしてください。サンプリングポンプのサンプリングチューブを配置し、画面上の指示に従って、サンプリングストップコックを操作します。 </li><li>これらのサンプルについて少なくとも毎日、顕微鏡観察および細胞数を実行します。 </li><li>細胞は、この（c）に、所望の密度に達したとき1.2×10 6細胞/ ml ASE、ウイルス接種物を加えて細胞を感染させる。 </li><li>無菌的に20ミリリットルの注射器に接種材料を追加して、原子炉の予備加算ポートのいずれかに注射器を接続します。シリンジプランジャーを押して、反応器への接種材料を紹介。 </li><li>アデノウイルスの細胞内粒子濃度培養をサンプリングして分析し続けます。 </li></ol>

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	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods.">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li><li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies.">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li><li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application.">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).</li><li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing.">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li><li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities.">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li><li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures.">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li><li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization.">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).</li></ol>

著者D.ジルーとY橋村は、この記事で使用される試薬および器具を生産するPBS Biotech社の従業員です。

この単回使用バイオリアクターシステムを使用するのが比較的簡単であり、原子炉監視および分析のためのリアルタイム分析を提供する。これは、3000万人以上の細胞/ mlに達し、セル密度を有する哺乳動物および昆虫細胞培養のための非常に適しています。本報告書11に記載されたA549細胞のほかに、私たちも同様にバイオリアクター中で、SF-9昆虫細胞を成長している。空気圧エアホイールが提供する穏やかな混合は、細胞の損傷を軽減します。この原子炉を設定するときに、いくつかのステップが重要である。まず、適切なpH値のキャリブレーションとは、センサーは培養液の最適なモニタリングのためおよびpHまたは系内の酸素を調整する試薬の添加のために重要であるようにしてください。第二に、試薬およびシードボトルは充填され、ルアーの添付ファイルは、BSCのような無菌環境で行う必要があります。試薬ボトルは、無菌環境の外に移動されると、バイオリアクターフィードラインへの接続は、微生物汚染を避けるために注意して行わなければならない。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;このバイオリアクターシステムは、それが細菌培養のために設計されていない哺乳動物および昆虫細胞株に適していますが。システムは、細菌細胞のために必要とされる急速混合し、酸素化を提供することはできません。細菌の増殖は最高の攪拌タンクバイオリアクターで達成される。哺乳動物または昆虫細胞培養のための他の単回使用バイオリアクターと比較して、このシステムは、使いやすいランの分析のための十分なデータを提供し、私たちが評価した他の単回使用システムよりも同等以上の細胞増殖を有している。 単回使用空気圧バイオリアクターシステムは、ワクチン、生物学的治療薬の分野における研究および臨床用途の多くを満たす幹細胞、および医学4をパーソナライズする可能性がある。また、このシステムの柔軟性がバッチ、フェドバッチ、灌流、およびトランスフェクションベースのバイオリアクターアプリケーション5を可能にする。最後に、単回使用の使い捨てバイオリアクターシステムはpotenを持つ大規模な工業生産のニーズを満たすためやガイドラインおよび国内外の規制当局6-10の勧告に付着したTiAl。

懸濁液中で成長する細胞は、凝集体として成長した細胞、および細胞基質に係留成長する：哺乳動物細胞株は、その増殖特性に基づいて3つのカテゴリに分類することができる。このビデオで実証エア輪バイオリアクターは、細胞の3種類すべてを成長することができるが、このビデオは、マイクロキャリア上で足場依存性細胞を増殖させるバイオリアクターの使用を実証します。細胞自体が生成物である - 足場依存性哺乳類細胞は、より多くの細胞を産生する目的のために成長させることができる。例えば、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、現在、細胞を採取し、病変組織にそれらを注入する目的で栽培されている。このビデオで実証空気圧バイオリアクターは、このアプリケーションのためのそのような間葉系幹細胞の産生に好適であることが判明した（セラら 、私信、2013）。 アンカレッジDEPendent哺乳動物細胞は、典型的には、それらが特別に処理された成長表面1に付着した細胞培養プレート、細胞培養フラスコまたはローラーボトルのような2D培養容器の小さなスケールを成長させる。より多くの細胞が望まれる場合、プレートまたはフラスコを、より多くのまたはより大きな血管を使用することによって拡張することができる。しかし、より費用対効果の足場依存性細胞の大量培養、細胞付着のための表面積を増大させるためのマイクロキャリアと呼ばれる小さな固体ビーズを使用することによって達成することができる。細胞の付着特性に応じて、マイクロキャリアのいくつかの異なるタイプは、デキストラン、ペプチド、またはコラーゲンコーティングされたように、市販されている。マイクロキャリアは、細胞増殖のための大きな表面積を提供体積比に大きな表面積を有し;マイクロキャリアは、細胞がバイオリアクターシステム2で高密度に培養されることを可能にする撹拌で懸濁状態に維持することができる。現在、bioreaの種類接着細胞は、マイクロキャリア上で増殖させるのコンスは、細胞コーティングされたマイクロキャリアの懸濁を維持するために、軸方向翼を使用するスピナーフラスコおよび撹拌タンクシステムを含む。 いくつかの要因は、酸素圧、剪断応力、表面マトリックス、および栄養および代謝物の濃度を含む細胞の培養に成功にとって重要である。バイオリアクターの使用は、増殖条件および有意に低い生産コスト1の電位のリアルタイムモニタリングを可能にする。を含む、 インビトロ細胞培養、撹拌した懸濁液、回転壁容器、中空繊維、ロッカープラットフォーム上でバッグ、バイオリアクター、流動床システム3のためのいくつかの一般的なバイオリアクターの設計がある。これらのシステムの多くは、高コスト、栄養濃度勾配が、流体力学的剪断、細胞凝集、困難サンプリングにおいて、監視、および制御するセルとして、細胞培養のための固有の問題を提示し-upスケールリットルスケールアップ。 各種の付着細胞株は、ウイルスワクチンの生産にまたは遺伝子治療適用のためのウイルスベクターの生産のためのいずれかの、ウイルスの産生に使用されている。このビデオでは、単回使用の空気圧（エアホイール）バイオリアクターシステムを用いて、本発明者らは、ヒト肺癌細胞（A549）腫瘍崩壊アデノウイルスの産生のためのマイクロキャリア上の細胞の培養を示す。空気圧バイオリアクターの設計は、バイオリアクターの底に散布したガスの浮力によって供給されて、垂直攪拌ホイールを使用しています。この穏やかな攪拌方法は、流体力学的剪断力を制限するが、それでも最適な培地と細胞を4ミキシングを保証する。撹拌槽型反応器と比較して、空気圧式反応器は、高容量空気ホイールバイオリアクターシステムと低い壁せん断応力（ 図1）を有している。攪拌タンクバイオリアクターとは対照的に、この単回使用の反応器の垂直インペラ内のガス気泡流により回転される穏やかで均一な媒質混合（ 図2）を可能にする容器。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 3&#160;</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single Use Assembly</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Human Lung Carcinoma Cells (A549)</td>
			<td style="width:124px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">&#160;CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose Medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA, 0.25%</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytodex 1 Microcarriers</td>
			<td style="width:124px;">GE</td>
			<td align="right">3781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifoam C</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

図3では、バイオリアクターランの開始のためのパラメータが示されている。この図は、温度、溶存酸素、pHおよび撹拌のパラメータを設定する前に画面を示します。パラメータが設定されると、実行パラメータを連続的に監視され、調整が必要な条件を維持することができる。ソフトウェアは、問題の容易な同定を可能にする継続的な読み出しを生成します。 、FBS SAFCアンチフォームC、2mmのL-グルタミンおよびマイクロキャリアを3g / L 250ppmの10％を含むDMEM 2.5 Lを用いて、この実験では、システムは、そのように酸素原子百分率が50％である安定化され、温度は37℃であり、pHは7.2である。反応器を4×10 7細胞/ ml（または10細胞/マイクロキャリア）の濃度でA549細胞を接種される。この実行のために選択されたパラメータは、2時間（ 図4）内のマイクロキャリアに付着した細胞の大部分をもたらした。 12時間後、細胞を、鬼である平坦化マイクロキャリアの表面上に拡散trating記号（ 図5）。 24時間までに、マイクロキャリアは（ 図6）、細胞を含まない無マイクロキャリアおよびマイクロキャリア上の細胞の無い大きな塊の細胞の比較的均一な分布を有する。 A549細胞によるマイクロキャリアのコロニー形成の割合は、24時間、その後90％（ 図7）75重量％である。細胞を48時間後（ 図8）の後に〜100万個の細胞/ mlに指数関数的に成長し続けた。 50時間で腫瘍溶解性アデノウイルス（2×10 8ウイルス粒子/ ml）をの用量による感染後、密度がmlの120万個/まで増加した後、溶解感染が進むにつれて減少し始めた。ウイルス接種の〜10,000倍の増幅があった。 以前の実験では、ガスの流れを監視し、調節すること、細胞増殖（未発表データ）を最大化するために重要であることを見出した。急速に成長する細胞は、酸素のシステムとを枯渇することができます<html>ゼロに落とすDOレベル。細胞が成長を続けている間、それははるかに遅い速度であった。これは、対数増殖期の間に細胞の要求を満たすために酸素の流れを監視し、調整することが重要である。各ランは、毎日細胞数とpHは、DOおよび温度とを比較することにより、最適な成長のために分析することができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" /> さまざまな原子炉の容量で壁面せん断力を測定スターラータンクバイオリアクターと比較して空気圧バイオリアクターシステム（PBS）の図1に流体力学 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" /> 図2。空気圧エアホイールリアクターインペラー。 <html> 52008 / 52008fig3highres.jpg &quot;/&gt; バイオリアクターの実行を開始するために、パラメータの3空気圧エアホイールソフトウェアのスクリーンショット図。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" /> A549細胞2時間後に接種した。図4。マイクロキャリア植民地化。（平均マイクロキャリア径〜180程度である。） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" /> 図5に12時間培養開始後、A549細胞は、取付平坦化、およびマイクロキャリアに広がっている。5highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" /> 培養中の24時間後に細胞で覆われた図6のマイクロキャリア。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" /> A549細胞によるマイクロキャリア植民地化の図7の割合は接種後。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" /> 図8 adenovir、培養前の生A549細胞の数と感染後当方は、ウイルス感染工程は50時間で起こったことに注意してください。

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Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

使い捨て空気圧バイオリアクターシステムを使用して、哺乳動物細胞の培養

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.3K ビュー.  Johns Hopkins University. Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells. 

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

生物工学

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3次元自己組織化ペプチドハイドロゲル中のヒト神経前駆細胞の栽培

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

ベンチトップリアクターの操作

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

多様な微生物群集の高密度栽培のための新しいバイオリアクター

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

哺乳類細胞培養を均一な骨材を生産する O の形をした船で揺れ、軌道

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. This work describes the key steps leading to the construction of efficient sgRNA vectors using a strategy that allows the efficient detection of the positive colonies by PCR prior to DNA sequencing. Since efficient genome editing using the CRISPR system requires a highly efficient sgRNA, a preselection of candidate sgRNA targets is necessary to save time and effort. A dual luciferase reporter system has been developed to evaluate knockout efficiency by examining double-strand break repair via single strand annealing. Here, we use this reporter system to pick up the preferred xCas9/sgRNA target from candidate sgRNA vectors for specific gene editing. The protocol outlined will provide a preferred sgRNA/CRISPR enzyme vector in 10 days (starting with appropriately designed oligonucleotides).

Here, we present a protocol describing a streamlined method for the efficient generation of plasmids expressing both the CRISPR enzyme and associated single guide RNA (sgRNAs). Co-transfection of mammalian cells with this sgRNA/CRISPR vector and a dual luciferase reporter vector that examines double-strand break repair allows evaluation of knockout efficiency.

二重ルシファーゼレポーターシステムによるCRISPRプラスミドの構築と哺乳動物細胞におけるノックアウト効率の検出

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...