This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.

1 Accesso <ol><li> Accendere il bioreattore. Fare clic su un punto qualsiasi per aprire la pagina di login. Selezionare il nome utente e inserire la password e clicca su &quot;Accedi&quot;. </li></ol> 2 Calibrazione <ol><li> Calibrare sensore di pH (2 punti prima di autoclave). </li><li> Controllare il sensore di pH e confermare punta del sensore è piena di soluzione elettrolitica. Preparare due bicchieri con soluzioni di calibrazione pH (elettrolito) pH 4 e pH 7 e hanno a disposizione un flacone di lavaggio con acqua distillata. </li><li> Collegare il cavo pH al sensore di pH. Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; sull&#39;interfaccia Ciao e fare clic su &quot;calibrazione&quot;. Inserisci temperatura del tampone nel campo Temp soluzione di calibrazione. </li><li> Inserire sensore pH in tampone 1 (pH 4) e inserire il valore nel campo &quot;zero&quot;. Attendere che il grafico per stabilizzare e il tasto &quot;1 calibrare&quot; fare clic su. Sciacquare il sensore di pH con acqua distillata. </li><li> Sensore nel buffer di 2 (pH 7). Inserisci tampone2 valore nel campo &quot;span&quot;. Attendere grafico per stabilizzare e fare clic su Calibra pulsante 2. </li><li> Fare clic su &quot;Salva&quot;, quindi fare clic su &quot;Chiudi&quot;. </li><li> Calibrare il sensore dell&#39;ossigeno disciolto (DO). </li><li> Assicurarsi che il sensore DO è stato polarizzato essendo collegato al sistema per diverse ore. Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; sull&#39;interfaccia Ciao e fare clic su Calibra. Fare clic sul pulsante &quot;DO A&quot;. </li><li> Scollegare il sensore DO e inserire 0 nel campo &quot;zero&quot;. Attendere che il grafico per stabilizzare e il pulsante &quot;Calibrate 1&quot; fare clic su. </li><li> Ricollegare il sensore DO e immettere 100 nel campo &quot;Span&quot;. Attendere che il grafico per stabilizzare e il pulsante &quot;Calibrate 2&quot; fare clic su. </li><li> Fare clic su &quot;Salva&quot;, quindi fare clic su &quot;Chiudi&quot;. </li></ol> 3. Autoclave ed installare i sensori e navi reagenti <ol><li> Dopo la calibrazione, sensori posto e ben termico in AUTOCsacchetti Lave e autoclave per 30 minuti a 121 ° C, 15 psi. </li><li> Sterilizzare sacchetti autoclave con il 70% alcol isopropilico (IPA) e di trasferimento sacchetti di cappa di sicurezza biologica (BSC). Rimuovere imballaggio esterno della nave. </li><li> Sterilizzare imballaggio interno con il 70% di IPA e trasferire nave cappa di sicurezza biologica (BSC). Rimuovere imballaggio interno e ispezionare la nave e il tubo per i danni inflitti durante il trasporto. </li><li> Installare il pH e DO sensori delle due porte anteriori. Installare il pozzo termico alla porta posteriore sinistra. Aprire il tappo del sensore. </li><li> Guida sensore attraverso la porta del sensore. Infilare il sensore saldamente nella porta. </li><li> Trasferimento nave fuori BSC. </li><li> Appendere la cavi dei sensori di pH DO e fuori il manicotto nave e verificare che nulla è nel manicotto. Far scorrere la nave nella manica, i piedi prima. </li><li> Inserire con cautela il sensore di temperatura nel pozzo termico nave. Assicurarsi che il fondo del recipiente poggia contro i riscaldatori. </li><li> Rimuovereil tubo imposta dalle loro borse. Codice colore Corrispondenza sulla tubazione ai connettori corrispondenti e pompe sulla centralina bioreattore. </li><li> Installare la linea principale del gas premendo il connettore nella sua presa di gas. Installare la linea del gas micro ruotando in senso orario il connettore nella presa del gas. Installare il tubo di scarico del filtro: </li><li> Aprire il forno del filtro. Fissare il filtro di scarico sul canale U per cui il suo tubo passa attraverso i due ganci al filtro e fuori del forno. </li><li> Installare il tubo dal sacchetto condensatore nel supporto tubo. Chiudere la porta. </li><li> Itinerario linee di addizione A e B, entrambe le linee di media, e la linea raccolto dietro il sensore DO e sulla panca accanto alla centralina bioreattore. </li><li> Collegare i cavi ai sensori DO e pH. </li></ol> 4. Aggiunta Medie e Micro-vettori <ol><li> Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; e cliccare su &quot;Controllo Pompe&quot; sull&#39;interfaccia computer. </li><li> Formare una Stericollegamento tra le linea inutilizzato mezzo oltre (1 banda arancione) e il supporto di origine flacone / sacca saldando il tubo o con raccordi Luer. </li><li> Fare clic sul dispositivo di scorrimento per attivare la pompa media su. Fare clic sul dispositivo di scorrimento per attivare il supporto pompa spenta dopo l&#39;aggiunta desiderata quantità di mezzo. </li><li> Mettere microcarrier perline in Ca 2 +, Mg 2 + libero PBS per 3 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare più volte con perline Ca 2 +, Mg 2 + libero PBS. </li><li> Autoclave per 15 minuti a 115 ° C, 15 psi. NOTA: Aggiungere 3 g / L (peso a secco) in questo esperimento. </li><li> Pompa a micro-vettori che sono stati idratati, lavati e sterilizzati in autoclave nel reattore nello stesso modo è stato aggiunto il mezzo nel passaggio 4.1. </li></ol> 5. equilibrazione e One-punto di calibrazione DO <ol><li> Impostare i controller per Auto e immettere i valori di riferimento desiderati. Qui, utilizzare Agitazione Set Point (SP) = 15 rpm, temperatura SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Attendere il parametri equilibrare. </li><li> Confermare sensore è completamente polarizzata. Confermare il valore attuale DO si è stabilizzato. </li><li> Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; e cliccare su &quot;calibrazione&quot;. Fare clic su &quot;DO A&quot;, fare clic su &quot;One-point&quot;. </li><li> Immettere &#39;100&#39; nel campo &quot;Span&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;Calibra 1&quot;, cliccare su &quot;Salva&quot; e cliccare su &quot;close&quot;: </li></ol> 6 Avvio di una corsa <ol><li> Passare alla scheda Azioni. Fare clic su &quot;Batch&quot;. Utilizzare la tastiera su schermo o una tastiera esterna per immettere un nome lotto di 16 caratteri o meno. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Nascondi&quot; della tastiera su schermo. Fare clic su &quot;Avvia partita&quot; confermare facendo clic su &quot;Start&quot; nella sovrapposizione. </li></ol> 7 Inoculare con celle <ol><li> Formare una connessione sterile tra una linea non utilizzata Oltre media (1 banda arancione) e la bottiglia di cellule / fonte bag mediante saldaturail tubo o utilizzando i raccordi Luer. </li><li> Installare la sezione in silicone del tubo nella pompa media in modo che la freccia verso il tubo tra la pompa e serbatoio. </li><li> Controllare morsetto tubo è aperto e la sua fascetta tubi ramificati è chiuso. Fare clic sul dispositivo di scorrimento per attivare la pompa dei media e cliccare su &quot;Off&quot;, dopo l&#39;aggiunta di cellule. </li><li> Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; e cliccare su &quot;Pompe di controllo&quot;. </li></ol> 8 Campionamento <ol><li> Dopo inoculazione e la frequenza che desidera monitorare la cultura, estrarre un campione dalla cultura nel modo seguente: </li><li> Passare alla scheda &quot;azioni&quot; e fare clic su &quot;prendere esempio&quot;. Posizionare il tubo di campionamento nella pompa di campionamento e manipolare il rubinetto di campionamento in base alle istruzioni visualizzate sullo schermo. </li><li> Eseguire almeno una osservazione al microscopio ogni giorno e conta delle cellule su questi campioni. </li><li> Quando le cellule hanno raggiunto la densità desiderata, in questo case 1,2 x 10 6 cellule / ml, di infettare le cellule con l&#39;aggiunta di un inoculo del virus. </li><li> Aggiungere asetticamente l&#39;inoculo di una siringa da 20 ml, e collegare la siringa ad una delle porte di addizione pezzi sul reattore. Introdurre l&#39;inoculo al reattore premendo sullo stantuffo della siringa. </li><li> Continuare campionamento e l&#39;analisi della cultura per il adenovirus concentrazione di particelle intracellulare. </li></ol>

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods.">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li><li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies.">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li><li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application.">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).</li><li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing.">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li><li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities.">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li><li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures.">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li><li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization.">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).</li></ol>

Autori D. Giroux e Y. Hashimura sono dipendenti di PBS Biotech che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Questo sistema di bioreattore monouso è relativamente semplice da usare e fornisce analisi in tempo reale per il monitoraggio e l&#39;analisi del reattore. E &#39;estremamente adatto per la coltura di cellule di mammiferi e insetti con densità di cellule che raggiungono oltre 30 milioni di cellule / ml. Oltre cellule A549 descritti in questo rapporto 11, siamo cresciuti SF-9 cellule di insetto nel bioreattore pure. La miscelazione delicata fornito dalla ruota di aria pneumatica riduce il danno cellulare. Diversi passaggi sono fondamentali quando si imposta questo reattore. In primo luogo, la corretta calibrazione del pH e DO sensori è importante per il controllo ottimale della coltura e per l&#39;aggiunta di reagenti per regolare il pH o l&#39;ossigeno nel sistema. In secondo luogo, i flaconi dei reagenti e sementi devono essere riempiti e gli attacchi luer effettuate in ambiente sterile come una BSC. Una volta che i flaconi dei reagenti vengono spostati fuori dell&#39;ambiente sterile, i collegamenti con le linee di alimentazione bioreattore devono essere fatte con cura per evitare la contaminazione microbica. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Anche se questo sistema di bioreattore funziona bene per le linee cellulari di mammiferi e insetti non è progettato per colture batteriche. Il sistema non può fornire la miscelazione rapida e ossigenazione che è necessario per le cellule batteriche. La crescita batterica è meglio realizzato in un bioreattore serbatoio agitato. Rispetto ad altri bioreattori monouso per colture cellulari di mammifero o di insetto, questo sistema è facile da usare, fornisce dati sufficienti per l&#39;analisi di piste, e ha una crescita cellulare simile o migliore rispetto agli altri sistemi monouso abbiamo valutato. Il sistema di bioreattore pneumatico uso singola ha il potenziale per soddisfare molte delle attività di ricerca e applicazioni cliniche nel campo delle bioterapie, vaccini, cellule staminali e medicina personalizzata 4. Inoltre, la flessibilità di questo sistema permette di batch, fed-batch, perfusione, e le applicazioni bioreattore trasfezione basate 5. Infine, i sistemi di bioreattori monouso monouso hanno il potenziale per soddisfare le esigenze di larga scala la produzione industriale e di aderire alle linee guida e raccomandazioni di agenzie di regolamentazione nazionali e internazionali 6-10.

Linee di cellule di mammifero possono essere classificati in una delle tre categorie in base alle loro caratteristiche di crescita: le cellule che crescono in sospensione, le cellule che crescono come aggregati, e le cellule che crescono ancorate ad un substrato. Anche se il bioreattore aria-wheel dimostrato in questo video è in grado di crescere tutti e tre i tipi di cellule, questo video dimostra l&#39;uso del bioreattore a crescere celle dipendenti di ancoraggio sul micro-portanti. Cellule di mammifero dipendenti di ancoraggio possono essere coltivate per lo scopo di produrre più cellule - in cui le cellule stesse sono il prodotto. Ad esempio, osseo derivate cellule staminali mesenchimali osseo umano sono attualmente coltivati ​​con lo scopo di raccolta delle cellule e parenterale in tessuto malato. Il bioreattore pneumatico dimostrato in questo video è dimostrata adatta alla realizzazione di tali cellule staminali mesenchimali per questa applicazione (Serra et al., Comunicazione personale, 2013). Anchorage depcellule di mammifero Endentski sono tipicamente coltivate su piccola scala in recipienti di coltura 2D come piastre di coltura cellulare, fiasche di coltura cellulare, o bottiglie a rulli, dove aderiscono ad una superficie di crescita specialmente trattata 1. Quando più celle sono desiderati, le piastre o flaconi possono essere espansi utilizzando più o grandi vasi. Tuttavia, per più conveniente coltivazione di grandi quantità di celle dipendenti ancoraggio, aumentando la superficie per l&#39;adesione delle cellule può essere realizzato utilizzando piccole perle solidi chiamati micro-portanti. A seconda delle caratteristiche di fissaggio della cella, diversi tipi di micro-portanti sono disponibili in commercio, come il destrano, peptide, o collagene rivestito. Micro-vettori hanno una grande superficie in rapporto al volume che fornisce una superficie maggiore per la crescita cellulare; e le micro-vettori possono essere mantenuti in sospensione con agitazione, che permette alle cellule di essere coltivati ​​a alta densità nei sistemi di bioreattori 2. Attualmente, i tipi di bioreactors dove cellule aderenti sono coltivate su micro-vettori comprendono fiaschi filatore e sistemi di serbatoi agitati, che utilizzano giranti assiali per mantenere in sospensione le cellule rivestite con micro-portanti. Diversi fattori sono importanti per la coltivazione di successo di cellule, tra cui tensione di ossigeno, sforzo di taglio, matrici di superficie, e di nutrienti e le concentrazioni del metabolita. L&#39;uso di bioreattori consente il monitoraggio in tempo reale delle condizioni di crescita e il potenziale di costi di produzione notevolmente inferiori 1. Ci sono parecchi disegni bioreattore comune per la coltivazione in vitro di cellule tra cui, sospensione agitata, ruotando vaso a parete, a fibre cave, borsa bioreattore su una piattaforma rocker, e sistemi a letto fluido 3. Molti di questi sistemi presentano problemi particolari per la coltivazione delle cellule e la scala -up, come il costo elevato, gradienti di concentrazione di nutrienti, taglio idrodinamico, l&#39;aggregazione delle cellule, e la difficoltà di campionamento, il monitoraggio, il controllo e cell scale-up. Varie linee cellulari aderenti sono usati nella produzione di virus, sia nella produzione di vaccini virali o per la produzione di vettori virali per applicazioni in terapia genica. In questo video, utilizzando l&#39;unico uso pneumatico sistema di bioreattore (Air-Wheel), dimostriamo la coltura delle cellule di carcinoma polmonare umano (A549), le cellule di micro-vettori per la produzione di un adenovirus oncolitici. Il disegno bioreattore pneumatico utilizza una ruota agitazione verticale che è alimentato dalla galleggiabilità di gas strippata nel fondo del bioreattore. Questo metodo agitazione delicato limita le forze di taglio idrodinamiche, ma assicura comunque di medie e cellulare ottimale miscelazione 4. Rispetto al reattore serbatoio agitato, il reattore pneumatico ha una bassa sforzi di taglio anche con sistemi di bioreattori Air-Wheel grande disponibilità (Figura 1). In contrasto bioreattori agitati cisterna, la girante verticale di questo unico reattore uso è attivata da un flusso di bolle di gas all&#39;internoil vaso, che consente delicata ed uniforme miscelazione medio (Figura 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 3&#160;</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single Use Assembly</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Human Lung Carcinoma Cells (A549)</td>
			<td style="width:124px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">&#160;CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose Medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA, 0.25%</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytodex 1 Microcarriers</td>
			<td style="width:124px;">GE</td>
			<td align="right">3781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifoam C</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Nella Figura 3, sono indicati i parametri per l&#39;inizio della corsa bioreattore. Questa figura mostra la schermata prima di impostare i parametri di temperatura, ossigeno disciolto, pH e agitazione. Una volta che i parametri sono impostati, i parametri della corsa vengono continuamente monitorati e le regolazioni possono essere fatte per mantenere le condizioni richieste. Il software produce una lettura continua che permette una facile identificazione dei problemi. In questo esperimento utilizzando 2,5 L di DMEM contenente 10% FBS, 250 ppm di SAFC antischiuma C, 2 mm L-glutammina e 3 g / L di micro-portanti, il sistema è stabilizzato in modo che la percentuale di ossigeno è del 50%, la temperatura è di 37 ° C, e il pH è 7,2. Il reattore viene inoculato con cellule A549 ad una concentrazione di 7 x 10 4 cellule / ml (o 10 cellule / micro-carrier). I parametri scelti per questa esecuzione comportato la maggior parte delle cellule aderenti alle micro-vettori in 2 ore (Figura 4). Dopo 12 ore, le cellule sono demonitrarsi segni di appiattimento e diffusione sulla superficie micro-portante (Figura 5). Entro 24 ore, micro-vettori hanno una distribuzione abbastanza uniforme della cellule, senza micro-vettori senza cellule e senza grandi ciuffi di celle micro-portanti (Figura 6). La percentuale di colonizzazione micro-carrier dalle cellule A549 è del 75% in 24 ore e 90% successivamente (Figura 7). Le cellule hanno continuato a crescere in modo esponenziale a ~ 1 milione di cellule / ml dopo 48 ore (Figura 8). Dopo l&#39;infezione da una dose di adenovirus oncolitici (2 x 10 8 virioni / ml) a 50 ore, la densità è aumentato a 1,2 milioni di cellule / ml e poi ha cominciato a diminuire, come l&#39;infezione litica progredito. C&#39;era ~ 10.000 volte amplificazione del inoculo virale. In esperimenti precedenti, abbiamo trovato che il monitoraggio e la regolazione del flusso di gas è fondamentale per massimizzare la crescita delle cellule (dati non pubblicati). Rapidamente cellule in crescita possono esaurire il sistema di ossigeno con<html> il livello DO cadere a zero. Mentre le cellule hanno continuato a crescere, era a un ritmo molto più lento. E &#39;fondamentale per controllare e regolare il flusso di ossigeno per soddisfare le esigenze di cella durante la fase di crescita logaritmica. Ogni corsa può essere analizzato per una crescita ottimale confrontando il pH, DO, e la temperatura con conta delle cellule quotidiane. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" /> Figura 1. Fluidodinamica del pneumatico bioreattore System (PBS), rispetto a un serbatoio bioreattore agitatore misura parete forze di taglio in vari volumi reattori. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" /> Figura 2 girante reattore Pneumatic Air-Wheel. <html> 52008 / 52008fig3highres.jpg &quot;/&gt; Figura 3 Pneumatic Air Wheel software schermata di parametri di avviare la corsa bioreattore. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" /> Figura 4 colonizzazione Micro-carrier con le cellule A549 2 ore dopo l&#39;inoculazione. (Diametro medio di micro-carrier ~ 180 micron.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" /> Figura 5 12 ore dopo l&#39;inizio della cultura, le cellule A549 attribuiscono, appiattimento, e diffondendo sui micro-portanti.5highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" /> Figura 6. Micro-portanti rivestiti con cellule dopo 24 ore di coltura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" /> Figura 7 Percentuale di colonizzazione micro-carrier da parte delle cellule A549 post-inoculazione. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" /> Figura 8 Il numero di cellule vitali A549 in coltura prima e dopo l&#39;infezione con adenovirnoi. Notare che il punto infezione virale si è verificato a 50 ore.

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Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Ricerca

Bioingegneria

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

Il funzionamento di un bioreattore da banco

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Un bioreattore Novel per l&#39;alta densità di coltivazione diverse comunità microbiche

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.

L&#39;incapsulamento delle cellule dei mammiferi nei branelli di Alginate usando un vaso semplice mescolato

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

Un orbitale scuotendo la coltura di cellule di mammifero in vasi O a forma di produrre aggregati uniformi

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. This work describes the key steps leading to the construction of efficient sgRNA vectors using a strategy that allows the efficient detection of the positive colonies by PCR prior to DNA sequencing. Since efficient genome editing using the CRISPR system requires a highly efficient sgRNA, a preselection of candidate sgRNA targets is necessary to save time and effort. A dual luciferase reporter system has been developed to evaluate knockout efficiency by examining double-strand break repair via single strand annealing. Here, we use this reporter system to pick up the preferred xCas9/sgRNA target from candidate sgRNA vectors for specific gene editing. The protocol outlined will provide a preferred sgRNA/CRISPR enzyme vector in 10 days (starting with appropriately designed oligonucleotides).

Here, we present a protocol describing a streamlined method for the efficient generation of plasmids expressing both the CRISPR enzyme and associated single guide RNA (sgRNAs). Co-transfection of mammalian cells with this sgRNA/CRISPR vector and a dual luciferase reporter vector that examines double-strand break repair allows evaluation of knockout efficiency.

Costruzione di plasmidi CRISPR e rilevamento dell'efficienza knockout nelle cellule di mammifero attraverso un sistema Dual Luciferase Reporter

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...