The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).

NOTA: Este protocolo se puede utilizar para múltiples aplicaciones tales como la cuantificación de la polimerización de la fagocitosis y la actina, como se usa en nuestro trabajo publicado previamente 12. El protocolo se presta a una variedad de modificación, y los tipos Tabla 1 listas de células y partículas utilizado con éxito en estudios anteriores. Uso estándar de este protocolo para la cuantificación de la polimerización fagocitosis o actina se ilustra en el diagrama 1. <img alt="Diagrama 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600" /> Diagrama 1:. Diagrama de ensayo fluorométrico para la cuantificación de la polimerización de actina Después de la fagocitosis y las células se sembraron, se trata y se dejaron adherir, partículas marcadas con fluorescencia verde (FITC) se añaden a las células durante la fagocitosis. La reacción se detiene por tripano o antibilavado ótico (para eliminar las partículas no internalizadas) y la fijación se realiza con 4% de paraformaldehído. Las células son posteriormente teñidas con etiqueta de color rojo fluorescente actina (rodamina phalloidin) y marcador fluorescente azul (DAPI). Índices de la fagocitosis y la polimerización de actina se cuantifican como una relación de unidades relativas de fluorescencia de verde / azul (FITC / DAPI) o azul (rodamina / DAPI) fluorescencia roja /. 1. Chapado y Pilas de Tratamiento NOTA: Antes de comenzar, considere la posibilidad de ejecutar los tratamientos con al menos 4 repeticiones técnica, e incluyen los siguientes controles en el diseño de la placa: sólo las células (sin manchas, con DAPI solo o rodamina solo) y de partículas solamente. <ol><li> Llevar a cabo todas adición de reactivos en los pasos 1-4 en una campana de cultivo celular estéril con el fin de proteger las muestras de la contaminación. </li><li> Macrófagos placa (línea celular murina J774) en una placa de 96 pocillos a 1-5 x 10 4 células en 50 l (por pocillo)<html> de los medios de comunicación complementado precalentado. Placas ideales para este método son placas de 96 pocillos de color negro con fondos transparentes o negro, dependiendo de las capacidades del lector. <ol><li> Por medio suplementado, utilizar 10% FBS inactivado por calor para evitar la interferencia de la cascada del complemento, y 1% de penicilina / estreptomicina (si no se utiliza bacterias vivas para la fagocitosis). Si se utilizan células adherentes permiten 1-2 horas para la adhesión, y para las células no adherentes, girar hacia abajo la placa con las células durante 10 min a 500 x g. </li></ol></li><li> Añadir deseados agonistas / antagonistas o vehículo de control a una concentración 2x ​​(resuspendieron en PBS o más preferiblemente, en medio suplementado) en 50 l para un volumen final de 100 l (1x) y se incuba durante una cantidad de tiempo deseado. Pipeta multicanal y reactivos embalses facilitar el procesamiento más rápido. </li></ol> 2. Opsonización de partículas fluorescentes ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Tabla 1: Probado tipos de células y partículas fluorescentes en el análisis fluorométrico de la Tabla 1 ilustra combinaciones de tipos de células (líneas celulares, y células primarias) que nuestro grupo ha utilizado a través del método fluorométrico la fagocitosis y la polimerización de actina.. Además de observar la fagocitosis y la polimerización de actina por células de tipo salvaje, también hemos utilizado algunas de estas partículas para el examen de la fagocitosis por las células transfectadas que expresan un GFP (proteína fluorescente verde). La fluorescencia de las células transfectadas con plásmidos que contienen los reporteros fluorescentes también se puede utilizar como un marcador celular además de DAPI leyenda de la tabla:. A - polimerización de la actina; P - fagocitosis; PT - fagocitosis por células transfectadas GFP marcado; OPDex - opsonizado cordón de dextrano; HKOP - calor mató opsonizó. <ol><li> Asegúrese de que las partículas fluorescentes y etiquetas se protegen de la luz en todo momento, during tratamiento, el lavado, así como durante la incubación con el fin de evitar photobleaching <ol><li> Para partículas secas, pesar bacterias calor fluorescente muertos opsonizadas (HKOP) (E2861: E. coli K-12 cepa), utilizando las especificaciones del fabricante. Tenga cuidado para asegurarse de que las cuentas de masas de 10: 1 a 20: 1 bacterias: proporción de células (o al menos una proporción de 10: 1 - comúnmente utilizado en la cuantificación de la fagocitosis) 13,14. Número de partículas puede ser proporcionado por el fabricante o determinarse mediante couting diluciones en serie de 1 mg solución / ml. </li><li> Resuspender en 50 l de PBS y agitar durante 1 minuto en la posición más alta. Asegurar vórtex adecuada (aquí y en todo el protocolo) como las partículas tienden a agregarse que pueden afectar a la eficacia de opsonización. </li><li> Para las partículas en suspensión tales como perlas de dextrano marcados con fluorescencia (cuentas DEX), vórtice la solución madre de 1 min, tomar 50 l de suspensión o dependiendo de la concentración del talón en el volumen dmontaje etermine de cuentas para facilitar 10: 1 del grano: proporción de células. </li></ol></li><li> Añadir un volumen igual de reactivo de opsonización de las partículas y agitar vigorosamente durante otro minuto. </li><li> Se incuban las partículas con opsonizantes reactivo a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Después de la incubación, centrifugar las partículas durante 5 min a 500 xg, y retire el sobrenadante que contiene exceso de reactivo opsonizante. Lavar las partículas mediante la adición de 100 l de PBS, vórtice para resuspender el pellet, y centrifugado durante 5 min a 500 x g. <ol><li> Repita estos pasos dos veces para asegurar la opsonización y eliminación de anticuerpo no unido adecuada. </li></ol></li><li> Preparar la solución de trabajo de partículas opsonizadas por resuspensión en 5 ml de medio (suficiente para una placa de 96 pocillos) y almacenar lejos de la luz hasta la adición a las células. </li></ol> 3. La fagocitosis <ol><li> Coloque la solución de trabajo de partículas en un depósito de reactivo estéril. Desde aquí, añadir 5056; l de partículas opsonizadas a las células preparadas en el paso 1 (para una concentración final de 50 ng / ml) y dejar que se produzca la fagocitosis en condiciones de cultivo celular estándar. A continuación se ilustran dos métodos de fagocitosis que se pueden evaluar mediante este método (Diagrama 2). </li></ol><img alt="Diagrama 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600" /> Diagrama 2:. Comparación de la continua versus sincronizar la fagocitosis fagocitosis continuas indica internalización continua de partículas con el tiempo a medida que lentamente llegar a las células en la parte inferior del pozo. Un paso de sincronización de contraste (centrifugación) obliga a que las partículas se hunden hasta el fondo, mejorando el contacto de las partículas con la célula, y lleva a la internalización inmediata por las células. Fagocitosis sincronizada es un proceso más rápido que interioriza más rápidamente parteicles debido al aumento de células: el contacto de las partículas. <ol><li><ol><li> Para el método de la fagocitosis continua (Diagrama 2) que permiten a las células fagocitan las bacterias opsonizadas continuamente a medida que lentamente se hunden hasta el fondo y entran en contacto con las células, utilizan marcos de tiempo más largos para permitir que las bacterias alcanzan la parte inferior del pozo y obtener en tocar con las células. Si la realización de un experimento de transcurso de tiempo, añadir bacterias a diferentes intervalos de tiempo y detener toda la placa de reacciones al mismo tiempo para mejorar la velocidad de procesamiento. </li><li> Para el método sincronizado fagocitosis (Diagrama 2) que mejora la partícula: el contacto célula a través de centrifugación, de girar toda la placa que contiene las células y partículas (5 min a 500 xg) tan pronto como se añaden las partículas, para facilitar la sincronización de todos los puntos de tiempo y para acelerar la partícula: interacción celular. <ol><li> Mida el curso de tiempo a partir justo después de la finalización de la centripaso fugation. Si la realización de un experimento de curso de tiempo, detener cada punto de tiempo independientemente en diferentes intervalos de tiempo como se describe a continuación. </li></ol></li></ol></li></ol> NOTA: El método de la fagocitosis sincronizada es algo más laborioso de la anterior, pero proporciona mayor índice fagocítico en un tiempo más corto. 4. La fagocitosis Detención <ol><li> Para las células adherentes, eliminar el sobrenadante y añadir 50 l de azul de tripano diluido con PBS (dilución 1: 2), con el fin de extinguir la fluorescencia de las bacterias no internalizadas. </li><li> Para las células no adherentes, de girar la placa y eliminar el sobrenadante. Añadir 50 l de azul de tripano diluida. Asegúrese de centrifugar la placa a (5-10 min a 500 xg) entre cada lavado a fin de minimizar la pérdida de células y permitir un lavado adecuado. </li><li> Después de la incubación de tripano, lavar las células dos veces con PBS para eliminar cualquier tripano residual (hasta que el PBS retira del pozo se vuelve clara). Trypan se ha demostrado que apagar la fluorescencia 15,16 de calor mató, partículas bacterianas no internalizados marcado con fluorescencia, pero no para las bacterias vivas o perlas OPDex. Para bacterias vivas, incluir un lavado con antibióticos tales como penicilina, estreptomicina, gentamicina o en lugar del lavado de tripano para evitar efectos de confusión de la fluorescencia de las partículas no internalizadas. </li><li> Fijar las células con 100 l de paraformaldehído al 4%, y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente, a continuación, lavar con PBS (a 100 l por pocillo para cada lavado). En este paso, salvar a las células a 4 ° C durante un máximo de una semana, o ir directamente a la tinción y cuantificación. NOTA: Todos los pasos posteriores forman este punto prólogo se puede hacer fuera de la campana de cultivo celular. </li><li> Quite todo el líquido y añadir 50 l de DAPI a 5 ng / ml reconstituido en PBS. Permitir 5 min para la tinción, y lavar dos veces con PBS. Después de la etapa de lavado, se añaden 50 l de PBS a cada fagocitosis bien y registro. </lyo&gt; </ol> 5. La actina tinción NOTA: Además de la fagocitosis, el método fluorométrico permitirá la cuantificación de la polimerización de actina mediante la medición de la intensidad de la actina, que se reduce durante la inhibición de lamellipodia, pseudopodiae, y la membrana plasmática como resultado de tratamiento con un inhibidor (Figura 1A). Este es un paso opcional si está interesado en la cuantificación de la polimerización de actina, además de la fagocitosis. Si la polimerización de actina es la meta final, utilizando partículas fluorescentes para la fagocitosis es opcional. <ol><li> Después de la fijación de paraformaldehído (paso 4.3), lavar la placa dos veces con PBS a 100 l por pocillo para cada lavado. Añadir 50 l de 0,1% de Triton X-100 en PBS para la permeabilización e incubar durante -5 min a TA. </li><li> Lave 0,1% de Triton X-100 2 veces con PBS (como anteriormente), y bloquear con 1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 20 min para evitar la unión no específica de la label. </li><li> Después del bloqueo, retire la solución de BSA y añadir inmediatamente rodamina phalloidin. Para preparar la solución de trabajo de tinción de rodamina, utilice 100 l de solución de metanoico (proporcionado por el fabricante) en 5 ml de PBS (suficiente para una placa). De la solución de trabajo añadir 50 l por pocillo e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. NOTA: Después de las etapas de lavado y tinción DAPI como en el paso 4.4 células estará listo para su cuantificación. </li></ol> 6. Cuantificación <ol><li> Para cuantificar la fagocitosis usando un lector de placas fluorescente, la fluorescencia verde registro usando el filtro de excitación a λ = 488 nm y filtro de emisión de fluorescencia a λ = 518 nm, y azul usando el filtro de excitación a λ = 355 nm y filtro de emisión a λ = 460 nm. </li><li> Para cuantificar la polimerización de la actina usando un lector de placas fluorescente, la fluorescencia azul registro a través de λ = 355 nm y λ = 460 nm (como anteriormente), y rojo de la gripeorescence a través de filtro de excitación a λ = 584 nm y filtro de emisión λ = 620 nm. NOTA: Orbital o detección central es aceptable para la grabación. Algunos tipos de células se reúnen más hasta el borde del pozo que el centro, en el que la grabación orbital caso puede ser ventajoso. En particular, promedio de tres puntos alrededor de la órbita también podría ser usada para obtener resultados más precisos. </li><li> Divida la RFU total de fluorescencia verde o roja por lectura de fluorescencia azul (de DAPI), dependiendo de la etiqueta de partículas o fagocítica vs. cuantificación actina (Diagrama 1). Debido a la alta variación de placa a placa, utilizar índices relativos (tales como relativa a t = 0 control), para ilustrar mejor las tendencias observadas y para facilitar el análisis estadístico más fiable. </li></ol>

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British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+malaria+by+enhanced+phagocytosis+of+erythrocytes+in+LMP7-deficient+mice.">Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice.</a> PloS One. 8 (3), 59633 (2013).</li><li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes.">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PloS One. 7 (3), 32621 (2012).</li><li>Al-Bader, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+trehalose+biosynthesis+in+Aspergillus+fumigatus+development,+stress+response,+and+virulence.">Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence.</a> Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).</li><li>Acosta-Iborra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+oxygen+sensing+modulates+antigen+presentation+and+phagocytic+functions+involving+IFN-gamma+production+through+the+HIF-1+alpha+transcription+factor.">Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor.</a> Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).</li><li>Ojielo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+phagocytosis+and+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+lung+following+bone+marrow+transplantation.">Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation.</a> Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).</li><li>Neu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14-dependent+monocyte+isolation+enhances+phagocytosis+of+listeria+monocytogenes+by+proinflammatory,+GM-CSF-derived+macrophages.">CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages.</a> PloS One. 8 (6), 66898 (2013).</li><li>Sokolovska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+caspase-1+by+the+NLRP3+inflammasome+regulates+the+NADPH+oxidase+NOX2+to+control+phagosome+function.">Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function.</a> Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).</li><li>Janko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRP/anti-CRP+antibodies+assembly+on+the+surfaces+of+cell+remnants+switches+their+phagocytic+clearance+toward+inflammation.">CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).</li><li>Clatworthy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus-associated+defects+in+the+inhibitory+receptor+FcgammaRIIb+reduce+susceptibility+to+malaria.">Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).</li><li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+decreases+bacterial+phagocytosis+by+inhibiting+actin+polymerization+through+cAMP-,+Rac-1-,+and+p38+MAPK-dependent+mechanisms.">Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms.</a> The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).</li><li>Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemophagocytic+macrophages+harbor+Salmonella+enterica+during+persistent+infection.">Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).</li><li>Xue, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+gene+transfer+and+expression+in+cord+blood-derived+CD34++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+a+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposon+system.">Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system.</a> Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).</li><li>Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+distinguishing+ingested+from+adhering+particles.+Methods+in+Enzymology.">Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology.</a> 132. , 198-204 (1986).</li><li>Scott, A. J., Woods, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+internalization+of+Histoplasma+capsulatum+by+mammalian+cell+lines+using+a+fluorometric+microplate+assay.">Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay.</a> Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Las principales limitaciones de la técnica fluorométrica son varianza experimental, así como la pérdida de células asociada con un lavado extensivo y el uso de células no adherentes. Varianza se observa en gran parte debido a la variación en partículas fluorescentes como pesaje y de pipeteado durante la preparación de la solución madre no es una manera exacta de mantener números idénticos de partículas de experimento a experimento. Para abordar el problema de la varianza entre l...

La cuantificación de la señal fluorescente ha sido ampliamente utilizado en una multitud de métodos científicos que van desde PCR, citometría de flujo, microscopía confocal, y el análisis FRET para multiplexar ELISA. Imágenes de fluorescencia y cuantificación tiene una amplia aplicación y puede ser una gran herramienta para el análisis cuantitativo de diversos procesos celulares. El uso de marcadores fluorescentes y su señal se ha revolucionado en la última década, y la aparición de lectores de placas fluorescentes ha facilitado la cuantificación de alto rendimiento de la fluorescencia emitida durante los procesos celulares. Análisis Fluorométrico puede servir como una gran herramienta en la cuantificación de la fagocitosis. La fagocitosis se ha estudiado desde el descubrimiento de los fagocitos por Metchnikoff en 1800 1. A través de los años, una variedad de métodos se han utilizado para examinar este importante proceso esencial para la defensa inmune innata contra la invasión bacteriana, viral, fúngica y parásitos patógenos 2-5. Los métodos anteriores de cuantificación utilizado técnicas de microscopía y estereológicos el fin de visualizar las células que se phagocytosing, que luego se cuantificó por recuento de partículas internalizadas (manualmente o con el uso de software) 6-8. Algunas desventajas en el uso de microscopía solo para el análisis cuantitativo son que el recuento manual de las bacterias es una labor intensiva y más propenso a sesgo del observador. Otro método utilizado en la cuantificación de la fagocitosis es la técnica microbiológica de chapado de bacterias de lisados ​​celulares (siguientes fagocitosis) en placas de cultivo de bacterias, pero este método puede fallar para dar cuenta de los mecanismos bactericidas y presencia de bacterias parcialmente internalizadas. Este método es intensivo incluso más mano de obra en comparación con la microscopía y lleva varios días para analizar. La citometría de flujo parece ser la forma más rápida, más eficaz para cuantificar la fagocitosis y ha sido utilizado por muchos grupos de 9-11, pero el alto costo asociado comúnmente con el eninstrumento necesario para el análisis hace que sea el método más caro en comparación con los ensayos mencionados anteriormente. El método fluorométrico es una buena alternativa a la citometría de flujo para el análisis de la internalización de partículas, ya que ofrece la cuantificación insesgada de fluorescencia utilizando equipo que no es tan costo prohibitivo. Otros beneficios añadidos de fluorometría son de alta eficiencia, y las capacidades de alto rendimiento para la cuantificación de la fluorescencia emitida por las partículas internalizadas etiquetados. Beneficios de la fluorometría pueden extrapolarse a la cuantificación de los procesos distintos de la fagocitosis. Por ejemplo, el análisis fluorométrico se puede aplicar para estudiar cualquier proceso que conduce a cambios en la expresión intracelular o de receptores unidos a membrana, los cambios en la permeabilidad celular / viabilidad, la eficacia de la transfección, y la modulación en la polimerización de actina. Una desventaja de la técnica fluorométrica es que, dependiendo de las etiquetas utilizadas, puede haber un altoexperimento para experimentar la variabilidad que por lo general puede ser resuelto mediante la demostración de los datos a través de la cuantificación relativa, como el cambio veces o por ciento de aumento de control.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="820">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:131px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">1-&#956;m yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">F8852</td>
			<td style="width:255px;">combine 50&#956;l with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;">Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2861</td>
			<td style="width:255px;">reconstitute (5 mg) in 50&#956;l of PBS and combine with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Opsonizing reagent</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2870</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Rhodamine phalloidin</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">R415</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">RPMI Cell growth media&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fluorescent plate reader-Fluostar Omega</td>
			<td style="width:131px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td style="width:131px;">Fischer Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td style="width:255px;">dilute to 4% before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">96 well plates</td>
			<td style="width:131px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">655097</td>
			<td style="width:255px;">clear or black or clear bottom - black plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Multichannel pipette (8-12 channels)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Reagent reservoirs</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1x PBS</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microfuge tubes (0.6 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">&#160;Conicles (10 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization

El objetivo del análisis fluorométrico es servir como un costo efectivo, método rendimiento eficiente, de alta de analizar la fagocitosis y otros procesos celulares. Esta técnica se puede utilizar en una variedad de tipos de células, tanto adherentes y no adherentes, para examinar una variedad de propiedades celulares. Al estudiar la fagocitosis, la técnica fluorométrica utiliza tipos de células fagocíticas tales como macrófagos, y las partículas opsonizadas marcados con fluorescencia, cuya fluorescencia se puede extinguir en presencia de azul de tripano. Después de chapado de macrófagos adherentes en placas de 96 pocillos, partículas fluorescentes (verde o rojo) se administran y las células se les permite fagocitar por cantidades variadas de tiempo. Después de la internalización de las partículas fluorescentes, las células se lavan con azul de tripano, lo que facilita la extinción de la señal fluorescente a partir de bacterias que no se internalizan, o son simplemente se adhieren a la superficie de la célula. A continuación del lavado de tripano, las células se lavaron con PBS, se fijaron, unand teñidas con DAPI (marcador fluorescente azul nuclear), que sirve para etiquetar núcleos de las células. Por una sencilla cuantificación fluorométrico través de la lectura de la placa nuclear (azul) o de partículas (verde / rojo) de fluorescencia que puede examinar la relación de unidades relativas de fluorescencia de color verde azul y determinar un índice de fagocitosis indicativo de la cantidad de bacterias fluorescentes internalizadas por célula. La duración del ensayo utilizando un método y multicanal 96 pocillos pipetas para el lavado, desde el extremo de la fagocitosis hasta el final de la adquisición de datos, es menos de 45 min. La citometría de flujo podría ser utilizado de una manera similar pero la ventaja de fluorometría es su alto rendimiento, rápido método de evaluación con una mínima manipulación de las muestras y cuantificación rápida de intensidad de fluorescencia por célula. Estrategias similares se pueden aplicar a las células no adherentes, bacterias marcadas en vivo, la polimerización de actina, y esencialmente cualquier proceso que utiliza fluorescencia. Por lo tanto, fluorometría es un método prometedor para su bajo costo, alta throughpcapacidades ut en el estudio de procesos celulares.

Dos de las principales formas de cuantificar la fagocitosis y la polimerización de la actina posterior a través de la utilización de este protocolo es observar la fagocitosis continuo o sincronizado. El análisis microscópico (Figura 1B) ilustra imágenes fluorescentes comparables a lo que está grabando el fluorómetro (también ver Diagrama 1). En la Figura 1B son fluorescencia roja de actina, verde 268 de fluorescencia de FITC etiquet...

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High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.5K vistas.  University of Minnesota. Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Investigación

Inmunología e Infección

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

Sin células bioquímico análisis enzimático fluorométrico para medición de alto rendimiento de la peroxidación lipídica en lipoproteínas de alta densidad

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

Utilizando mayor expresión de proteína de fluorescencia verde Escherichia Coli evaluar fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

Alto rendimiento en la evaluación de Vitro de latencia inversión a en VIH transcripción y Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

Fagocitosis del macrófago alveolar y remoción de bacterias en los ratones

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

En la evaluación Vivo de la efiytosis de macrófagos alveolares tras la exposición al ozono

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.