La macropinocitosis es una vía endocítica que es importante para una variedad de procesos celulares, incluido el metabolismo del cáncer. Este protocolo le permite cuantificar el alcance de la macropinocitosis en células in vitro. La automatización tiene como objetivo maximizar la reproducibilidad, la productividad y reducir la variación experimental.
Además, la microscopía fluorescente le permite inspeccionar visualmente la muestra para determinar la calidad experimental y evaluar las características adicionales del macropinosoma. Demostrando el procedimiento conmigo estará Cheska Marie Galapate, una asistente de investigación de mi laboratorio. Para la placa de 24 pocillos con formato de funda, use fórceps para agarrar una sola funda del baño de etanol.
Golpee el cubrecolchas en la pared interior de la placa para eliminar el exceso de etanol y coloque el cobertor plano en el fondo del pozo. Después de que el etanol se evapore, lave el coverslip dos veces con DPBS, luego sembra las células en la parte superior del coverslip agregando 500 microlitros de la suspensión celular a cada pozo. Coloque las células en una incubadora de células de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono hasta que la confluencia celular alcance el 60 a 80% el día antes del etiquetado de macropinosomas.
El día antes del etiquetado de macropinosomas, reemplace los medios en los pocillos con 500 microlitros de medios sin suero precalentados y coloque las células en la incubadora durante 16 a 24 horas. Para el formato de microplaca de 96 pocillos, comience transfiriendo la suspensión celular a un depósito de reactivo de 25 mililitros. Luego, utilizando una pipeta multicanal, sembra 100 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una microplaca negra de alto contenido de 96 pocillos con un fondo de olefina o vidrio cíclico ópticamente transparente.
Incubar las células hasta que la confluencia celular alcance el 60 a 80% el día antes del etiquetado de macropinosomas. El día antes del etiquetado de macropinosomas, retire y deseche los medios de cada pozo utilizando un adaptador de aspiración multicanal para puntas estándar conectadas a una bomba de vacío. Alternativamente, se puede utilizar una pipeta multicanal.
Usando un depósito de reactivo y una pipeta multicanal, agregue suavemente 100 microlitros de medios sin suero precalentados a cada pozo, luego coloque las células en la incubadora de células durante 16 a 24 horas. Para la placa de 24 pocillos con formato de recubierta, reemplace los medios en los pocillos con 200 microlitros de medios sin suero con dextrano de alto peso molecular marcado con fluoróforo y coloque las células en la incubadora de células durante 30 minutos. Después de la incubación, aspire los medios y lave suave pero rápidamente las células cinco veces con PBS helado usando una botella de lavado preenfriada.
Agite firmemente la placa a mano durante los lavados para ayudar a desalojar los agregados de dextrano que se adhieren a las cubiertas. A continuación, fije las células agregando 350 microlitros de formaldehído al 3.7% e incubando durante 20 minutos, luego aspire la solución de fijación y lave las células con PBS dos veces. Tinción de los núcleos con 350 microlitros de DAPI en PBS.
Después de 20 minutos, aspire la solución dapi y lave las células con PBS tres veces. Adhiera aisladores de silicona uno al lado del otro en un portaobjetos de microscopio para obtener un espaciado uniforme y una localización reproducible de las cubiertas necesarias para la automatización de imágenes. Luego, para cada funda, agregue una gota de soporte de montaje de fluorescencia endurecida en el portaobjetos del microscopio dentro del espacio abierto del aislador.
Tome una funda con fórceps y elimine el exceso de PBS golpeando suavemente el lado de las fundas en una toallita sin pelusa. A continuación, coloque la cubierta boca abajo en la gota del soporte de montaje y toque suavemente la cubierta con pinzas cerradas para eliminar las burbujas de los medios de montaje. Guarde las diapositivas en un ambiente oscuro y permita que los medios de montaje se sequen a temperatura ambiente, lo que generalmente toma de 16 a 24 horas.
Antes de tomar imágenes, retire los aisladores del portaobjetos del microscopio. Después de que los portaobjetos se hayan equilibrado a temperatura ambiente, limpie las fundas con un aplicador con punta de algodón humedecido con un limpiador de vidrio sin amoníaco. Posteriormente, use un aplicador limpio con punta de algodón humedecido con etanol al 70% para limpiar el cubrebocas y dejarlo seco.
Para el formato de microplaca de 96 pocillos, después de aspirar los pocillos como se demostró anteriormente, agregue 40 microlitros de medios sin suero con dextrano de alto peso molecular marcado con fluoróforo a los pocillos, luego incube las células en la incubadora de células durante 30 minutos. Después de la incubación, deseche los medios en la microplaca moviendo manualmente la placa boca abajo en un vaso de precipitados de cinco litros vacío, luego enjuague las células y la microplaca dos veces sumergiendo lentamente la placa verticalmente en un ligero ángulo en un vaso de precipitados de dos litros lleno de PBS helado y posteriormente deseche el PBS en la microplaca moviendo la placa boca abajo en el vaso de precipitados de cinco litros. Después del último enjuague con PBS, fije las células agregando 100 microlitros de formaldehído al 3.7% en PBS a cada pozo utilizando un depósito de reactivo de 25 mililitros y una pipeta multicanal.
Después de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, retire la solución de fijación y lave las células con PBS utilizando la técnica de inmersión y desplazamiento. Después del segundo lavado de PBS, tiñe los núcleos con 100 microlitros de DAPI en PBS por pozo. Después de 20 minutos, enjuague las células tres veces con PBS helado como se demostró anteriormente.
Retire cualquier PBS residual tocando la microplaca boca abajo en una toallita sin pelusa. Luego agregue 100 microlitros de PBS fresco a cada pozo utilizando un depósito de reactivo de 25 mililitros y una pipeta multicanal. Antes de obtener imágenes, deje que la placa se equilibre a temperatura ambiente, luego seque la placa de cultivo celular con una toallita sin pelusa.
Alternativamente, guarde la placa cubierta lejos de la luz a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana. Para imágenes automatizadas de macropinosomas, cree un protocolo de automatización para adquirir las imágenes con un objetivo de aire 40X en el canal de longitud de onda del fluoróforo de dextrano y DAPI. A continuación, optimice la configuración de exposición utilizando una muestra que se predice que tiene el nivel más alto de macropinocitosis para evitar la sobreexposición, lo que puede provocar la saturación de la señal y la pérdida de datos de intensidad.
Utilice ajustes de enfoque que localicen la muestra de forma fácil y coherente para producir imágenes de alta calidad. Adquiera múltiples imágenes en cada pozo o cubierta para tener en cuenta la variabilidad de la muestra y obtener una representación precisa de la muestra. Para determinar el índice macropinocítico, reste el fondo de la DAPI y la imagen de dextrano correspondiente aplicando la función apropiada, frecuentemente llamada función de bola rodante.
Ajuste la configuración para que el ruido de fondo se minimice con un efecto de resta mínimo o nulo en la señal DAPI y dextran. A continuación, utilizando un campo con señal de alto dextrano, determine la configuración de la señal de intensidad, frecuentemente llamada función umbral, para seleccionar los núcleos, luego determine la configuración de señal de intensidad mínima requerida para seleccionar solo los macropinosomas. Para la imagen de dextrano, calcule la fluorescencia total dentro de la selección de macropinosomas creada o use la selección para determinar el área total positiva para dextrano.
Para la imagen DAPI, utilice la selección para determinar el número de núcleos en la imagen para reflejar el número de células presentes. A continuación, determine el índice macropinocítico dividiendo la fluorescencia o área total de dextrano por el número de células determinadas por DAPI. En las células PDAK AsPC-1, agregar EGF a 100 nanogramos por mililitro durante cinco minutos antes de agregar el dextrano activa la macropinocitosis.
Además, la activación autocrina del EGF de la macropinocitosis puede ser inducida por la privación de glutamina durante 16 a 24 horas. Las células MIA PaCa-2 muestran macropinocitosis constitutiva que se inhibe mediante un tratamiento de 30 minutos con 75 EIPA micromolares o un tratamiento de dos horas con 10 micromolares EHop-016. En un experimento de dosis-respuesta, el índice macropinocítico disminuyó gradualmente a concentraciones más altas de EHop-016 y EIPA, confirmando así la existencia de macropinocitosis constitutiva dependiente de Rac1.
Puede adaptar este procedimiento para evaluar la macropinocitosis de otra carga marcada fluorescentemente, como la albúmina. Además, se recomienda evaluar si la absorción macropinocítica de albúmina contribuye a la aptitud celular mediante la realización de ensayos de viabilidad celular. Esta técnica ha sido fundamental para la identificación del suministro de nutrientes macropinocíticos en el cáncer y las células del estroma y la automatización ha aumentado en gran medida nuestra capacidad de prueba de condición.
