El objetivo general de este ensayo, es preparar macrófagos y glóbulos rojos opsonizados para la visualización de la fagocitosis mediante microscopía tridimensional de lapso de tiempo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cómo los fagocitos capturan e ingieren partículas. Esta técnica permite la visualización de la absorción de partículas en tiempo real, a diferencia de los ensayos de punto final más tradicionales que sólo permiten la evaluación de si, pero no cómo, se ha ingerido una partícula.
Generalmente, los individuos nuevos en este método pueden tener problemas hasta que se acostumbren a los procedimientos de aislamiento celular. Primero tuvimos la idea de este método cuando nos dimos cuenta de las ventajas de girar esta microscopía confocal para la imagen de lapso de tiempo 3D de la fagocitosis. Para aislar los macrófagos peritoneales, coloque un catéter plástico de calibre 24 en el peritoneo de un ratón de tres a cuatro meses de edad, y utilice una jeringa de plástico de cinco mililitros para limpiar la cavidad dos veces con 4,5 mililitros de HBSS helado sin calcio y magnesio por lavado.
Transferencia de la suspensión aspirada a un tubo inferior redondo de polipropileno de 14 mililitros a medida que se recoge. Cuando ambas muestras hayan sido cosechadas, centrifugar el aspirado y resuspendir las células peritoneales en un mililitro de medio rpmI 1640 libre de bicarbonato completo para lograr aproximadamente seis veces 10 a la sexta concentración de células por mililitro. A continuación, para pre-llenar diapositivas añadir un mililitro de HEPES completo suplementado medio a un reservorio de un portaobjeto recubierto de fibronectina, e inclinar la diapositiva para permitir que el medio se aspire desde el depósito aguas abajo.
Para eliminar las burbujas de aire no deseadas, agregue uno a dos mililitros de medio fresco a uno de los dos depósitos y aplique firmemente una tapa de depósito. A continuación, aplique presión rítmica del pulgar a la tapa para bombear cualquier aire fuera de la diapositiva, inclinando la diapositiva según sea necesario. Cuando todo el aire haya sido expulsado, incline el deslizamiento hacia el medio sin tapicear que contiene el depósito y retire la tapa para evitar que el aire vuelva a aspirar al canal.
Ahora pipetear la solución celular un par de veces para reducir el aglutinamiento, y añadir 100 microlitros de las células en un canal de la diapositiva para una incubación de dos horas en una cámara húmeda a 37 grados centígrados en ausencia de dióxido de carbono. Al final de la incubación sustituya el medio que contiene HEPES en cada diapositiva por un medio completo de bicarbonato complementado como acaba de demostrar. Luego coloque las células en una incubadora húmeda de 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono para su cultivo nocturno.
A la mañana siguiente transfiera un mililitro de sangre de donante sano recién obtenida a un tubo de microcentrífuga de polipropileno de fondo redondo de dos mililitros. A continuación, centrifugar la muestra. Retire el plasma y la capa buffy que contienen sobrenadante.
Y transfiera cuidadosamente 100 microlitros de los glóbulos rojos sedimentados a un tubo de mircocentrífugio de dos mililitros que contenga 100 microlitros de medio completo suplementado con HEPES. Etiquete el tubo 1:1 y transfiera cuatro microlitros de los glóbulos rojos diluidos a un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros que contenga dos mililitros de medio completo suplementado con HEPES. A continuación, etiquete este tubo 4:2000 y coloque ambos tubos de muestra de glóbulos rojos diluidos sobre hielo.
Para etiquetar los macrófagos peritoneales reemplace el medio de bicarbonato en cada diapositiva de canal con medios completos complementados con HEPES. A continuación, incline la diapositiva para permitir que se añadan 100 microlitros del anticuerpo específico de macrófago de ratón con etiqueta fluorescente de interés a la apertura del canal de 100 microlitros de la diapositiva. Aspirar el medio que fluye hacia el depósito aguas abajo, e incubar las células durante 20 minutos en una cámara húmeda a 37 grados centígrados en ausencia de dióxido de carbono.
Mientras que las células peritoneales están siendo etiquetadas suavemente mezclar 4:2000 muestra de glóbulos rojos y transferir 400 microlitros de las células en un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros, en un bloque de aluminio calentado dentro de una campana de flujo laminar durante unos cinco a ocho minutos. Cuando las células se han calentado a 37 grados celsius mezclar 0.4 microlitros de una mancha de membrana plasmática fluorescente roja apropiada con las células. A continuación, vuelva a colocar las células en el bloque de calor.
Después de cinco minutos lavar las células mediante la adición de 1,6 mililitros de HEPES fresco complementado medio completo y centrífuga. Gire el tubo para identificar el gránulo de glóbulos rojos. Usando una punta de pipeta de uno a 1,5 mililitros retire cuidadosamente el sobrenadante en dos volúmenes sin alterar el pellet y mezcle 2000 microlitros de HEPES fresco complementado medio completo con las células.
Centrifugar y volver a suspender el pellet en 400 microlitros de medio. A continuación, etiquete el tubo PMS para la mancha de membrana de plasma. Al final de la incubación del etiquetado peritoneal de 20 minutos, lave el portaobjetos con un mililitro de HEPES fresco y completo.
Para opsonizar los glóbulos rojos añadir un microlitro de ratón IGG2B monoclonal anti humano CD235A anticuerpo al tubo de muestra PMS. Después de ocho minutos a 37 grados centígrados con la mezcla una vez por minuto, transfiera 100 microlitros de la membrana plasmática manchados de glóbulos rojos humanos astuitos A los macrófagos peritoneales que contienen el deslizamiento del canal. Tan pronto como se hayan añadido los glóbulos rojos humanos monte la diapositiva en un microscopio confocal de disco giratorio.
Con la incubadora de etapas ajustada a 37 grados centígrados e inmediatamente comenzar a tomar imágenes de las células. Lapso de tiempo 3D-imágenes de macrófagos fluorescentes verdes presentados con glóbulos rojos fluorescentes humanos permite la visualización de eventos fagocíticos de partículas únicas. Por ejemplo, se puede observar la captura de un ratón IGG opsonizado glóbulo rojo humano por un filopodio macrófago.
Así como, el exprimido de un glóbulo rojo humano durante la formación de la copa fagocítica. Después de ver este video usted debe tener una buena comprensión de cómo aislar los macrófagos peritoneales residentes del ratón, las células etiquetadas fluorescentemente, y las partículas opsonizadas.
