Este ensayo de imagen in vitro permite cuantificar el efecto de diferentes tratamientos celulares o diferentes genotipos sobre la fagocitosis microglial. Utilizando dos tipos de células que son relevantes para la enfermedad neurodegenerativa, utilizamos células muertas de neuroblastoma para la carga fagocítica, que se preparan de una manera que se puede ampliar de manera fácil y económica mediante grandes pantallas de imágenes de alto contenido. En un gabinete de seguridad biológica de clase 2, disociar SH-SY5Ys aspirando el medio.
Agregue 4 ml de tampón de disociación celular y retire el tampón inmediatamente para que quede menos de 1 ml como una película delgada que cubra las células. Incubar durante 2 a 3 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Luego a 10 ml de HBSS al matraz T-75.
Y pipetear el SH-SY5Ys en un tubo de centrífuga cónica de 15 ml. Centrifugar a 400xG durante 5 minutos. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 2 ml de medios tamponados HEPES libres de fenol en rojo, asegurándose de romper los grupos antes de la fijación.
Fije las células agregando 2 ml de formaldehído de 4% de potencia al tubo e incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación suave ocasional. Añadir 10 ml de HBSS al tubo. Luego, centrífuga a 1200xG durante 7 minutos.
Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 2 ml de fenenol libre de rojo HEPES buffered media. Cuente y elimine 1 millón de células HS-SY5Y en un tubo de baja unión a proteínas de 2 ml. Lleve el volumen total a 300 a 500 microlitros con medios tamponados HEPES libres de fenol rojo.
Luego caliente brevemente el tubo en un baño de agua de 37 grados Centígrados. Reconstituya el éster STP de colorante fluorescente rojo sensible al pH de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego agregue 12.5 microgramos de tinte por millón de células SH-SY5Y.
Mezclar suavemente moviendo el tubo. E incubar el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos, protegido de la luz. Agregue 1 ml de HBSS y centrífuga a 1200xG durante 7 minutos y 4 grados centígrados.
Deseche el sobrenadante. Y lavar con 2 ml de HBSS. Vuelva a suspender el pellet celular en medios macrófagos libres de fenol rojo a una concentración de 0.2 a 1.2 millones de células por ml, de modo que 50 microlitros contengan 10, 000 a 60, 000 células.
En un gabinete de seguridad biológica, prepare una solución de colorante reactivo permeante de células fluorescentes de color rojo profundo succinimidil éster reactivo en medios macrófagos. Agregue Hoechst 33342 y caliente la solución de trabajo a 37 grados Celsius en un baño de agua. Aspire el medio macrófago iPSC suavemente, pipeteando el sobrenadante celular con una pipeta multicanal en un depósito estéril.
Agregue 70 microlitros por podo de la solución de tinte a los macrófagos iPSC utilizando una pipeta multicanal. Incubar durante 1 hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Reparar tratamientos experimentales en medios macrófagos libres de fenol rojo.
Después de la incubación, aspire el medio macrófago iPSC muy suavemente con una pipeta multicanal y agregue 100 microlitros de HBSS por pozo. Retire inmediatamente el HBSS mediante pipeteo suave. Luego agregue 100 microlitros de medios de macrófagos libres de fenol en rojo, además de tratamientos experimentales en pozos separados.
Incubar durante 10 minutos a 1 hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Use una pipeta multicanal para agregar 50 microlitros del SH-SY5Ys etiquetado por pozo desde los lados de cada pozo en el borde del líquido. Luego incubar a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 3 a 5 horas.
Después de la incubación de la fagocitosis, aspire suavemente los sobrenadantes celulares mediante pipeteo con una pipeta multicanal y descarte. Lavar una vez con 100 microlitros de PBS. Luego fije las células agregando 100 microlitros de formaldehído de potencia al 2% e incubando durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Aspirar pozos y añadir 100 microlitros de PBS. Proceda directamente a la obtención de imágenes con el microscopio de alto contenido, o cúbralo con sellador de placas y lámina, y guarde la placa a 4 grados centígrados, hasta que sea necesario. Encienda el microscopio de imágenes de alto contenido y abra el software de captura de imágenes.
Cargue la placa de ensayo en el microscopio haciendo clic en el icono CARGAR" en la parte superior de la pantalla. Seleccione la pestaña SETUP". En los menús desplegables en el cuadro superior izquierdo, seleccione el tipo de placa apropiado.
La opción de enfoque automático: dos picos"El objetivo: 40x Agua, NA 1.1"Modo confocal" y Binning de 1. Enjuague el objetivo 40x Water antes de usarlo a través del menú de configuración. En el cuadro de selección de canales, use el icono más para agregar los canales DAPI, Alexa 647 y Alexa 568.
Establezca estos para medir en un solo plano de un micrómetro. Optimice los ajustes de tiempo y potencia para la eficiencia de tinción de la placa de ensayo. Asegúrese de que los canales no se midan simultáneamente, haciendo clic en la secuencia de canales para separar los canales.
En Navegación y diseño definido, seleccione los pozos de medición y seleccione de 9 a 12 campos por pozo. Durante la configuración, haga clic en un campo representativo en el mapa de la placa. Y verifique cada canal de medición a su vez para asegurarse de que la tinción esté presente y que las imágenes estén enfocadas ajustando el desplazamiento del canal.
Para cargar los datos en un servidor para su análisis remoto, haga clic en el cuadro "trabajos en línea" y el nombre de pantalla correspondiente. Guarde el protocolo de ensayo haciendo clic en el botón "guardar" y haga clic en la pestaña Ejecutar experimento en la parte superior. Nombre la placa del experimento, luego haga clic en inicio"Un ensayo de fagocitosis de vida de tiempo de célula viva mostró que con 10, 000 SH-SY5Ys por pozo, el número de partículas de fagocitasa por célula aumentó linealmente con el tiempo y fue inhibido en aproximadamente un 50% por citochalasina D.Con mayores cantidades de SH-SY5Ys por pozo, la fagocitosis exhibió una linealidad pobre, probablemente debido a una mala segmentación de iPSC, macrófagos y SH-SY5Ys en un campo de visión más concurrido.
Los siguientes resultados se obtuvieron mediante la realización de una imagen de alto contenido de células fijas, incluyendo esta imagen representativa de la fagocitosis. El aumento de la cantidad de SH-SY5Ys resultó en un mayor número de partículas fagocitadas por célula. El ensayo de fagocitosis se validó utilizando varios inhibidores de la fagocitosis.
La citochalasina D y la jasplaquinolida inhibieron significativamente la fagocitosis en un 91 y 90 por ciento, respectivamente. Y la bafilomicina A1 redujo significativamente la fagocitosis en un 31% cuando se preincuba durante 1 hora antes de la fagocitosis. La adición de anexina 5 recombinante redujo significativamente la fagocitosis en un 30% cuando se agregó a los pozos inmediatamente antes de la adición de SH-SY5Y.
Se ha confirmado que SH-SY5Ys expone fosfatidilserina utilizando una sonda fluorescente Annexin 5. Mientras que los SH-SY5Y vivos fueron negativos para la tinción de la anexina 5. Se probaron varias longitudes de duración de la fagocitosis, de 1 a 5 horas, utilizando la adición escalonada de carga fagocítica.
La longitud total de esta protollamada se puede acortar preparando la carga fagocítica y teñiendo los macrófagos iPSC en paralelo. Si desea hacer esto, calcule los tiempos con anticipación y use sus incubaciones para preparar soluciones para los pasos futuros.
