The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

NOTA: Todos los procedimientos de recogida de sangre que se describen en este método se realizaron de conformidad con la Declaración de Helsinki y aprobado por la UNT junta de revisión institucional (IRB) para los sujetos humanos. Todos los sujetos dieron su consentimiento por escrito para la recogida de sangre, que fue utilizado en el presente método para asegurar que eran aparentemente sanas, de peso corporal normal, y libre de la enfermedad. 1. Reactivo Fuente y Preparación <ol><li> Uso CD66b-APC (clon # G10F5; DF = 1: 50) y CD45-APCeFluor780 (clon # 2D1; DF = 1: 50) para este ensayo. NOTA: Antes del estudio, los anticuerpos CD45 y CD66b se titularon para determinar la dilución óptima que claramente resueltos granulocitos (CD45 + / + 66b) de otros leucocitos (CD45 + / 66b-) 11. Después de la adición del anticuerpo diluido para la tinción de la dilución final en el tubo era de 875. </li><li> Compra y deshielo stock S. aureus biopartículas etiquetado con pHrodo tinte rojo. Suspender a una concentración de 1 mg de biopartículas por ml en PBS estéril. Biopartículas diluidas alícuotas y almacenar congeladas a -20 ° C hasta su uso en el ensayo. </li><li> Disolver dihydroethidium (DHE), que se convierte en bromuro de etidio fluorescente de la presencia de radicales libres de oxígeno (es decir, la explosión oxidativa), en DMSO a una concentración final de 10 g / ml. </li><li> Mezclar N-etilmaleimida (utilizado para evitar la fagocitosis adicional tras el ensayo de duración de incubación indicado) con PBS estéril en una dilución 2 paso de 200 mg / ml y 17,5 mg / ml, respectivamente. En el ensayo, utilizar una concentración final de 15 mM. Al descongelar N-etilmaleimida, use un bloque de calor a 37 ° C, como la N-etilmaleimida no permanece en solución. </li><li> Después de la etapa de fijación final, utilizar 7AAD para teñir el ADN nuclear. Antes de la adición, se diluye el 7AAD 1:10 con PBS estéril. </li></ol> 2. La sangre recogida de muestras <ol><li> Pregunte sujetos a llegar al laboratorio después de una O / N rápido (&gt; 8 horas) y abstentidesde la actividad física (&gt; 12 h). </li><li> Después de limpiar la piel con una almohadilla con alcohol, inserte una aguja estéril de recolección de sangre en una vena periférica del brazo. </li><li> Recoger la sangre en tubos evacuados que se llenan comercialmente con heparina sódica. </li><li> Después de la recogida, aplique una venda adhesiva en el brazo del sujeto. </li><li> Invierta tubos de sangre para mezclar 10 veces y luego se coloca en un agitador hasta su análisis. </li></ol> 3. Ensayo de fagocitosis Técnica <ol><li> Biopartículas Descongelar S. aureus (RT), DHE (RT), y N-etil-maleimida (37 ° C). </li><li> Añadir 20 l de biopartículas S. aureus a 4 individuales 1,2 ml tubos mientras se trabaja en la campana estéril. </li><li> Añadir 40 l de DHE a cada tubo que contiene las biopartículas. </li><li> Golpear suavemente los tubos sobre la superficie del banco para recoger los reactivos en el fondo del tubo. </li><li> Añadir 100 L de sangre entera mixta a cada tubo que ha sido llenado con biopartículas y DHE. </li><li>Limpie el borde interior de los tubos con un aplicador con punta de algodón para eliminar la sangre contaminante. </li><li> Mezclar la sangre y los reactivos con una pipeta electrónica programada para mezclar la sangre y reactivos para tres ciclos después de la adición de la sangre. </li><li> Coloque los tubos de ensayo en un cubo de hielo y la cubierta para protegerla de la luz. </li><li> Incubar los tubos de ensayo de 10, 20, y 40 min. Iniciar con el tubo 40-min para asegurar que todos los tubos de ensayo terminan al mismo tiempo. </li><li> Descongele la N-etilmaleimida en 37 ° C baño de grano. </li><li> Pipetear 15 L de N-etilmaleimida (descrito anteriormente en 1.4) en cada tubo de ensayo, se incuba durante 30 min. </li><li> Pipetear 10 L de CD66b-APC y 10 L de CD45-APCeFluor780 anticuerpos diluidas (descritos anteriormente en el punto 1.1), se incuba durante 60 min. </li><li> Pipetear 750 L de solución de lisis CMB fix / RBC en cada tubo de ensayo, se incuba durante 60 min. </li><li> Se centrifuga (10 min a 400 xg) tubos de ensayo para recoger el sedimento celular. </li><li> Vacío aspirar la solución de lisis WBC / RBC solución, dejando un fl residualvolumen uid (100 L) por encima del sedimento celular. </li><li> Pipetear 10 L de solución diluida 7AAD (descrito más arriba en 1.5) y 50 L de PBS en cada tubo de ensayo. </li><li> Añadir una gota de bolas de calibración (~ 25 L) a cada tubo de ensayo, colocar tapones en los tubos de ensayo, tubos de envoltura en papel de aluminio y colocar en un refrigerador. </li><li> Cargue el tubo de la muestra en el flujo basado en imágenes citómetro y recoger un mínimo de 3.000 eventos de granulocitos utilizando parámetros predefinidos: Automuestreador, azul (488 nm; 60 mW), rojo (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) láser (Figura 1). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> Figura 1. Método y Plantilla de Adquisición. Las muestras fueron adquiridas en un flujo basado en imágenes citómetro (A). Durante la adquisición, gráficos de puntos de relación de aspecto brillante Campo vs. CD66b-APC se generaron a granulocitos separados de bolas de calibración de pinchos using INSPIRE v. 100.2.292.0 software (B). Un mínimo de 5.000 granulocitos fueron adquiridos para cada muestra utilizando un inyector automático, azul (488 nm; 60 mW), rojo (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) láser. Tenga en cuenta que una serie de histogramas están presentes durante la adquisición de los ajustes de monitor láser y otros aspectos de los datos coleccionar. Todos estos histogramas son opcionales y sólo es necesario si los procedimientos de operación estándar de laboratorio que requiere el control de calidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 4. Muestra Adquisición y Análisis <ol><li> Utilice el asistente de compensación software automatizado del software IDEAS aplicar una matriz de compensación a los archivos de imagen RAW (RIF) y crear archivos de compensar la imagen (CIF). </li><li> Cargar archivos CIF individuales en el software de IDEAS y generar las siguientes parcelas para identificar los subgrupos de granulocitos: </li&gt; <li> Establecer puertas iniciales para identificar las células que se consideraban en el enfoque mediante un histograma de brillantes RMS gradiente de campo (Figura 2A). Hacer esta determinación para cada muestra utilizando el control sin estimular como patrón de referencia. </li><li> Usar tramas secundarias a células singlete separados de los desechos y dobletes utilizando un gráfico de puntos de campo brillante relación de aspecto (relación de altura de las células frente a la anchura) vs. área de campo claro (Figura 2B). Hacer esta determinación para cada muestra utilizando el control sin estimular como patrón de referencia. </li><li> Una vez que se había identificado una población limpia de células, establecer un diagrama de puntos de CD45 vs. CD66b (Figura 2C) para identificar positivamente los granulocitos (CD45 + / + 66b). Crear una parcela hija (Figura 3) de intensidad detalle brillante para S. aureus (eje x) frente a la intensidad de detalle brillante para el estallido oxidativo (DHE, eje y) para identificar subconjuntos de granulocitos activados. Recoger brimágenes de campo ight en el canal 1 y 9, biopartículas en el canal 2, DHE en Channel 4, 7AAD en Canal 5, CD66b en el canal 11, y CD45 en el Canal 12. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> Figura 2. Plantilla de análisis. Esta cifra la serie de parcelas que se generaron para identificar las células que estaban en el foco (A), las células individuales (B), granulocitos (C). Se utilizaron parcelas adicionales para identificar los tres subgrupos de granulocitos activados vs. granulocitos inactivos. Se completó Todos los análisis de archivos de imagen adquiridos utilizando software IDEAS v.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<ol>
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R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis,+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms.">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. 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C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li><li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes.">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li><li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageStream+cytometry+extends+the+analysis+of+phagocytosis+and+oxidative.">ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).</li><li>Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Low+Concentration+Human+Serum+Cytokines+using+a+Millipore+High-Sensitivity+Milliplex+Assay.">Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+Yeast+Beta+Glucan+Supplementation+Increases+Salivary+IgA+and+Decreases+Cold/Flu+Symptomatic+Days+After+Intense+Exercise.">Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise.</a> J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain.">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El presente método representa un refinamiento de los métodos existentes para la evaluación de la función de los granulocitos mediante citometría de flujo 1,3,4,12-14. Los pasos críticos de este ensayo tienden a estar relacionados con la mezcla apropiada de la muestra de sangre con las biopartículas y DHE. Una mezcla incompleta dará lugar a resultados inexactos. Mientras que la mezcla completa es crítica, el método de mezcla debe ser suave en la naturaleza. Se sugiere que el mezclado se lleva a cabo utilizando una pipeta electrónica con una función de mezcla en lugar de un mezclador de vórtice. Otro paso crítico en el ensayo es para asegurar siempre no hay sangre contaminar el medio superior del tubo de ensayo. Esta sangre residual se puede eliminar con un aplicador con punta de algodón estéril. La eliminación completa es importante porque de no hacerlo, puede contaminar la preparación de ensayo final con los glóbulos rojos no lisados. Antes de utilizar este método de controles apropiados de compensación debe añadirse a controlar spectral solapamiento entre los reactivos utilizados para identificar los distintos aspectos de la función de los granulocitos. Para este método, los controles de compensación implican recoger muestras de sangre que se han sugerido la incubación de ensayo 40 min y después marcaje con un único marcador (es decir, E. coli, DHE, etc.). Después de etiquetado, eventos positivos individuales se recogen y una matriz de compensación se genera mediante un asistente automatizado en el software de análisis de IDEAS. Es crítico que si se utiliza este ensayo, controles de compensación adecuados se completan para garantizar el rendimiento del ensayo adecuado. El análisis se lleva a cabo mediante los asistentes buscador función y co-localización para identificar que la intensidad detalle brillante es la mejor variable para separar las poblaciones y también identificar cómo existe mucha superposición entre el estallido oxidativo y señales de fagocitosis. Específicamente, el uso de citometría de la imagen basada proporcionado la capacidad para segregar los granulocitos activados en tres subconjuntos. Tsu desglose subconjunto se determinó utilizando intensidad detalle brillante de la fagocitosis vs. estallido oxidativo. Además de examinar estas funciones celulares singulares, se identificaron las células que presentaban ambos eventos al mismo tiempo en la misma localización anatómica (co-localización). Los granulocitos que cayeron en el subconjunto de &quot;alto activo&quot; fueron el único fenotipo que demostró un co-localización consistente entre la fagocitosis y el estallido oxidativo. Esta identificación de subgrupos de granulocitos activados es la mayor área donde se necesita la solución de problemas. Es muy importante para un nuevo usuario tomar tiempo para entender el flujo de trabajo de proceso muestra en IDEAS y comprender la mecánica de conmutar los poblaciones de células mediante el componente de imagen. Otras modificaciones que un usuario puede tratar de hacer que incluyen la selección de tiempos de incubación de ensayo alternativos o adicionales. El método actual sugiere el uso de una duración de 10-40 min; sin embargo, dependiendo del modelo experimental en el que este método espara ser utilizado, puede ser necesario seleccionar duraciones de ensayo más largo. Tendría que ser evaluado de forma individual tal modificación. Además se determinó que la duración de la incubación ensayo tiene un efecto significativo en la aparición de los tres subconjuntos activados. El enfoque descrito en este informe representa una extensión de la información que se podría obtener con anterioridad respecto a la función de granulocitos 3,4,13,15. Otros laboratorios han demostrado la importancia de evaluar los cambios en la función de los granulocitos como parte de una evaluación exhaustiva de la inmunidad y la enfermedad 15-17. A pesar del potencial de este ensayo no es sin limitaciones. Una de las principales limitaciones es el costo y el tiempo asociado con la alta demanda de procesamiento de muestra de rendimiento. Cuando un diseño de estudio requiere un gran número de muestras en un día dado, estos pueden ser difíciles de procesar. El procesamiento se racionalizará el uso de pipetas y dispensadores electrónicos,pero éstas tienden a ser caros y no están necesariamente disponibles en todos los laboratorios. Nuestra área de investigación se centra en el estudio de cómo el ejercicio y los hábitos alimenticios influyen en la salud del sistema inmune y la función 6,8-10,18-20. Tales objetivos tienen implicaciones prácticas importantes para una variedad de áreas de la salud humana. Más allá del estudio de ejercicio y los efectos nutritivos el método de la fagocitosis demostrado en este manuscrito podría ser útil en otras áreas de la inmunología clínica donde el control de la función de fagocitosis es crítico para los resultados del tratamiento. El presente ensayo es el primero de muchos que ensayos inmunológicos con el potencial de ser reinventados tomando ventajas de la información única imagen que puede ser posible a partir de un flujo basado en imágenes citómetro.

Los granulocitos representan un componente del sistema inmune innato del cuerpo, que proporciona la primera línea de defensa contra los antígenos invasores. Los métodos anteriores para evaluar la función de los granulocitos se centraron en la capacidad de fagocitosis o la explosión oxidativa usando métodos separados, por lo que es difícil determinar colectivamente cómo han cambiado los granulocitos 1-4. Los avances en el campo de la citometría de flujo han dado lugar a la producción de instrumentos de laboratorio capaces de alta resolución, formación de imágenes multi-color de las celdas de una manera de alto rendimiento 5. La capacidad de combinar formación de imágenes con el flujo tradicional representa citometría de un avance que proporciona la plataforma tecnológica necesaria para innovar dentro de citometría de flujo existente métodos y extraer nueva información sobre el sistema inmune. Durante los últimos diez años, nuestro laboratorio, entre otros, se ha enfocado agudamente en el efecto de varios tratamientos Patte nutricional y de ejerciciorns sobre la función inmune innata 6-9. El método se demuestra en este manuscrito tiene implicaciones prácticas en el campo de la inmunología clínica. El presente método aprovecha el poder de la imagen basada en la citometría de flujo para medir simultáneamente la fagocitosis de partículas bacterianas y explosión oxidativa. Con este enfoque, uno es capaz de separar los granulocitos activados mediante variables proporcionadas por la parte basada en imágenes de los análisis. Estos subgrupos fueron sólo identificable después de evaluar las imágenes celulares en los granulocitos individuales. Además tiempo de incubación de ensayo afectó a la transición entre los tres subconjuntos de activación 10. Por lo tanto, es plausible que el uso de múltiples tiempos de incubación puede permitir a un método para examinar el cambio en la función de granulocitos después de un tratamiento experimental específico. El propósito de este manuscrito era demostrar un método de evaluación de función de los granulocitos mediante el uso de la imagen basada en citometría de flujo para medir simultáneamente la fagocitosis con oxidative estalló.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacutainers</td>
			<td style="width:125px;">BD Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">WBC Fixative / RBC Lysis solution</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">00-5333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD66b-APC</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone G10F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45-APCeFluor780</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone 2D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">s.aureus bioparticles</td>
			<td style="width:125px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dihydroethidium</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D7008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-ethylmalemide</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7AAD</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hematology Analyzer</td>
			<td style="width:125px;">Mindray</td>
			<td style="width:119px;">BC-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-channel pipet</td>
			<td style="width:125px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">ViaFlo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead Bath Incubator</td>
			<td style="width:125px;">LabArmour</td>
			<td style="width:119px;">BeadBath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis FlowSight</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">INSPIRE Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis INSPIRE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IDEAS Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis IDEAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">X-Pierce Piercable Plate Sealer</td>
			<td style="width:125px;">Excel Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X-Pierce</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dell Precision Workstation</td>
			<td style="width:125px;">Dell Computers</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td>Used for IDEAS analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

El uso de la imagen basada en la citometría de flujo nos permitió separar una población homogénea de granulocitos activados en tres subgrupos diferentes de activación (Figura 3). En este método, la forma más eficaz para resolver los tres subconjuntos de activación es por el trazado de la intensidad detalle brillante para la fagocitosis (S. aureus) vs. estallido oxidativo (DHE) (Figura 3; Figura 4). También, el uso del asistente de co-localización en software IDEAS permitirá la cuantificación de la presencia simultánea de la fagocitosis y el estallido oxidativo, que es un signo distintivo de granulocitos altamente activados. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> Figura 3. Identificación de activado subconjuntos de granulocitos. Después de la identificación de los granulocitos utilizando marcadores de la superficie celular (CD45 + / 66b +), una parcela hija se generó con brillante detalle intensidad de la fagocitosis vs. intensidad detalle brillante para el estallido oxidativo. Con este enfoque, el porcentaje de inactivos (púrpura), bajo activo (rojo, A), moderado-activo (azul, B) y (C) de color amarillo, granulocitos-altos activo se determinó. Esta técnica gating también se utilizó para evaluar el efecto del tiempo de incubación del ensayo sobre la abundancia relativa de los diversos subconjuntos de granulocitos activados. El mayor porcentaje de granulocitos &quot;de alto activo&quot; estaba presente después de la incubación de 40 min. Se completó Todos los análisis de archivos de imagen adquiridos utilizando software IDEAS v.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Además de demostrar la presencia de tres subconjuntos distintos de los granulocitos activados, se demostró que el tiempo de incubación del ensayo influyó en la abundancia relativa de cada subconjunto granulocitos activado. Específicamente, el 40 min incubation resultó en el mayor porcentaje de granulocitos &quot;de alto activa&quot;. Mediante la inclusión de al menos tres duraciones de incubación de ensayo puede ser posible para determinar cómo un tratamiento clínico dado altera el estado de activación temporal de los granulocitos. Este es el primer método publicado usando la imagen basada en citometría de flujo para identificar diferentes subconjuntos de granulocitos activados como una función de las mediciones simultáneas de la fagocitosis y el estallido oxidativo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> Figura 4. Imágenes representativas de marcadores celulares. Una galería de imágenes de células clasificadas como de alta actividad (A), moderado-activo (B), y baja actividad (C) se presenta en esta figura. Biopartículas S. aureus son en CH03 , estallido oxidativo está en CH04, 7AAD para el núcleo está en CH05, dispersión lateral está en CH06, CD66b está enCh11, y CD45 es en Salida C12. Además, se muestra una imagen de combinación co-localizada de la fagocitosis (CH03) vs. explosión oxidativa (CH04). Las áreas de color amarillo en la imagen de combinación denotan que la fagocitosis y oxidativo ráfaga se están produciendo en el mismo espacio anatómico al mismo tiempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro at JoVE.com

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Imagen basada en Citometría de Flujo Técnica para evaluar los cambios en función de los granulocitos<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.3K vistas.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Video: Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

El uso de la citometría de flujo para evaluar el estado de la cromatina en las células T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Una novela In Vitro de la herida curativa ensayo para evaluar la migración de la célula

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

Una citometría de flujo Simple basado en análisis para determinar In Vitro anticuerpo dependiente del realce del Virus del Dengue usando suero convaleciente Zika Virus

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single cell level and statistical image analysis at a populational level. To overcome this difficulty, we used imaging flow cytometry and transcriptomic profiling (RNA-seq) to determine altered subcellular localization of the cluster of differentiation 1d protein (CD1d) associated with impaired endocytic gene expression in human dendritic cells (DCs), which were exposed to the common lipophilic air pollutant benzo[a]pyrene. The colocalization of CD1d and endocytic marker Lamp1 proteins from thousands of cell images captured with imaging flow cytometry was analyzed using IDEAS and ImageJ-Fiji programs. Numerous cellular images with co-stained CD1d and Lamp1 proteins were visualized after gating on CD1d+Lamp1+ DCs using IDEAS. The enhanced CD1d and Lamp1 colocalization upon BaP exposure was further demonstrated using thresholded scatterplots, tested with Mander&#39;s coefficients for co-localized intensity, and plotted based on the percentage of co-localized areas using ImageJ-Fiji. Our data provide an advantageous instrumental and bioinformatic approach to measure protein colocalization at both single and populational cellular levels, supporting an impaired functional outcome of transcriptomic alteration in pollutant-exposed human DCs.

Imaging flow cytometry provides an ideal approach to detect the morphological and functional alteration of cells at individual and populational levels. Disrupted endocytic function for lipid antigen presentation in pollutant-exposed human dendritic cells was demonstrated with a combined transcriptomic profiling of gene expression and morphological demonstration of protein trafficking.

Integrar imágenes de citometría de flujo y transcriptómicos perfilado para evaluar trata de CD1d endocíticas alterada

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...