The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

NOTA: Todos os procedimentos de coleta de sangue descritos neste método foram realizados em conformidade com a Declaração de Helsinki e aprovado pelo Comitê de Ética UNT (IRB) para seres humanos. Todos os indivíduos deram consentimento por escrito para a recolha de sangue, o qual foi usado no presente método para garantir que eles eram aparentemente saudáveis, de peso corporal normal, e livre de doença. 1. Reagente Fonte e Planejamento <ol><li> Uso CD66b-APC (clone # G10F5; DF = 1: 50) e CD45-APCeFluor780 (clone 2D1 #; DF = 1: 50) para este ensaio. NOTA: Antes do estudo, os anticorpos CD45 e CD66b foram titulados para determinar a diluição óptima que granulócitos claramente resolvidos (CD45 + / + 66b) a partir de outros leucócitos (CD45 + / 66b-) 11. Após a adição do anticorpo diluído para a coloração da diluição final no tubo foi de 875. </li><li> Compra e descongelar estoque S. aureus biopartículas marcado com corante vermelho pHrodo. Suspender a uma concentração de 1 mg de biopartículas por ml em PBS estéril. Biopartículas diluídas e alíquotas armazenamento congelado a -20 ° C até ser utilizada no ensaio. </li><li> Dissolver dihydroethidium (DHE), a qual é convertida em brometo de etídio fluorescente a presença de radicais livres de oxigénio (isto é, o rebentamento oxidativo), em DMSO a uma concentração final de 10 g / ml. </li><li> Misturar N-etilmaleimida (utilizada para impedir a fagocitose adicional na sequência da duração da incubação ensaio especificado) com PBS estéril em uma diluição em 2 passos de 200 mg / ml e 17,5 mg / ml, respectivamente. No ensaio, usar uma concentração final de 15 mM. Quando o descongelamento N-etilmaleimida, utilizar uma temperatura de 37 ° C bloco de calor, tal como a N-etilmaleimida não permanece em solução. </li><li> Após o passo final da fixação, utilizar 7AAD para corar o ADN nuclear. Antes da adição, diluir estoque 7AAD 1:10 com PBS estéril. </li></ol> 2. Coleta de Amostras de sangue <ol><li> Peça sujeitos a chegar ao laboratório após uma O / N rápido (&gt; 8 h) e abstentino de actividade física (&gt; 12 h). </li><li> Após a limpeza da pele com uma compressa embebida em álcool prep, inserir uma agulha estéril de coleta de sangue em uma veia periférica do braço. </li><li> Recolha de sangue em tubos de vácuo que são comercialmente cheios de heparina sódica. </li><li> Após a coleta, aplicar uma bandagem adesiva para o braço do sujeito. </li><li> Inverta tubos de sangue para misturar 10 vezes e, em seguida, colocar em uma cadeira de balanço até a análise. </li></ol> Técnica 3. A fagocitose Assay <ol><li> Descongelar biopartículas S.aureus (RT), de DHE (RT), e N-etilmaleimida (37 ° C). </li><li> Adicionar 20 L de biopartículas S.aureus 4 individuais 1,2 ml tubos, enquanto trabalhava no capô estéril. </li><li> Adicionar 40 L de DHE a cada tubo contendo as biopartículas. </li><li> Bater levemente os tubos sobre a superfície do banco para recolher os reagentes no fundo do tubo. </li><li> Adicionar 100 L de sangue total misturado a cada tubo, que foi preenchido com biopartículas e DHE. </li><li>Limpe a borda interior dos tubos com um aplicador de algodão cotado para remover qualquer vestígio de sangue contaminando. </li><li> Misturar o sangue e os reagentes com uma pipeta electrónica criada para misturar o sangue e reagentes para três ciclos, após a adição do sangue. </li><li> Coloque tubos de ensaio em um balde de gelo e tampa para proteger da luz. </li><li> Incubar tubos de ensaio durante 10, 20 e 40 min. Comece com o tubo 40 min para assegurar que todos os tubos de ensaio terminar ao mesmo tempo. </li><li> Thaw N-ethylmaleimide em 37 ° C banho de pérola. </li><li> Pipetar 15 L de N-etilmaleimida (descrito acima em 1.4) a cada tubo de ensaio, incubar durante 30 min. </li><li> Pipetar 10 l de CD66b-APC e 10 L de CD45-APCeFluor780 anticorpos diluídos (descritos acima em 1.1), incubar durante 60 min. </li><li> Pipetar 750 L de solução de lise correcção WBC / RBC em cada tubo de ensaio, incubar durante 60 min. </li><li> Centrífuga (10 min a 400 xg) tubos de ensaio para recolher o sedimento celular. </li><li> Vacuum aspirar a solução lise WBC / fix RBC, deixando um residual flvolume de uid (100 L) por cima do sedimento celular. </li><li> Pipetar 10 l de solução diluída 7AAD (descrito acima em 1.5) e 50? L de PBS em cada tubo de ensaio. </li><li> Adicione uma gota de contas de calibração (~ 25 L) para cada tubo de ensaio, coloque materiais em tubos de ensaio, tubos embrulhe em papel alumínio e coloque no frigorífico. </li><li> Coloque o tubo de amostra no fluxo baseado em imagem citômetro e coletar um mínimo de 3.000 eventos de granulócitos usando parâmetros pré-definidos: Autosampler, azul (488 nm, 60 mW), vermelho (640 nm, 100 mW),, SSC (785 nm; 8,5 mW) lasers (Figura 1). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> Figura 1. Aquisição Method &amp; Template. As amostras foram adquiridas em um fluxo com base em imagem citômetro (A). Durante a aquisição, gráficos de pontos de Campo brilhante Proporção vs. CD66b-APC foram gerados para granulócitos separados dos grânulos de calibração perfurantes usin100.2.292.0 software g INSPIRE v. (B). Um mínimo de 5.000 granulócitos foram adquiridos para cada amostra utilizando um amostrador automático, azul (488 nm, 60 mW), vermelho (640 nm, 100 mW),, SSC (785 nm; 8,5 mW) lasers. Por favor, note que um número de histogramas estão presentes durante a aquisição para monitorar as configurações de laser e outros aspectos da coleta de dados. Todos esses histogramas são opcionais e só precisava se os procedimentos operacionais padrão de laboratório exige-los como controle de qualidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 4. Amostra de Aquisição e Análise <ol><li> Use o assistente de compensação software automatizado do software IDEAS para aplicar uma matriz de compensação para arquivos de imagem RAW (RIF) e criar compensar arquivos clonados (CIF). </li><li> Carregar arquivos CIF individuais em software idéias e gerar os seguintes parcelas para identificar os subconjuntos de granulócitos: </li&gt; <li> Estabelecer portões iniciais para identificar as células que foram consideradas em foco usando um histograma para brilhantes RMS gradiente de campo (Figura 2A). Fazer essa determinação para cada amostra usando o controle unstimulated como padrão de referência. </li><li> Use parcelas secundárias às células singleto separadas de detritos e dupletos, utilizando um gráfico de pontos de campo brilhante relação de aspecto (relação entre a altura da célula versus largura) x área do campo brilhante (Figura 2B). Fazer essa determinação para cada amostra usando o controle unstimulated como padrão de referência. </li><li> Uma vez que uma população de células limpo havia sido identificado, estabelecer um gráfico de pontos de CD45 vs. CD66b (Figura 2C) para identificar positivamente granulócitos (CD45 + / 66b +). Criar um enredo filha (Figura 3) de intensidade detalhe brilhante para S. aureus (eixo x) vs. detalhe intensidade luminosa para o burst oxidativo (, eixo y-DHE) para identificar subconjuntos de granulócitos activados. Recolha brimagens de campo ight no canal 1 e 9, biopartículas no canal 2, DHE no Channel 4, 7AAD no Canal 5, CD66b no Canal 11 e CD45 no Canal 12. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> Figura 2. Modelo de Análise. Este número da série de tramas que foram gerados para identificar as células que estiveram em foco (A), células individuais (B), de granulócitos (C). Parcelas adicionais foram utilizados para identificar os três subconjuntos de granulócitos activados granulócitos vs. inactivos. Toda a análise de arquivos de imagem adquiridos foi completada com software IDEAS v.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li><li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes.">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li><li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. 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The authors have nothing to disclose.

O presente método representa um refinamento dos métodos existentes para a avaliação da função de granulócitos utilizando citometria de fluxo 1,3,4,12-14. Os passos críticos deste ensaio tendem a ser relacionada com uma mistura apropriada da amostra de sangue com as biopartículas e DHE. A mistura incompleta irá resultar em resultados imprecisos. Enquanto a mistura completa é crítico, o método de mistura deve ser de natureza suave. Sugere-se que a mistura ser realizada utilizando uma pipeta electrónica com uma função de mistura, em vez de um misturador de vórtice. Outro passo crítico no ensaio é para assegurar sempre que não há contaminação do sangue da metade superior do tubo de ensaio. Este sangue residual pode ser removido usando um aplicador com ponta de algodão estéril. A remoção completa é importante porque não fazer isso pode contaminar a preparação final do ensaio com hemácias lisadas-un. Antes de usar este método controles de compensação apropriados devem ser adicionados para controlar spectral sobreposição entre os reagentes utilizados para identificar os vários aspectos da função de granulócitos. Por este método, os controles de compensação envolvem colher amostras de sangue que foram sugeridos no ensaio de incubação de 40 min e, em seguida, a rotulagem com um único marcador (por exemplo, E. coli, a DHE, etc). Após a marcação, eventos positivos individuais são recolhidos e uma matriz de compensação é gerado utilizando um assistente automatizado no software de análise de idéias. É fundamental que se este ensaio é utilizado, os controles de compensação apropriados sejam concluídas para garantir o desempenho adequado do ensaio. A análise é realizada usando o recurso de localizar e co-localização assistentes para identificar esse brilhante intensidade detalhe é a melhor variável para separar as populações e também identificar como existe muita sobreposição entre burst oxidativo e sinais de fagocitose. Especificamente, a utilização de citometria de imagem baseada em fornecida a capacidade de segregar granulócitos activados em três subconjuntos. Tseu colapso subconjunto foi determinada utilizando intensidade detalhe brilhante de fagocitose vs. burst oxidativo. Além de examinar estas funções celulares singulares, foram identificadas as células que exibiram dois eventos ao mesmo tempo no mesmo local anatómico (co-localização). Granulócitos que caíram no subconjunto &quot;high-ativo&quot; foram o único fenótipo que demonstrou co-localização consistente entre fagocitose e burst oxidativo. Esta identificação de subconjuntos de granulócitos ativados é a maior área em que é necessária solução de problemas. É muito importante para um novo usuário a tomar tempo para entender o fluxo de trabalho processo de amostra em idéias e entender a mecânica de modular os populações de células usando o componente de imagem. Outras modificações que um usuário pode procuram fazer incluem a seleção de vezes ensaio de incubação alternativas ou adicionais. O actual método sugere a utilização de durações de 10-40 min; No entanto, dependendo do modelo experimental em que este método épara ser utilizado, pode ser necessário seleccionar as durações mais ensaio. Tal modificação teria de ser avaliado numa base individual. Além disso, foi determinado que a duração do ensaio de incubação tem um efeito significativo sobre a aparência dos três subconjuntos activados. A abordagem descrita neste relatório representa uma extensão do que a informação poderia ser obtido previamente sobre a função de granulócitos 3,4,13,15. Outros laboratórios têm demonstrado a importância de avaliar as alterações na função de granulócitos como parte de uma avaliação abrangente da imunidade e doenças 15-17. Apesar do potencial de este ensaio não é sem limitações. Uma das limitações principais é o custo e tempo de demanda associadas com o processamento elevado de amostras. Quando um desenho de estudo requer um grande número de amostras num determinado dia, estes podem ser difíceis de processar. Processing é simplificada pela utilização de pipetas eletrônicos e dispensadores,mas estes tendem a ser caros e não estão necessariamente disponíveis em cada laboratório. Nossa área de pesquisa concentra-se em um estudo de como o exercício e hábitos alimentares influenciam a saúde do sistema imunológico e funcionar 6,8-10,18-20. Estes objectivos têm implicações práticas importantes para uma variedade de áreas da saúde humana. Além do estudo dos efeitos do exercício e nutricionais o método fagocitose demonstrado neste manuscrito poderia ser útil em outras áreas da imunologia clínica onde a monitorização da função de fagocitose é fundamental para os resultados do tratamento. O presente ensaio é o primeiro de muitos ensaios imunológicos, que, com o potencial de ser re-inventado ao tirar vantagem da informação de imagem única que pode ser possível a partir de um fluxo com base em imagem citómetro.

Granulócitos representam um componente de sistema imune inata do corpo, o que proporciona a primeira linha de defesa contra antigénios invasores. Os métodos anteriores para avaliar a função de granulócitos focado em capacidade de fagocitose ou burst oxidativo utilizando métodos diferentes, o que torna difícil determinar coletivamente como granulócitos mudaram 1-4. Os avanços no campo da citometria de fluxo ter resultado na produção de instrumentos de bancada capazes de alta-resolução, de imagens multi-cor das células de uma forma de alto rendimento 5. A capacidade de combinar imagens com o fluxo tradicional representa citometria de um avanço que fornece a plataforma tecnológica necessária para inovar dentro de citometria de fluxo existente métodos e extrair novas informações sobre o sistema imunológico. Ao longo dos últimos dez anos, o nosso laboratório, entre outros, tem sido intensamente focada sobre o efeito de vários tratamentos patte nutricional e exercíciorns sobre a função imunológica inata 6-9. O método demonstrado neste manuscrito tem implicações práticas no campo da imunologia clínica. O presente método aproveita o poder da citometria de fluxo baseado em imagem para medir simultaneamente a fagocitose de partículas bacterianas e burst oxidativo. Usando essa abordagem, um é capaz de separar os granulócitos ativados utilizando variáveis ​​fornecidas pela parte baseada na imagem da análise. Estes subconjuntos eram identificáveis ​​apenas depois de avaliar as imagens celulares nos granulócitos individuais. Além disso o tempo de incubação do ensaio afectada a transição entre as três subconjuntos de activação 10. Assim, é plausível que o uso de múltiplos tempos de incubação pode permitir um método para testar a mudança na função de granulócitos na sequência de um tratamento experimental específica. O objetivo deste artigo foi demonstrar um método de avaliação da função de granulócitos usando citometria de fluxo baseado em imagem para medir simultaneamente a fagocitose com oxidative estourar.

<table><tbody><tr><td>Vacutainers</td><td>BD Life Sciences</td><td></td><td>used for blood collection</td></tr><tr><td>WBC Fixative / RBC Lysis solution</td><td>eBioscience</td><td>00-5333-57</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-APC</td><td>eBioscience</td><td>clone G10F5</td><td></td></tr><tr><td>CD45-APCeFluor780</td><td>eBioscience</td><td>clone 2D1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;S. aureus&lt;/i&gt; bioparticles</td><td>Life Technologies</td><td>A10010</td><td></td></tr><tr><td>dihydroethidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmalemide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematology Analyzer</td><td>Mindray</td><td>BC-3200</td><td></td></tr><tr><td>96-channel pipet</td><td>Integra Biosciences</td><td>ViaFlo</td><td></td></tr><tr><td>Bead Bath Incubator</td><td>LabArmour</td><td>BeadBath</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis FlowSight</td><td></td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis INSPIRE</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis IDEAS</td><td></td></tr><tr><td>X-Pierce Piercable Plate Sealer</td><td>Excel Scientific, Inc.</td><td>X-Pierce</td><td></td></tr><tr><td>Dell Precision Workstation</td><td>Dell Computers</td><td>Various</td><td>Used for IDEAS analysis</td></tr></tbody></table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Usando citometria de fluxo baseado em imagem permitiu separar uma população homogênea de granulócitos ativados em três subgrupos de ativação diferentes (Figura 3). Neste método, a forma mais eficaz de resolver as três subconjuntos de activação é brilhante através da representação gráfica da intensidade detalhe para a fagocitose (S. aureus) versus o burst oxidativo (DHE) (Figura 3; Figura 4). Além disso, o uso do assistente de co-localização de software ideias irão permitir a quantificação da presença simultânea de fagocitose e burst oxidativo, que é um sinal típico de granulócitos altamente activadas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> Figura 3. Identificação da Contato granulócitos Subconjuntos. Após a identificação dos granulócitos utilizando marcadores de superfície celular (CD45 + / 66b +), um enredo filha foi gerado com brilhante detalhe intensidade para a fagocitose vs. intensidade detalhe brilhante para burst oxidativo. Usando essa abordagem, o percentual de inativos (roxo), low-ativo (vermelho, A), moderado-ativo (azul, B) e (C) amarelo, granulócitos altos-ativo foi determinada. Esta técnica de propagação também foi usada para avaliar o efeito do tempo de incubação do ensaio sobre a abundância relativa dos diferentes subconjuntos de granulócitos activados. O maior percentual de granulócitos &quot;high-ativo&quot; estava presente após a 40 min de incubação. Toda a análise de arquivos de imagem adquiridos foi completada com software IDEAS v.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Além de demonstrar a presença de três subconjuntos distintos de granulócitos activados, demonstrou-se que o tempo de incubação do ensaio influenciaram a abundância relativa de cada subconjunto granulócitos activados. Especificamente, a 40 min incubation resultou no maior percentual de granulócitos &quot;high-activa&quot;. Com a inclusão de, pelo menos, três períodos de incubação do ensaio que pode ser possível determinar a forma como um determinado tratamento clínico altera o estado de activação temporal dos granulócitos. Este é o primeiro método publicado pela citometria de fluxo com base em imagem para identificar diferentes subconjuntos de granulócitos activados como uma função de medições simultâneas de fagocitose e burst oxidativo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> Figura 4. Imagens representativos de marcadores celulares. Uma galeria de imagens de células classificados como de alto-ativa (A), moderado-ativa (B), e de baixo ativo (C) é apresentado nesta figura. Biopartículas S.aureus estão em CH03 , burst oxidativo está em CH04, 7AAD para o núcleo está em CH05, dispersão lateral está em CH06, CD66b está emCH11 e CH12 em CD45 é. Além disso, uma imagem de fusão co-localizada de fagocitose (CH03) vs. burst oxidativo (CH04) é exibido. Áreas de amarelo na imagem merge denotar que a fagocitose e oxidativa explosão estão ocorrendo no mesmo espaço anatômico ao mesmo tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.4K visualizações.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

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Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Imunologia e Infecção

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo Atividade Burst no Sangue

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Neurociência

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling contributes to the progression of many diseases. The ligand/receptor pair CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) has raised significant clinical interest, for instance as a potential target for the treatment of cancer and inflammatory diseases. Small molecules as well as therapeutic antibodies that specifically target CXCR4 and inhibit the receptor&#39;s function are therefore considered to be valuable pharmacological tools. Here, a flow cytometry-based cellular assay that allows identification of compounds (e.g., small molecules) that abrogate CXCL12 binding to CXCR4, is described. Essentially, the assay relies on the competition for receptor binding between a fixed amount of fluorescently labeled CXCL12, the natural chemokine agonist for CXCR4, and unlabeled compounds. Hence, the undesirable use of radioactively labeled probes is avoided in this assay. In addition, living cells are used as the source of receptor (CXCR4) instead of cell membrane preparations. This allows easy adaptation of the assay to a plate format, which increases the throughput. This assay has been shown to be a valuable generic drug discovery assay to identify CXCR4-targeting compounds. The protocol can likely be adapted to other GPCRs, at least if fluorescently labeled ligands are available or can be generated. Prior knowledge concerning the intracellular signaling pathways that are induced upon activation of these GPCRs, is not required.

A flow cytometry-based cellular binding assay is described that is primarily used as a screening tool to identify compounds that inhibit the binding of a fluorescently labeled CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) to the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para identificar compostos que interrompem a ligação do ligante de Chemokine fluorescente-etiquetadas CXC 12 a CXC Chemokine Receptor 4

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

Biologia

Analyzing Basophil Activation in the Presence of a Test Allergen using Flow Cytometry

Source: Do&#241;a, I. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62600">Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis.</a> J. Vis. Exp. (2021)
In this video, we demonstrate the test to evaluate basophil activation in the presence of a test allergen using flow cytometry.

Analisando a ativação de basófilos na presença de um alérgeno de teste usando citometria de fluxo

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Sample preparation

	Collect ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Imunodiagnóstico

Cellular Immunodiagnostics

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

Source: Murinello, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54677">Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

Medindo a captação microglial de partículas fluorescentes entregues por via intravítrea usando citometria de fluxo

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos

Resumo

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