Este trabajo fue apoyado por la Fundación Instituto Italiano de Tecnología. Los autores desean agradecer a Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Alemania) para el patrocinio de este manuscrito, el doctor Paolo Petrucciani (Departamento de Inmuno-hematología y Servicio de Transfusión del Hospital Lotti Pontedera, Pisa, Italia) para proporcionar capas leucocitarias humanos y Prof. Massimo Pasqualetti (Departamento de Biología - Unidad de Biología Celular y del Desarrollo de la Universidad de Pisa, Pisa, Italia) para alojar la colonia de ratones.

ÉTICA DE MOTIVOS Se procesaron muestras humanas y animales siguiendo las directrices del Ministerio de Salud de Italia, la ley 116/92 y la Directiva del Consejo Europeo de Comunidades 86/609/CEE. 1. Monocitos culturas celulares <ol><li> Cultura humanos células THP-1 en matraces T-75 que contenían medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero humano, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina, 0,05 mM β-mercaptoetanol a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Culturas Dividir cuando confluente (cada 3-5 días). </li></ol> 2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de Buffy Coats <ol><li> Antes de iniciar el protocolo de aislamiento, preparar una solución de tampón fosfato salino (PBS) de pH 7,2, 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA), la adición de 5 ml de BSA de la solución a 95 ml de disolución tampón de enjuague (1: 20 de dilución). Desgasificar el búfer y mantenerlo frío (2-8° C). IMPORTANTE: Si no se desgasificar el tampón puede resultar en menos de óptima resultados porque las burbujas pueden bloquear la columna de la aislamiento (véase el paso 3.2). Nota: Anticoagulante fórmula-A citrato dextrosa (ACD-A) o citrato fosfato dextrosa (CPD) se puede utilizar alternativamente. Por el contrario, otras proteínas de albúmina o sueros de otras especies pueden sustituir de BSA. No use tampones que contienen Ca 2 + o Mg 2 +. </li><li> Obtener buffy abrigos de donantes sanos (edad 20-60 años). </li><li> Preparar los tubos de 50 ml cónicos para la densidad de centrifugación en gradiente. Determinar el número de tubos requeridos para el procesamiento de la sangre (cada tubo puede procesar 35 ml de sangre diluida) y añadir 15 ml de Ficoll-Paque a cada tubo de vacío. </li><li> Diluir 8 ml de sangre con 24 ml de solución de PBS / BSA / EDTA (1:04 dilución). </li><li> Capa cuidadosamente la solución diluida en la parte superior de Ficoll-Paque (densidad = 1,077 g / ml) en cada uno de los tubos de 50 ml cónicos. No mezclela sangre y de Ficoll-Paque. IMPORTANTE: Para evitar la mezcla de la sangre y de Ficoll-Paque, mantenga el tubo en un ángulo de 45 ° y la capa de la mezcla de la sangre lentamente. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 30 min a 4 ° C. Las células mononucleares (MNC) permanecerán en la interfase de plasma de Ficoll-Paque, mientras que los granulocitos y los eritrocitos de sedimentos debido a la mayor densidad en la presión osmótica de Ficoll-Paque. </li><li> Transferencia de las células en interfase (células mononucleares de sangre periférica, PBMC) a un nuevo tubo de 50 ml llena con PBS / BSA / EDTA y se centrifuga a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Lavar la pella dos veces con PBS / BSA / EDTA para eliminar las plaquetas. Girar a 200 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Cultivar las células en RPMI-1640 completo con un 10% de suero humano y antibióticos o proceder a la purificación de monocitos. </li></ol> 3. Purificación de los monocitos primaria a partir de PBMCs <ol><li> Aislar los monocitos de PBMC por separación de perlas magnéticas usando Humun kit de aislamiento de monocitos Pan: <ol><li> Pasar las células a través de una malla de 30 micras de nylon (filtros separación previa, 30 m) para eliminar los posibles grupos de células. </li><li> Determinar el número de células utilizando un hemocitómetro. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Aspirar el sobrenadante por completo. </li><li> Sedimento celular Resuspender en 30 l de tampón de PBS / EDTA / BSA por 10 7 células totales. </li><li> Añadir 10 l FcR reactivo de bloqueo por 10 7 células totales. </li><li> Añadir 10 l de cóctel de biotina-anticuerpo por 10 7 células totales. </li><li> Mezclar bien e incubar durante 5 minutos a 2-8 ° C. </li><li> Añadir 30 l de tampón por 10 7 células totales. </li><li> Añadir 20 l de anti-biotina microperlas por 10 7 células totales. </li><li> Mezclar bien e incubar durante 10 minutos a 2-8 ° C. </li><li> Resuspender hasta 10 8 células en 500 l de tampón PBS / EDTA / BSA. </li></ol></li><li> Separ magnéticaación <ol><li> De acuerdo con el número total de células, elija una columna MACS apropiado y MACS Separador (ver columna MACS hoja de datos). </li><li> Colocar la columna en el campo magnético del MACS separador. </li><li> Preparar la columna por lavado con la cantidad apropiada de tampón PBS / EDTA / BSA (MS columnas: 500 l; columnas LS: 3 ml). Nota: Las columnas son &quot;parar flujo&quot; y no se secan. </li><li> Aplicar la suspensión celular en la columna. Recoger de flujo continuo que contiene células no marcadas, que representa la fracción de monocitos enriquecidos. </li><li> Lavar la columna 3 veces con tampón PBS / EDTA / BSA (500 l para la EM y 3 ml de LS por lavado). </li><li> Recoger las células no marcadas que atraviesan, en representación de los monocitos enriquecidos, y añadir al flujo a través de la sección 3.2.4. Nota: Lavar la columna mediante la adición de alícuotas de tampón PBS / EDTA / BSA solamente cuando el depósito columna está vacía. </li><li> (Opcional) Quite la columna de laseparador y colocarlo en un tubo de recogida adecuado. Pipetear la memoria intermedia en la columna (MS columnas: 1 ml, esbeltas columnas LS: 5 ml). Inmediatamente enjuagar las células marcadas magnéticamente nonmonocyte empujando firmemente el émbolo en la columna. </li><li> Cultura purificó monocitos en RPMI-1640 completo con 10% de suero humano y antibióticos. </li></ol></li></ol> 4. Purificación de los monocitos primarios de sangre entera <ol><li> Purificar los monocitos de la sangre entera usando el kit de aislamiento de monocitos de sangre entera siguiendo las instrucciones del fabricante. </li></ol> 5. Internalización de nanopartículas en leucocitos de sangre y se purificaron monocitos <ol><li> Plate 5 x 10 5 células / ml (1 ml / pocillo) de las PBMCs aisladas o los monocitos CD14 positivos purificados en una placa de 12 pocillos. </li><li> Vortex FITC-SiO2 nanopartículas de solución madre y volver a suspender en medio completo a una concentración de trabajo de 100 nM. </li><li> Añadir 10 l de nanop trabajosuspensión artículo (100 nM) para las muestras tratadas para llegar a una concentración final de nanopartículas de 1 nM. Añadir el mismo volumen de medio completo para los controles sin tratar a cada pocillo. </li><li> Después de 1 hora internalización recoger las muestras en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y centrifugar ellos durante 3 min a 6000 x g a temperatura ambiente. </li><li> Lavar el pellet con 1 ml de tampón de 3 min a 6000 x g a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender el sedimento en 200 l de tampón. Las células están listas para su lectura por citometría de flujo. </li></ol> 6. Aislamiento de mezcla de culturas gliales primarios (Ver Bertero et al. 7) 7. Replating una mixta gliales confluentes de Cultivos Celulares <ol><li> Lave un frasco T-75 una vez con 10 ml de PBS (w / o Ca 2 + / Mg 2 +), a continuación, añadir 10 ml de Versene y se incuba a 37 ° C durante 5-7 min. </li><li> Pipetear el sobrenadante arriba y hacia abajo varias veces con el fin de separar las células de la superficie T-75 y disolverlos agregados de células. </li><li> Transferir la suspensión celular en un tubo de polipropileno de 15 ml. Se recoge una pequeña cantidad de la suspensión celular para contar las células con un hemocitómetro. </li><li> Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet a una concentración final de 5 x 10 5 células / ml en medio de cultivo completo de la glía. </li><li> Placa 0,5 ml / pocillo en una placa de 24 pocillos y dejar que las células se asientan durante 2-4 horas antes del tratamiento de nanopartículas. </li></ol> 8. Nanopartículas Internalización en Microglia <ol><li> Añadir 500 l de medio de cultivo glial completa (para los controles no tratados) o 500 l de una suspensión 2x Rodamina-SiO2 de nanopartículas en medio de cultivo glial completa (para muestras tratadas) a cada pocillo. </li><li> Pipetear las células para permitir la separación de las células-nonrapid la adhesión en los puntos de tiempo seleccionados y recoger en tubos de polipropileno de 2 ml. </li><li> Añadir 500 lde Versene a cada pocillo y se incuba la placa a 37 ° C durante 5 min, a continuación, separar la fracción celular restante y recoger cada muestra con las células no adherentes correspondientes de la etapa anterior. </li><li> Centrifugar las muestras durante 3 min a 300 x g a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender el sedimento en 100 l de tampón de AutoMACS. </li></ol> 9. La tinción con CD11b-VioBlue <ol><li> Añadir 10 l de VioBlue-CD11b anticuerpo humano / ratón para 100 l de suspensión celular (1:11 ratio) en tampón y se incuba 10 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 1 ml de tampón y mezclar la suspensión de células. </li><li> Centrifugar cada muestra durante 3 min a 300 x g. </li><li> Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 100 a 150 l de tampón. </li><li> Lea las muestras al citómetro (almacenar las muestras a 4 ° C entre los dos últimos pasos). IMPORTANTE: antes de analizar las muestras, proceda a la reparación de las señales superpuestas iLos espectros de emisión de N observó entre diferentes fluorocromos (nanopartículas o anticuerpos conjugados con fluorocromo). </li></ol> 10. Derrame espectral sobre la compensación <ol><li> Abra el cuadro de &quot;Ajustes del instrumento&quot; (presente en todos los programas de software del instrumento). Nota: Si está usando un instrumento diferente de la que se informa en la Tabla de materiales, por favor consulte el manual específico de instrumento para los detalles de adquisición. </li><li> Adquirir muestra sin tratar (sin nanopartículas) a velocidad de fluidos de baja (si es permitido por el instrumento). Durante la adquisición, ajuste manualmente hacia adelante y la dispersión lateral (FSC y SSC, respectivamente) mediante la regulación de los canales de tensión. Nota: Modificar las escalas de los ejes del SSC y del FSC con el fin de visualizar mejor la población celular completa en la trama. Un ajuste de plantilla para cada tipo celular de interés de instrumentos puede crearse, guardarse y utilizarse para futuras adquisiciones. </li><li> Abra la específicaFicha &quot;región&quot; en el software. Dibuje una región grande adecuada (&quot;gate&quot;) alrededor de la población deseada. Nota: Internalización de nanopartículas induce un cambio SSC de las células. Si la puerta está demasiado estrechamente restringido alrededor de la población celular de interés, los datos adquiridos probablemente pierda parte de las células para ser detectados. </li><li> Utilice dos muestras no teñidas, uno para su uso como blanco de muestra y uno para la compensación contra la tinción PI (opcional), una muestra de un solo manchado con el fluorocromo apropiado para cada canal de fluorescencia a ser compensado. Nota: Use un tubo de muestra de 1,5 ml diferente para cada anticuerpo conjugado a un fluorocromo para ser utilizado en el etiquetado experimento. </li><li> Abra la pestaña &quot;Compensación&quot; en la casilla &quot;Configuración del instrumento&quot;. Aumentar o disminuir el factor de compensación durante la adquisición hasta que la intensidad de fluorescencia en el canal de contagio es más o menos lo mismo para el pos fluorocromoitive y negativo de la población. </li><li> Adquirir muestras de nanopartículas tratadas después de la compensación se ha ajustado. </li></ol>

<ol>
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Los autores declaran que Miltenyi Biotech GmbH ha patrocinado la presentación de este manuscrito. HiQ-Nano Company ( <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.html</a> ) es un spin off de la nanotecnología empresa surgida de IIT.

El protocolo experimental presenta puntos muy importantes a tener en cuenta. Es muy importante trabajar a 4 ° C (en hielo) y, posiblemente, en la oscuridad, durante todas las etapas de tinción, ya temperaturas más altas y las luces pueden afectar negativamente el rendimiento de la tinción. Las nanopartículas se podrían sonicaron a ser mejor resuspendieron justo antes del uso. Un flujo correcto análisis de citometría requiere una calibración correcta en los diferentes canales. La calibración del instrumento debe realizarse antes de cada sesión experimental. Además de los problemas técnicos con la instrumentación, no puede haber también problemas con el anticuerpo etiquetado. Es obligatorio el uso del anticuerpo en una concentración adecuada. Si la concentración es demasiado alta o demasiado baja, la intensidad de señal insatisfactorias pueden ser la consecuencia. Las desventajas de esta técnica de preocupación la necesidad de trabajar con muestras monodispersas, la imposibilidad de localizar elEl sitio de origen de la señal (es decir, diferentes compartimentos celulares). También hay algunos límites en la elección de los fluorocromos a utilizar en combinación: la longitud de onda de la excitación y las bandas de emisión debe estar suficientemente separados para permitir su medición apropiado. Si los espectros de anticuerpos utilizados se superponen, se requiere una compensación correcta. La citometría de flujo es un método potente para el análisis de células en presencia o ausencia de nanopartículas. Esta técnica permite un estudio multiparamétrico de una célula, un alto número de eventos examinado, rapidez de análisis (más de 1.000 células / seg), reproducibilidad y lecturas estadísticos. Las muestras se pueden procesar sin perder la viabilidad celular. Mediante el uso de nanopartículas marcadas con fluorescencia es posible calificar y cuantificar su internalización en las subpoblaciones de células, que se identifican mediante marcadores específicos expuestos en la membrana celular. Los parámetros de celda pueden cambiar en presencia de s<html> nanopartículas ESPECÍFICAS. Dependiendo del objetivo de la investigación, estas variaciones pueden ser utilizados para identificar un fenómeno específico, tales como dispersión de lado de células que aumenta proporcionalmente con la tasa de internalización de nanopartículas creciente. Modificaciones inducidas nanopartículas de superficie celular también pueden representar una limitación de la técnica. Por esta razón, receptores de membrana celular rotación debe ser siempre tomada en consideración y posiblemente conoce de antemano para caracterizar precisamente la población celular de interés. Deficiencias extremas de osmosis membrana en muestras de nanopartículas sobrecargado puede conducir a la muerte celular. Nanomaterial toxicidad dependiente de la dosis debe ser probado empíricamente para cada población celular. Células muertas claramente definidos deben ser excluidos de la cuantificación de la fluorescencia. Por ejemplo, la tinción de anexina V / PI es uno de los varios métodos generalmente utilizados para detectar células necróticas y apoptóticas tanto. &quot;&gt; Células primarias que expresan GFP son también una herramienta poderosa para seleccionar una determinada subpoblación de células y recoger datos sin prelabeling. La combinación con nanopartículas fluorescentes complementarias permite una cuantificación muy rápido y preciso de la interacción célula-nanopartícula. Drogas o la entrega de genes se cree que mejorar en el futuro por la aplicación de nanopartículas capaces de liberar una carga específica de drogas en los tejidos seleccionados. Empleo de nanopartículas como moduladores específicos portadores de entrega y / o inmunológicos para industria farmacéutica requiere el conocimiento del medio biológico (es decir, mediante citometría de flujo) para estudiar las interacciones célula-nanopartículas.

Nanomateriales artificiales son hoy en día inspiran el interés de los científicos de la vida para potenciales aplicaciones en biomedicina 1. Una amplia variedad de materiales inorgánicos y orgánicos se puede utilizar para producir nanoestructuras con diferentes formas, físicas y características químicas. Entre estas estructuras, las nanopartículas de ingeniería de forma esférica demostraron un gran potencial para la medicina de diagnóstico y de la traducción 2. Su núcleo y diseño de la superficie son impulsados ​​por una posible aplicación e implica un profundo estudio de las respuestas de células diana tras el contacto y la interacción de las nanopartículas. Las nanopartículas que se piensan para ser administrado deliberadamente a seres humanos entrarán en contacto directo con varios tipos de células del sistema inmune. Su responsabilidad de mantener la integridad corporal ellas un tema crucial de la investigación en nanomedicina 3 hace. La parte celular del sistema inmune innato está representada principalmente por fagocitos. Entre ellos, el linaje de los monocitos / macrófagos células derivadas, incluidos los nerviosos residentes microglia centrales del sistema, juegan un papel clave en la defensa inmune 4,5. Ellos son capaces de desencadenar respuestas protectoras dentro de pocas horas después de encontrarse con cuerpos extraños. Por otra parte, las células monocíticas coordinar e instruir a la respuesta inmune adaptativa a través de la liberación de citoquinas. Todos estos eventos se producen incluso en presencia de materiales de ingeniería, que se perciben en gran medida como &quot;no propio&quot; por el sistema inmune 6. Entre los métodos utilizados históricamente en la inmunología para el análisis celular, citometría de flujo representa una de las herramientas más poderosas. Además, la disponibilidad de tecnologías para la identificación o purificación de una subpoblación inmune específica (a menudo explotando la exclusión o la presencia de una proteína de membrana individual) permite una investigación precisa de los efectos de un cierto nanopartículas en que ce primaria en particularll tipo 7. Sin embargo, las células pueden presentar alteraciones fisiológicas y morfológicas después de la exposición a las nanopartículas. Además, las nanopartículas pueden interferir con parámetros ópticos específicos, tales como absorción o emisión de luz a longitudes de onda definidas, que influyen en los resultados obtenidos 8. Por lo tanto, límites de utilización ya las adaptaciones eventuales de ensayos inmunológicos clásicos en el estudio de nuevos materiales deben ser considerados. Este trabajo se refiere a la detección de interacciones de nanopartículas con células inmunes primarias por citometría de flujo. Para abordar esta cuestión, el 50 nm FITC-SiO 2 nanopartículas se emplean como modelo nanomaterial para describir el método. Las partículas de sílice pueden ser producidas de una manera muy precisa en la escala nanométrica. Tamaño, forma, y propiedades superficiales, tales como carga o hidrofobicidad, se pueden finamente sintonizados para aumentar su biocompatibilidad 9. Muchas de las características de SiO 2 nanopartículas les permiten ser utilizados como unmodelo para la administración de fármacos partículas 10. Además, los tintes fluorescentes o puntos cuánticos pueden ser atrapados o vinculadas a estas partículas que ofrecen útiles nano-herramientas para los propósitos de formación de imágenes 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14170-088</td>
			<td style="width:256px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 (ATCC Modified)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum (lot n&#176; 1131917)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin 2.5%</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Pooled Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>34005100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Versene</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td>15040-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b-VioBlue human &#38; mouse</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACS BSA Stock Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Rinsing Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Running buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Running Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Human Pan monocyte isolation kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood Column Kit</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood CD14 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">LS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MidiMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Red Blood Cell Lysis Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Pre-Separation Filters 30 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Analyzer flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Calibration Beads</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">GEH17544202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:272px;">FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:272px;">Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">12-well plate Falcon</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of fluorescent nanoparticle interactions with primary immune cell subpopulations by flow cytometry

Las nanopartículas de ingeniería están dotados de propiedades muy prometedoras para fines terapéuticos y diagnósticos. Este trabajo describe un método rápido y fiable de análisis por citometría de flujo para estudiar la interacción de las nanopartículas con las células inmunes. Células inmunes primarios se pueden purificar fácilmente a partir de tejidos humanos o de ratón por aislamiento magnético mediada por anticuerpos. En el primer caso, las diferentes poblaciones celulares que se ejecutan en un citómetro de flujo se pueden distinguir por la luz dispersada hacia adelante (FSC), que es proporcional al tamaño de la célula, y la luz dispersada lateral (SSC), en relación a los teléfonos complejidad interna. Además, los anticuerpos marcados fluorescentemente contra receptores específicos de la superficie celular permiten la identificación de varias subpoblaciones dentro de la misma muestra. A menudo, todas estas características varían cuando las células son impulsadas por los estímulos externos que cambian su estado fisiológico y morfológico. Aquí, 50 nm de SiO FITC-2 nanopartículas se utilizan como un modelo para identificar ªe internalización de los materiales nanoestructurados en las células inmunes de la sangre humana. La fluorescencia celular y aumento de la luz dispersada de lado después de la incubación con nanopartículas nos permitió definir el tiempo y dependencia de la concentración de la interacción de las células de las nanopartículas. Por otra parte, tal protocolo puede ser extendido para investigar Rodamina-SiO 2 interacción de nanopartículas con primaria microglia, las células inmunes residentes sistema nervioso central, aislado de ratones mutantes que expresan específicamente la proteína verde fluorescente (GFP) en el linaje de monocitos / macrófagos. Por último, la citometría de flujo de datos relacionados con la nanopartícula la internalización en las células se han confirmado por microscopía confocal.

La citometría de flujo es una herramienta útil para identificar y caracterizar las diferentes células y es la técnica de elección para identificar las células inmunitarias específicas, tales como monocitos, granulocitos, células T, células B, células asesinas naturales (NK), células dendríticas (DCs), y otras subpoblaciones de leucocitos. En el esfuerzo para caracterizar mejor el comportamiento de las células blancas de la sangre en respuesta a las nanopartículas, se realizaron ensayos de internalización con leucocitos primarias aisladas de la sangre de donantes sanos (Figuras 1 y 2) y con la línea celular de monocitos humana (células THP-1, la Figura 3) . Como se informó en la Figura 1A, los tres principales subpoblaciones de leucocitos en sangre fueron claramente identificados por el delantero y la dispersión lateral después de aislar PBMCs. Por otra parte, después de FITC-SiO2 tratamiento, linfocitos (gris), monocitos (azul) y granulocitos (rojo) tienen una diferente ntasa de internalización anoparticle como se muestra por la intensidad de fluorescencia verde (Figura 1B). El protocolo descrito permite la purificación de CD14 monocitos positivos primarios a partir de PBMCs. Figura 2A informa de la citometría de flujo gráfico de puntos de monocitos CD14 + en presencia de FITC-SiO2. Figura 2B muestra FITC-SiO2 internalización cuantificado en las mismas células y expresado en histograma escala logarítmica. Experimentos de internalización similares se realizaron en células THP-1 monocitos tratados con concentraciones crecientes de FITC-SiO 2 nanopartículas. Las células no tratadas se utilizaron como control negativo. Figura 3A muestra un aumento dependiente de la dosis en la dispersión de sus superficies con un avance sin cambios dispersión en THP-1 línea celular. En la Figura 3B, junto con los histogramas de SSC y FSC en cada FITC-SiO concentración de 2 nanopartícula probado, intensidad de fluorescencia media (MSe presenta FI) cuantificación. Estos datos sugieren que el tratamiento con FITC-SiO 2 nanopartículas induce una internalización dependiente de la dosis en monocitos resaltados por el aumento de la granularidad intracelular (dispersión lateral) y de fluorescencia (canal verde). Para obtener más conocimientos sobre el tipo de interacción entre las células inmunes y las nanopartículas, se aislaron mezcla de culturas gliales primarios y microglia, las células inmunes residentes del sistema nervioso central, se purificó. El uso de un modelo de ratón transgénico que expresa la microglía verde fluorescente permite la visualización de diferentes mecanismos neuro-inflamatoria. El ratón transgénico B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J utilizado en este trabajo expresa la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor de CX3CR1 12. Después de 7 días in vitro (DIV), microscopía de fluorescencia muestra un cultivo glial primario mezclado con una gran cantidad de astrocitos (células adherentes negativo de GFPs) y algunas células de verde (GFP positivo, Figura 5A). En este modelo de ratón, tres subpoblaciones gliales se pueden distinguir por citometría de flujo con una única tinción CD11b-anticuerpo: la primera CD11b - GFP - (astrocitos y otras células gliales), un segundo grupo distinto de las células microgliales CD11b + GFP +, y una tercero GFP CD11b + - subpoblación (Figura 4A). Estos dos últimos subpoblaciones son ambos capaces de internalizar nanopartículas con un ligero aumento de la eficiencia por la GFP + población (que representa el patrullando la microglía inmaduro por la transcripción del promotor de CX3CR1), como se muestra por análisis de citometría de flujo (Figura 4B). La internalización producido se puede verificar adicionalmente mediante microscopía confocal usando la misma concentración final de Rodamina-SiO 2 nanopartículas como se muestra en la Figura 5B. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> Figura 1. FITC-SiO 2 internalización de nanopartículas en aislados de sangre leucocitos. A) hacia adelante Representante dispersión (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) citometría de flujo diagrama de puntos de Ficoll-Paque leucocitos de sangre aislados. B) superposición de fluorescencia verde histograma parcela de las tres principales de leucocitos en la sangre subpoblaciones de células en presencia de 1 nM FITC-SiO2 nanopartículas (45 mV) durante 1 hora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <strong&gt; la Figura 2. FITC-SiO 2 internalización de nanopartículas en CD14 + monocitos purificados. A) hacia adelante Representante dispersión (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) citometría de flujo diagrama de puntos de los monocitos CD14 positivos purificados. B) La fluorescencia verde histograma parcela de la subpoblación de monocitos purificados en presencia de 1nM FITC-SiO 2 nanopartículas (45 mV) durante 1 hora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> Figura 3. Efectos de la FITC-SiO2 nanopartícula internalización en células THP-1. A) hacia adelante Representante dispersión (FSC) frente scatterin ladog (SSC) citometría de flujo diagrama de puntos de células THP-1 línea celular de monocitos, después de 1 h de exposición de FITC-SiO2 nanopartículas creciente concentración. B) variación dependiente de la concentración de la dispersión lateral (SSC), la dispersión hacia adelante (FSC) y verde fluorescencia en presencia de FITC-SiO 2 nanopartículas (45 mV) durante 1 hora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> Figura 4. Rodamina-SiO2 nanopartícula internalización en primaria microglia aisladas de B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J ratones. A) proteína fluorescente verde (GFP) en comparación con el flujo de CD11b-VioBlue citometría gráfico de puntos de prglia mixta imary aislado de B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J ratones. CD11b + GFP + y CD11b + GFP - poblaciones se muestran en la parte superior derecha y el cuadrante inferior derecho, respectivamente B) fluorescencia roja superpuesta histograma parcela de subpoblaciones microglia en presencia de 1 nM rodamina-SiO2 nanopartículas (45 mV) de 30. min (histograma rojo) versus control (histograma gris). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> Figura 5. Visualización de GFP + microglia. (A) Microscopía de fluorescencia a 7 DIV y (B) La microscopía confocalde Rodamina-SiO2 nanopartícula internalización (flechas rojas) en GFP +-microglia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Análisis de la interacción de nanopartículas con subpoblaciones definidas de células inmunes por citometría de flujo.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

detection-fluorescent-nanoparticle-interactions-with-primary-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.4K vistas.  Istituto Italiano di Tecnologia.  Análisis de la interacción de nanopartículas con subpoblaciones definidas de células inmunes por citometría de flujo. 

Video: Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

Evaluación cuantitativa de las células inmunes en el tejido de la médula espinal lesionada por citometría de flujo: un nuevo uso de un método de purificación celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

No quirúrgico instilación intratraqueal de ratones con el análisis de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón por citometría de flujo

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

El estudio de las interacciones de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrófilos mediante citometría de flujo y microscopía Tiempo Lapso

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Detección de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

Discriminación de siete subconjuntos de células inmunes por dos fluorocromo citometría de flujo

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

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