The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

注：このメソッドに記述されているすべての血液採取手順はヘルシンキ宣言に従って行われ、被験者のためのUNT治験審査委員会（IRB）により承認された。すべての被験者は正常な体重、彼らは明らかに健康であることを確実にするために、本発明の方法で使用された血液採取のための書面による同意を与えた、と無病。 1.試薬ソース＆準備<ol><li>使用CD66b-APC（クローン＃のG10F5、DF = 1：50）とCD45-APCeFluor780（クローン＃2D1; = 1 DF：50）このアッセイのために。 注：前に研究するために、CD45とCD66b抗体は、他の白血球から最適希釈はっきり解決顆粒球（CD45 + / 66B +）を決定するために、力価測定した（CD45 + / 66b-）11。染色するための希釈した抗体を添加すると、チューブの最終希釈は875だった。 </li><li>株式Sを購入し、解凍pHrodo赤い色素で標識された黄色ブドウ球菌生体粒子。 1mの濃度でサスペンド滅菌PBSで1ml当たり生体粒子のグラム。アリコートをアッセイに使用するまで-20℃で凍結生体粒子及びストアを希釈する。 </li><li>ジヒドロエチジウム（DHE）を溶解し、10グラム/ mlの最終濃度までDMSOに、酸素フリーラジカル（ すなわち、酸化的バースト）の存在下で蛍光エチジウムブロマイドに変換される。 </li><li>それぞれが200mg / mlおよび17.5ミリグラム/ミリリットルの2段階希釈液の無菌PBSと混合（指定されたアッセイのインキュベーション期間は、次の追加の食作用を防止するために使用される）、N-エチルマレイミド。アッセイでは、15 mMの最終濃度を使用する。 N-エチルマレイミドを解凍する際のN-エチルマレイミドを溶液中に残存しないように、37℃のヒートブロックを使用する。 </li><li>最後の固定工程の後、核DNAを染色するために7AADを使用しています。添加の前に、滅菌PBSで株式7AAD 1:10に希釈する。 </li></ol> 2.血液サンプル採取<ol><li> O / N速い（&gt;炉冷し）とabstenti以下の研究室に到着する科目を掲載身体活動（&gt; 12時間）から上に。 </li><li>アルコール準備パッドで皮膚を洗浄後、末梢腕静脈に無菌の採血針を挿入します。 </li><li>市販のヘパリンナトリウムで満たされている避難チューブに血液を収集します。 </li><li>収集後、被験者の腕に接着剤包帯を適用します。 </li><li> 10回を混合するために、血液チューブを反転してから分析までロッカーに置きます。 </li></ol> 3.食作用アッセイ法<ol><li>解凍黄色ブドウ球菌の生体粒子（RT）、DHE（RT）、及びN-エチルマレイミド（37°C）。 </li><li>無菌フードでの作業中に4個々の1.2ミリリットルチューブに黄色ブドウ球菌の生体粒子の20 Lを追加します。 </li><li>生体粒子を含む各チューブにDHEの40 Lを追加します。 </li><li>静かにチューブの底に試薬を収集するためにベンチ表面にチューブをタップします。 </li><li>生体粒子とDHEで充填されている各チューブに混合の全血100 Lを追加します。 </li><li>すべての汚染血液を除去するために綿先端アプリケーターで、チューブの内側の端を拭きます。 </li><li>血液添加後3サイクルのための血液と試薬を混合するために設定された電子ピペットを用いて血液と試薬を混ぜる。 </li><li>アイスバケットでアッセイチューブを配置し、光から保護するためにカバーしています。 </li><li> 10、20、および40分間のアッセイチューブをインキュベートする。すべてのアッセイチューブが同時に完了を保証するために40分間の管で始まる。 </li><li> 37°Cビード浴中で解凍N-エチルマレイミド。 </li><li>ピペットで各アッセイチューブに（1.4で上述）N-エチルマレイミドの15リットル、30分インキュベートする。 </li><li>ピペットCD66b-APCの10 LおよびCD45-APCeFluor780（1.1において上述）で希釈した抗体の10 Lは、60分間インキュベートする。 </li><li>ピペットで各アッセイチューブにWBC修正/ RBCの溶解液を750 Lは、60分間インキュベートする。 </li><li>遠心分離機細胞ペレットを収集するためのアッセイチューブ（400×gで10分）。 </li><li>真空が残留FLを残して、WBC溶解/ RBCの定着液を吸引細胞ペレットを上記のuid体積（100L）。 </li><li>ピペット（1.5において上述した）希釈7AAD溶液10 Lと50 LのPBSを各アッセイチューブに。 </li><li>冷蔵庫で1箔でアッセイチューブ、ラップチューブ上のキャリブレーションビーズ（〜25 L）各アッセイチューブに、場所キャップの低下、および場所を追加します。 </li><li>サイトメーター画像ベースのフローにサンプルチューブをロードし、事前定義されたパラメータを使用して3000顆粒球イベントの最小収集：オートサンプラー、青（488 nmの、60ミリワット）、赤（640 nmの; 100 NW）、SSC（785 nmのを。 8.5 mW）とレーザー（ 図1）。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> 図1.取得方法＆テンプレート。サンプルは、画像ベースのフローサイトメーター（A）で得た。買収時には、CD66b-APC対明視野アスペクト比のドットプロットを使う、スパイク、キャリブレーションビーズから分離顆粒球に生成されたG INSPIRE V。100.2.292.0ソフトウェア（B）。赤、（640ナノメートル; 100 NW）、SSC（785ナノメートル、8.5ミリワット）レーザ、5000顆粒球の最小値は青オートサンプラー、（60 mWの488 nm）を使用して、各サンプルについて、取得した。ヒストグラムの数は、レーザーの設定とデータの他の側面収集を監視するために取得中に存在していることに注意してください。これらのヒストグラムはすべてオプションと実験室の標準的な操作手順は、品質管理として、それらを必要とする場合にのみ必要である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 4.サンプル収集と分析<ol><li>生の画像ファイル（RIF）に補償行列を適用し、画像化されたファイル（CIF）を補う作成するIDEASソフトウェアの自動ソフトウェア補償ウィザードを使用してください。 </li><li> IDEASソフトウェアで個々のCIFファイルをロードし、顆粒球サブセットを識別するために、次のプロットを生成します。 </LI&gt; <li>明視野勾配RMS（ 図2A）のヒストグラムを用いて、焦点にあるとみなされた細胞を同定するための最初のゲートを確立する。参照標準として非刺激対照を使用して、各患者試料について、この決定を行う。 </li><li>明視野のアスペクト比（幅対セルの高さの比）対明視野領域（ 図2B）のドットプロットを使用して、破片およびダブレットから独立した一細胞に二次プロットを使用する。参照標準として非刺激対照を使用して、各患者試料について、この決定を行う。 </li><li>細胞のきれいな集団が同定されたら、積極的に顆粒球（CD45 + / 66bが+）を識別するCD66b対CD45（ 図2C）のドットプロットを確立する。 S.のための明るいディテール強度の娘プロット（ 図3）を作成します活性化顆粒球のサブセットを識別するために、対酸化的バースト（DHE、y軸）のために明るい詳細強度球菌 （x軸）。 BRを収集チャンネル1と9のIGHTフィールド画像、チャンネル2で生体粒子、DHEチャンネル4で、7AADチャンネル5で、CD66bチャンネル11、およびCD45で12チャンネルで。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> 図2.分析テンプレート。この図は、焦点（A）であった細胞を同定するために生成された一連のプロット、単一細胞（B）、顆粒球（C）。追加のプロットは活性化顆粒球対非アクティブな顆粒球の3つのサブセットを同定するために使用した。取得した画像ファイルはすべて分析はアイデアV.6ソフトウェアを使用して完成させた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<ol>
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R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis,+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms.">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. 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C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li><li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes.">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li><li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Low+Concentration+Human+Serum+Cytokines+using+a+Millipore+High-Sensitivity+Milliplex+Assay.">Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+Yeast+Beta+Glucan+Supplementation+Increases+Salivary+IgA+and+Decreases+Cold/Flu+Symptomatic+Days+After+Intense+Exercise.">Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise.</a> J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain.">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

本発明の方法は、1,3,4,12-14フローサイトメトリーを用いて顆粒球機能の評価のための既存の方法の改良を表す。このアッセイの重要なステップは、生体粒子およびDHEと血液試料の適切な混合に関連する傾向がある。不完全な混合は不正確な結果になります。完全な混合が重要である一方、混合方法は、自然の中で穏やかにする必要があります。これは、混合は、混合機能を備えた電子ピペットはなく、ボルテックスミキサーを使用して達成することが示唆された。アッセイにおけるもう一つの重要なステップは、常にアッセイチューブの上半分を汚染全く血がないことを確認することです。この残留血液を、滅菌綿棒を用いて除去することができる。そうする障害は、未溶解した赤血球と最終アッセイ調製物を汚染する可能性があるため、完全に除去することが重要である。 適切な補償制御が種をコントロールするために添加されるべきで、この方法を使用する前に顆粒球機能の様々な態様を特定するために使用される試薬の間でectral重複。この方法では、補償制御は、40分間のアッセイインキュベーションを示唆し、1つのマーカー（ すなわち、大腸菌 、DHE、など）で標識化された血液サンプルを採取することを含む。標識後、単一の正のイベントが収集され、補償行列は、IDEAS解析ソフトウェアで自動化されたウィザードを使用して生成される。これは、このアッセイが使用される場合、適切な補償制御が適切なアッセイ性能を確保するために完了していることが重要である。 分析は、明るいディテール強度が集団を分離するための最良の変数であることを特定し、また多くの重複が酸化的バーストおよび食作用信号の間に存在しているかを識別するための機能ファインダーと共局在のウィザードを使用して達成される。具体的には、画像ベースのフローサイトメトリーの使用は、3つのサブセットに活性化顆粒球を分離する能力を提供した。 T彼のサブセット破壊は酸化的バースト対食作用の明るい細部の強度を用いて決定した。これらの特異な細胞機能を調べることに加えて、同じ解剖学的位置（共局在）で同時に両方のイベントを示した細胞が同定された。 「高活性な」サブセットに落ちた顆粒球は食作用および酸化的バーストの間で一貫性の共局在を示した唯一の表現型であった。活性化した顆粒球サブセットのこの識別は、トラブルシューティングが必要とされる最大の領域です。新しいユーザがIDEASのサンプルプロセスワークフローを理解するために時間がかかるし、撮像コンポーネントを使用して細胞集団をゲーティングの仕組みを理解することが非常に重要である。ユーザーが作るために求めることができる他の修飾には、代替または追加のアッセイインキュベーション時間の選択を含む。現在の方法は、10〜40分の持続時間の使用を示唆している。しかしながら、この方法は、実験モデルに応じて使用するには、より長い検定期間を選択することが必要であり得る。このような改変は、個別に評価する必要があろう。 さらに、それは、アッセイのインキュベーション期間は3活性化サブセットの外観に大きな影響を与えることが判明した。この報告書に記載されたアプローチは、以前顆粒球機能3,4,13,15に関して得ることができるどのような情報の拡張を表します。他の研究室は、免疫および疾患15-17の包括的評価の一部として、顆粒球機能の変化を評価することの重要性を実証した。このアッセイの可能性にもかかわらず、それには限界がないわけではない。主な制限の一つは、高いサンプルスループット処理に伴うコストと時間の需要である。研究デザインは、特定の日に多数のサンプルを必要とするとき、これらは加工が困難であることができる。処理は、電子ピペットとディスペンサーを使用することによって合理化され、これらは高価になる傾向があり、あらゆる実験室で必ずしも利用できない。 研究の私たちの地域は、運動と食生活は免疫系の健康と機能6,8-10,18-20にどのように影響するかの研究に焦点を当てています。このような目的は、人間の健康の様々な分野のための重要な実用的な意味を持っている。貪食機能のモニタリングが治療成績に重要となる運動と栄養効果の研究を超えて、この原稿で実証食作用方法は、臨床免疫学の他の分野で有用である可能性があります。本発明のアッセイは、潜在的に免疫学的アッセイは、イメージベースのフローサイトメーターからCANことができますユニークな撮影情報の利点を取ることによって、再発明されていることを多くのの最初のものです。

顆粒球は抗原の侵入に対する防御の第一線を提供し、体の自然免疫系の一つの成分を表している。顆粒球機能を評価するための従来の方法は、それが困難な顆粒1-4を変更したかをまとめて把握すること、別個の方法を使用して、食作用能力または酸化的バーストに焦点を当てた。流れの分野における進歩は、フローサイトメトリーのハイスループット様式5のセルの高解像度、マルチカラー撮像が可能な卓上型機器の生産をもたらした。従来のフローサイトメトリーでイメージングを組み合わせる能力は、既存のフローサイトメトリー法内革新および免疫系に関する新しい情報を抽出するために必要な技術的プラットフォームを提供進歩を表す。 過去10年間で、私たちの研究室では、特に、鋭く、様々な栄養と運動療法パットの効果が注目されている先天性の免疫機能6-9でRNS。この原稿で実証方法は、臨床免疫学の分野内で実用的な意味を持っている。本発明の方法は、同時に細菌粒子と酸化的バーストの食作用を測定するための画像ベースのフローサイトメトリーのパワーを活用しています。このアプローチを用いて、分析の画像ベースの部分で提供さ変数を使用して活性化顆粒球を分離することができる。これらのサブセットは、個々の顆粒球上の細胞の画像を評価するた後だけに識別可能であった。さらに、アッセイのインキュベーション時間は3活性化サブセット10との間の遷移に影響を与えた。これにより、複数のインキュベーション時間の使用は、特定の実験的治療後の顆粒球機能の変化を試験するための方法を可能にすることができることはもっともらしい。本稿の目的は、同時にoxidatで食作用を測定するために画像ベースのフローサイトメトリーを用いて顆粒球機能を評価する方法を実証することであったIVEはバースト。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacutainers</td>
			<td style="width:125px;">BD Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">WBC Fixative / RBC Lysis solution</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">00-5333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD66b-APC</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone G10F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45-APCeFluor780</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone 2D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">s.aureus bioparticles</td>
			<td style="width:125px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dihydroethidium</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D7008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-ethylmalemide</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7AAD</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hematology Analyzer</td>
			<td style="width:125px;">Mindray</td>
			<td style="width:119px;">BC-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-channel pipet</td>
			<td style="width:125px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">ViaFlo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead Bath Incubator</td>
			<td style="width:125px;">LabArmour</td>
			<td style="width:119px;">BeadBath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis FlowSight</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">INSPIRE Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis INSPIRE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IDEAS Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis IDEAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">X-Pierce Piercable Plate Sealer</td>
			<td style="width:125px;">Excel Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X-Pierce</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dell Precision Workstation</td>
			<td style="width:125px;">Dell Computers</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td>Used for IDEAS analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

画像ベースのフローサイトメトリーを使用すると、我々は、3つの異なる活性化サブセット（ 図3）への活性化顆粒球の均一な集団を分離させた。この方法では、最も効果的な方法は、3活性化サブセットを酸化的バースト対（ 黄色ブドウ球菌 ）（DHE）（;図4図3）食作用のために明るいディテール強度をプロットしている解決します。また、IDEASソフトウェアの共局在ウィザードを使用することは非常に活性化顆粒球の特徴的な兆候である、同時食作用および酸化的バーストの存在の定量化を可能にする。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> 活性化顆粒球サブセットの図3の同定は、細胞表面マーカー（CD45 + / 66bが+）を用いて顆粒球の同定後、娘プロットは明るい細部INTENで生成された酸化的バーストのための明るいディテール強度対食作用のためにsity。このアプローチは、中程度のアクティブ、非アクティブ（紫）、ローアクティブ（赤、A）、（青、B）の割合は、高活性な（黄色、C）顆粒を使用することを決定した。このゲーティング技術は、種々の活性化顆粒球サブセットの相対的な存在量に関するアッセイインキュベーション時間の効果を評価するために使用した。 「ハイアクティブ」顆粒球の割合が最も高いが、40分間インキュベーション後に存在していた。取得した画像ファイルはすべて分析はアイデアV.6ソフトウェアを使用して完成させた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 活性化顆粒球の三つの異なるサブセットの存在を示すことに加えて、それは、アッセイインキュベーション時間は、各活性化顆粒球サブセットの相対量に影響を与えたことが実証された。具体的には、40分株式会社ubationは「高アクティブ」顆粒球の最大の割合をもたらした。少なくとも三つのアッセイインキュベーション期間を含めることによって、所与の臨床治療が、顆粒球の一時的な活性化状態を変化させる方法を決定することも可能である。これは、食作用および酸化的バーストの同時測定の関数として、異なる活性化顆粒球のサブセットを識別するために画像ベースのフローサイトメトリーを使用して最初の公表された方法である。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> 細胞マーカーの図4の代表的な画像は 、ハイアクティブ（A）として分類された細胞の画像ギャラリー、適度な活性（B）、及び、ローアクティブ（C）は、この図に示されている。 黄色ブドウ球菌の生体粒子はCH03である、酸化的バーストは、CD66bはである、側方散乱がCH06である、核のための7AADがCh05である、CH04であるCH11、およびCD45はのCh12である。また、酸化的バースト（CH04）対食作用（CH03）の共局在マージ画像が表示される。マージ画像で黄色のエリアその食作用および酸化的バーストを示すが同時に同じ解剖学的空間で発生している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

顆粒球機能の変化を評価するために、イメージベースのフローサイトメトリー技術<em&gt;インビトロ</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.3K ビュー.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

ビデオ: Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

免疫・感染学

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

インビトロアッセイで HIV特異的CD4 T細胞エフェクター機能に対する免疫調節経路の影響を評価する

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

T細胞におけるクロマチンの状態を評価するためにフローサイトメトリーの使用

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single cell level and statistical image analysis at a populational level. To overcome this difficulty, we used imaging flow cytometry and transcriptomic profiling (RNA-seq) to determine altered subcellular localization of the cluster of differentiation 1d protein (CD1d) associated with impaired endocytic gene expression in human dendritic cells (DCs), which were exposed to the common lipophilic air pollutant benzo[a]pyrene. The colocalization of CD1d and endocytic marker Lamp1 proteins from thousands of cell images captured with imaging flow cytometry was analyzed using IDEAS and ImageJ-Fiji programs. Numerous cellular images with co-stained CD1d and Lamp1 proteins were visualized after gating on CD1d+Lamp1+ DCs using IDEAS. The enhanced CD1d and Lamp1 colocalization upon BaP exposure was further demonstrated using thresholded scatterplots, tested with Mander&#39;s coefficients for co-localized intensity, and plotted based on the percentage of co-localized areas using ImageJ-Fiji. Our data provide an advantageous instrumental and bioinformatic approach to measure protein colocalization at both single and populational cellular levels, supporting an impaired functional outcome of transcriptomic alteration in pollutant-exposed human DCs.

Imaging flow cytometry provides an ideal approach to detect the morphological and functional alteration of cells at individual and populational levels. Disrupted endocytic function for lipid antigen presentation in pollutant-exposed human dendritic cells was demonstrated with a combined transcriptomic profiling of gene expression and morphological demonstration of protein trafficking.

イメージング フローサイトメトリーとトランスクリプトーム変質エンドサイトーシス CD1d の人身売買を評価するプロファイリングを統合します。

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

狂犬病ワクチンの効力を評価するインビトロELISA試験

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...