This work was supported by the KU Leuven PF &#8216;IMIR&#8217;, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.

NOTA: Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el comité de ética de la Universidad Católica de Lovaina (proyecto número 090/2013). Mantener los animales, de acuerdo con las directrices de cuidado de animales KU Leuven. 1. C. Crecimiento albicans <ol><li> Veinticuatro horas antes de la iniciación del experimento animal, preparar placas de YPD mediante la adición de 10 g de extracto de levadura granulada, 20 g de peptona bacteriológica, y 15 g de agar granulado. Invente volumen a 900 ml con agua Milli-Q y autoclave. </li><li> Añadir 50 ml de 40% de glucosa estéril. Mezclar bien y verter en placas de Petri. Deja placas de agar se enfríe y solidifique. NOTA: En este estudio, utilizar dos cepas, es decir, de tipo salvaje C. albicans SC5314 - cepa Gluc negativo (denominado WT) y C. albicans SKCA23 cepa, que es un tipo salvaje C. albicans SC5314 transformada con el plásmido CLP10 :: Act1p-gLUC59 22 .En esta cepa (llamado SKCA23- ACTgLuc) Gluc se fusiona con el gen endógeno PGA59 bajo el control de ACT1 (actina) promotor (es este promotor activo en la levadura, así como la etapa de hifas de crecimiento de hongos). Esta cepa se puede solicitar desde el laboratorio del Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Lovaina, Bélgica. Plásmido plásmido CLP10 :: Act1p-gLUC59 22 fue cedida gentilmente por el profesor C. d&#39;Enfert, Instituto Pasteur, París, Francia. </li><li> Mantener ambas cepas en glicerol y se almacena a -80 ° C. </li><li> Antes de cualquier cepa experimento racha en una placa de YPD. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche. </li></ol> 2. Catéter Preparación Piezas <ol><li> Antes del experimento, determinar el número de catéteres se necesitan. Es posible implantar hasta 6 piezas de catéter por ratón (3 catéteres en la izquierda y 3 del catéter en el lado derecho del animal (Figura 2A). </li><li> Veinticuatro horas antes de la cirugía animal, abra el paqueteedad que contiene catéter de triple lumen bajo la cabina de seguridad biológica. Quite todas las partes innecesarias con pinzas estériles y cortar la parte unida al catéter con un bisturí estéril. Coloque gobernante bajo el paquete de plástico y cortar piezas de catéter de poliuretano de exactamente 1 cm de acuerdo con la escala de la regla (Figura 1). NOTA: Es importante mencionar que este tipo de pieza catéter no es fosforescente y por lo tanto adecuado para BLI 18,19. </li><li> Coloque un máximo de 15 piezas catéter corte (paso. 2.2) en 2 ml tubos de microcentrífuga. Siempre prepare 3 piezas extra, que se usan para enumerar la cantidad de células de Candida adjuntos en el dispositivo después de que el periodo de adhesión. </li><li> Suplemento catéteres con aproximadamente 1,8 ml de suero bovino fetal 100% (FBS). </li><li> Vigorosamente vórtice y añadir 100-200 l adicional de 100% de SFB. Cubra completamente todas las piezas del catéter con suero. </li><li> Incubar a 37 ° C durante la noche. </li&gt; </ol> 3. Los animales y la supresión del sistema inmune <ol><li> Mantenga hembra BALB / c ratones (aproximadamente 8 semanas de edad) en jaulas ventiladas individualmente superiores de filtro con libre acceso al alimento estándar y agua ad libitum. </li><li> Iniciar supresión del sistema inmune 24 hr antes de la cirugía de los animales mediante la adición de dexametasona (0,4 mg / L) al agua de bebida de los animales. Con el fin de evitar cualquier contaminación bacteriana del anfitrión, complementar el agua potable con antibióticos, por ejemplo, polvo de ampicilina de sodio (0,5 g / L). </li><li> Mantenga la inmunosupresión de los animales durante todo el experimento (hasta 6 días). </li></ol> 4. Los sustratos de poliuretano Ex vivo C. albicans Adherencia sobre FBS recubiertas- <ol><li> Transferir cada pieza catéter suero recubierto en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml frescos. </li><li> Raspe algunos C. albicans células cultivadas en placas de YPD (Paso 1) y suspender en 1 ml de PBS. </li><li> Diluir Cancélulas dida (1: 100) en un tubo de microcentrífuga independiente. Tomar 10 l de la muestra diluida y aplicarlo en una cámara de recuento celular. Contar al menos 16 pequeños cuadrados. </li><li> Preparar las células de Candida (cada cepa por separado) en medio RPMI 1640 a una concentración final de 5 x 10 4 células / ml. </li><li> Añadir 1 ml de suspensión celular a cada pieza del equipo de suero-revestido. </li><li> Vortex vigorosamente y asegurar que los catéteres están sumergidos en el medio y no flotando en la superficie. </li><li> Incubar catéteres a 37 ° C durante 90 min (período de adhesión). </li><li> Eliminar catéteres con pinzas estériles y lavar dos veces con 1 ml de PBS. Durante esta etapa de asegurarse de que el fluido de lavado pasa a través del lumen, manteniendo el catéter en posición vertical, mientras que el lavado muy suavemente los catéteres. Es importante destacar que no utilice un fuerte flujo que puede llevar a la eliminación de las células unidas. </li><li> Traslado cada catéter se lava a un tubo de microcentrífuga limpio (una pieza per tuser). </li><li> Coloque sobre hielo y mantenerlo allí hasta la cirugía. </li></ol> 5. Anestesia <ol><li> Preparar la anestesia mediante la mezcla de 75 l de ketamina (100 mg / ml) con 100 l de medetomidina (1 mg / ml) y 825 l de solución salina estéril. Administrar por vía intraperitoneal (ip) 60-80 l de cóctel anestésico por 10 g de peso corporal, lo que resulta en una dosis de 45-60 mg / kg de ketamina y 0,6-0,8 mg / kg de medetomidina. </li><li> Para la recuperación de la anestesia, diluir 50 l atipamezol (5 mg / ml) en 4,95 ml de solución salina, administrar ip 100 l por 10 g de peso corporal como antídoto, resultando en una dosis de 0,5 mg / kg. </li><li> Después de la inyección de la anestesia, colocar al animal en una jaula separada y espere hasta que esté completamente dormido. </li><li> Confirme anestesia adecuada de los subproductos animales pizca de piel clara y una pizca dedo del pie, que no causa ningún daño a la piel. Cualquier movimiento observada indica que el animal no se anestesia suficiente para realizar la cirugía. Si esto sucede, espere un couple de minutos más hasta que el animal no muestra ningún signo de movimiento sobre la piel o del pie sujetador. </li></ol> 6. Cirugía Animal <ol><li> Transferencia anestesiado animal de la jaula en un pañuelo de papel limpio colocado sobre el cojín eléctrico, pre-calentado a 37 ° C (Figura 2, (1)). NOTA: Una alternativa más barata es usar mantas eléctricas. También es posible usar almohadillas isotérmicas, que deben ser calentados en el microondas antes de la cirugía animal. </li><li> Aplique un ungüento oftálmico en los ojos. </li><li> Afeitarse la parte trasera inferior del animal con una rasuradora eléctrica. Retire todos los pelos de animales y traslado de los animales en un pañuelo de papel limpio. Desinfectar la piel (por ejemplo, con 1% de isopropanol yodo o 0,5% de clorhexidina en 70% de alcohol) y dejar el área desinfectada secar durante aproximadamente 1 min (Figura 2A, (2)). </li><li> Hacer una pequeña incisión en la piel (uno a la izquierda y uno en el lado derecho del animal) (aproximadamente 0,5 y# 8211; 1 cm) (Figura 2A, (3)). </li><li> Diseccionar el tejido subcutáneo con una tijera para crear dos túneles subcutáneos. Cada túnel debe ser de aproximadamente 1,5 cm de largo y 1 cm de ancho. </li><li> Inserte tres piezas de catéteres, previamente infectados con Candida, en cada túnel. Asegúrese de que los catéteres se encuentran uno junto al otro en una disposición horizontal y que no cubren entre sí para permitir la implantación de seis fragmentos de catéteres en total (Figura 2A, (4)). </li><li> Cerrar las incisiones con suturas. Como alternativa, utilice Dermabond para cerrar la herida. </li><li> Desinfectar la herida suavemente con un 0,5% de clorhexidina en alcohol al 70% o con isopropanol yodo (1%). </li><li> Aplicar anestésico local (gel de xilocaína, 2%) directamente sobre la herida. </li><li> Administrar reversión de la anestesia (protocolo 5, etapa 2): por vía intraperitoneal 100 l por 10 g de peso corporal. </li><li> Transferencia animal a una jaula limpia previamente colocada en una placa calefactora. Mantenga al animalindependiente y caliente hasta que el animal está completamente despierto. Mientras tanto, continuar con la operación y el implante de la siguiente animal. Una vez que todos los animales operados son completamente despierto. Transferencia a una jaula. Monitorear los animales regularmente. </li></ol> Imagen 7. bioluminiscencia: Preparación de coelenterazina (CTZ), el sustrato para G. luciferasa princeps <ol><li> Preparar coelenterazina fresca solución madre (CTZ) por disolución de 5 mg / ml CTZ en etanol acidificado o de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Preparar la solución de trabajo mM 1,2 por dilución de la solución madre 1:10 en PBS estéril. NOTA: Inyectar 100 l CTZ soluciones de trabajo por vía subcutánea en la zona que rodea a los catéteres. Utilice jeringas de insulina para la inyección subcutánea de CTZ. </li><li> Siempre mantenga CTZ en la oscuridad (por ejemplo, cubrir tubos de microcentrífuga que contengan CTZ con papel de aluminio). Almacenar la solución madre a -80 ° C durante la duración de los experimentos. </li></ol&gt; 8. La bioluminiscencia Imaging <ol><li> Inicialice la cámara BLI. </li><li> Anestesiar a los animales utilizando una caja de inducción. Utilice una mezcla de gas de isoflurano en oxígeno, N 2 O / O 2, o aire a 2-3%. </li><li> Después de la inducción, mantener la anestesia en el cuadro de inducción y en la cámara de formación de imágenes en 1,5-2%. </li><li> Antes de comenzar la sesión de imágenes, coloque la placa de imagen en la posición A, que corresponde a un FOV de 10 cm. Asegúrese de que la posición correcta de los puntos de venta de anestesia y de los animales mediante la colocación de un animal que duerme en la caja. </li><li> Tome algunas fotografías hasta animal está en la posición de imagen deseada, en el FOV justo debajo de la cámara. </li><li> Preparar dos jeringas de insulina que contienen cada uno 100 l de la solución de trabajo CTZ. </li><li> Coloque un animal en el banco y mantenerlo dormido por medio de un cono de la nariz que proporcionan anestesia gas. </li><li> Llevar las agujas de las jeringas en un lugar que rodea catéteres por vía subcutánea e inyectarla CTZ simultáneamente en la parte superior de los catéteres. </li><li> Inmediatamente después de la inyección, coloque el animal en el plato caliente en la caja de la cámara y comenzar la adquisición de imágenes de bioluminiscencia. </li><li> Adquirir exploraciones consecutivas con tiempos de adquisición de 20 a 60 segundos (dependiendo de la intensidad de la señal) hasta que se alcanza la intensidad máxima de la señal. Durante la adquisición de la trama siguiente, medir la intensidad de la señal BLI de las tramas previamente adquiridos mediante la colocación de un ROI sobre cada trío catéteres y midiendo el flujo de fotones a través de esta ROI. </li><li> Repita desde el paso 7 para el siguiente animal (s). </li><li> Después de las imágenes, vuelva animales a su jaula. Repita BLI durante el curso de un experimento para longitudinal, no invasivo de seguimiento de la formación de biopelículas. </li><li> Analizar los datos de BLI utilizando Vivir software de imagen. Coloque un ROI rectangular de tamaño fijo sobre cada trío catéter y medir el flujo de fotones (radiación) a través de cada ROI. Repita esto para cada animal. </li><li> Informela intensidad de la señal BLI de cada trío catéter como flujo de fotones por segundo. Representar los datos de BLI en una escala logarítmica por el trazado de la media y la SD de la flujo de fotones por segundo para cada grupo. Realizar un análisis estadístico de los registro de 10 datos transformados. </li></ol> 9. Catéter Explante <ol><li> Preparar tubos de microcentrífuga que contiene 1 ml de PBS, uno para cada dispositivo de catéter y mantenerlos en hielo. </li><li> La eutanasia a los animales por dislocación cervical (Figura 2B, (1)). </li><li> Desinfectar la piel de la espalda con 0,5% de clorhexidina en 70% de alcohol o de yodo con isopropanol (1%). </li><li> Hacer una incisión (aproximadamente 3 cm) por encima de los catéteres. </li><li> Cortar tejido subcutáneo y retire los fragmentos de catéter uno por uno desde debajo del tejido subcutáneo utilizando pinzas estériles (Figura 2B, (2)). </li><li> Manejar catéter suavemente en posición vertical y lavar dos veces con 1 ml de PBS estéril. Coloque cada catéterpieza en un tubo de microcentrífuga separado (preparado en el Paso 1). </li></ol> 10. Las células asociadas a Biofilm Cuantificación de formadoras de colonias por Conde Unidades (UFC) y análisis estadístico de los resultados <ol><li> Catéteres Sonicar colocados previamente en 1 ml de PBS durante 10 minutos a 40.000 Hz en un baño de ultrasonido agua y colocarlos en hielo. </li><li> Después de la sonicación y agitar vigorosamente durante 30 segundos y lugar de nuevo en el hielo. </li><li> Prepare dos tubos de microcentrífuga adicionales que contienen 900 l de PBS. </li><li> Haga 1:10 y 1: 100 diluciones de la muestra original (la que contiene el catéter) y mantener todos los tubos de microcentrífuga en hielo. </li><li> Plate 100 l de las muestras originales, 1:10 y 1: 100 diluciones en placas de agar YPD en duplicado. </li><li> Incubar las placas durante 2 días a 37 ° C y contar UFC. </li><li> Contar las colonias cultivadas en placas de agar YPD (cantidad numerable de colonias, máximo 300 colonias / placa) y multiplicarlos por el Dilu adecuadafactor de la (1x-original, 10x o 100x dilución). Además multiplicar cada pieza catéter por 10 veces, lo que se corresponde con el importe final de las colonias en el tubo 1 ml que contiene el catéter. Llevar el importe final de las colonias para registrar 10 células / pieza catéter con una desviación estándar (DE). Expresar datos como media ± desviación estándar. </li><li> Coloque todos los valores para cada catéter y grupo específico en una y / o programa estadístico hoja de cálculo, para realizar los cálculos y análisis estadísticos mencionados anteriormente. Indique grupos específicos para comparar, es decir, WT vs. mutante o 2 días frente. 6 días de formación de biofilm y realizar la prueba t no pareada y ANOVA con Tukey post-test en los datos log10-transformado. <ol><li> Expresar el nivel de significación por un valor de p. En este estudio indican significación si p &lt;0.05, representada de la siguiente manera: * p &lt;0.05, ** p &lt;0,005, *** p &lt;0,0005. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El uso de modelos animales, y especialmente los modelos de roedores, los estudios dedicados a las biopelículas microbianas es muy importante ya que el sistema inmune del huésped es un factor esencial en la formación de biopelículas que los modelos in vitro no pueden explicar. En este estudio, se describe un relativamente sencillo subcutánea C. albicans biofilm modelo de ratón, que puede ser fácilmente adoptada en un laboratorio de investigación y no requiere fuertes habilidades técnicas. Este ...

Candida albicans es un organismo comensal, que se puede encontrar en diferentes sitios de individuos sanos, por ejemplo sobre la piel o como una parte de la flora gastrointestinal y vaginales. Sin embargo, en hospitalizados, y sobre todo pacientes inmunodeprimidos, puede causar una amplia gama de infecciones 1. En estos individuos, el sistema inmunológico debilitado permite que las células de Candida para difundir en el torrente sanguíneo y que invaden los tejidos más profundos que causan las infecciones que amenazan la vida. Además, la presencia de sustratos abióticos tales como catéteres venosos centrales y urinarios, válvulas cardíacas artificiales y las articulaciones puede proporcionar un nicho para Candida fijación 2. La adhesión a tales sustratos es un requisito previo para el desarrollo de biopelículas, que representa una capa de células de levadura y de hifas embebidos en el material polimérico extracelular, que consiste principalmente de polisacáridos 2. C. infecciones por catéter -asociado albicansestán asociados con una alta tasa de mortalidad. Una característica general de las biopelículas es su disminución de la susceptibilidad a los antifúngicos conocidos, tales como azoles 3,4. Sólo nuevas clases de fármacos antifúngicos, tales como las equinocandinas y la formulación liposomal de anfotericina B demostraron ser activos contra las infecciones asociadas al catéter 5-7. Debido a la resistencia a los antifúngicos biofilm, los enfoques terapéuticos son muy limitados, a menudo conduce a la retirada de la sonda y su posterior reemplazo como solución única. La mayor parte de nuestra comprensión actual de C. desarrollo de la biopelícula albicans origina a partir de los estudios in vitro sobre sustratos abióticos tales como poliestireno o plásticos utilizados para la fabricación de los dispositivos anteriormente mencionados, es decir, silicona, poliuretano 2. Estos modelos son bastante avanzada y tratar de imitar la situación in vivo tan estrechamente como sea posible. Sin embargo, estos sistemas no implican el flujo de sangre continuo y tque el sistema inmune del huésped. Esto resultó en el desarrollo de sistemas de modelos in vivo, tales como el modelo de catéter venoso central (CVC) 8-10, el modelo estomatitis protésica de la candidiasis oral 11 y un modelo murino para asociada al catéter candiduria 12. Adicionalmente, C. desarrollo de la biopelícula albicans se estudió in vivo en las superficies de las mucosas, tales como las de la vagina 13 y la cavidad oral 14. Nuestro laboratorio contribuyó con la creación de un C. subcutánea modelo de biofilm albicans, que se basa en el implante de piezas catéter infectado en la parte posterior de las ratas Sprague Dawley 15. Este modelo fue utilizado con éxito en nuestro laboratorio para probar la susceptibilidad biofilm al fluconazol y equinocandina drogas 5,16, para estudiar el efecto de la terapia combinatoria de diclofenaco y caspofungina 17. Más recientemente, se adaptó este sistema para su uso en ratones BALB / c 18,19. Encomparación con otros modelos in vivo, la principal ventaja de este modelo subcutánea es la posibilidad de estudiar múltiples biofilms por animal desarrollado en el interior del lumen de piezas catéter implantado. Para reducir el número de animales de laboratorio, hemos adaptado este modelo para estudiar el desarrollo de C. albicans biofilms no invasiva mediante el uso de imágenes de bioluminiscencia (BLI) 18,19. Este método ha demostrado ser una técnica poderosa, que puede ser utilizado para cuantificar las biopelículas mediante la medición de la señal específica BLI en la región de interés (en nuestro caso, el área de catéteres implantados), evitando el sacrificio de animales. En comparación con las bacterias, que puede expresar tanto el gen y el sustrato necesario para la reacción de bioluminiscencia debido a la introducción de un operón lux específica 20, la mayoría de los organismos eucariotas, incluyendo C. albicans, son dependientes de la expresión heteróloga de un gen de la luciferasa, junto con eladministración externa de un sustrato específico, tal como D-luciferina o coelenterazina 21. Probablemente debido a la presencia de la pared celular fúngica y C. morfogénesis albicans, el suministro intracelular del sustrato para la enzima luciferasa fue un reto principal 21. A fin de resolver este problema, Enjalbert et al. 22 diseñado una cepa donde un C. sintética albicans versión codón optimizado del gen para la secretada de forma natural Gaussia princeps luciferasa (gluc) se fusionó a la C. gen albicans PGA59, un GPI- anclado proteínas de la pared celular. Debido a la presencia de la luciferasa en la pared celular, los problemas relativos a la disponibilidad intracelular del sustrato podrían evitarse. Este sistema fue utilizado en particular para estudiar infecciones superficiales causadas por C. 22 albicans. Muy recientemente, BLI también fue utilizado para seguir la progresión de la candidiasis orofaríngea y su possible tratamiento 23. Estos hallazgos apoyan el uso de BLI como una técnica prometedora para estudiar infecciones causadas por las células de vida libre, sino también las infecciones asociadas a dispositivos. En este estudio, se describe la C. el desarrollo del biofilm albicans en piezas de catéter de poliuretano en ratones Balb / C y su cuantificación mediante BLI. Proporcionamos un protocolo detallado de la colonización in vitro de los catéteres de poliuretano durante el período de adherencia seguida de la implantación en ratones y el desarrollo de biopelículas posterior de animales vivos. Además de la medición de la señal emitida por el BLI C. albicans células, que también determinan el unidades formadoras de colonias para la comparación con la técnica estándar para la carga fúngica biofilm cuantificación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Yeast extract granulated</td>
			<td style="width:199px;">Merck</td>
			<td style="width:113px;">MERC1.03753.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:199px;">Oxoid</td>
			<td style="width:113px;">LP037B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Agar granulated</td>
			<td style="width:199px;">Difco</td>
			<td style="width:113px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">D-(+)-glucose</td>
			<td style="width:199px;">Fluka</td>
			<td style="width:113px;">49159-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Prepared in the laboratory</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">R6504-1L</td>
			<td>Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">M1254</td>
			<td>MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)&#160;</td>
			<td style="width:199px;">BBraun</td>
			<td style="width:113px;">CV-15703</td>
			<td>Polyurethane part cut into 1 cm pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:199px;">Fagron SAS, France</td>
			<td style="width:113px;">611139</td>
			<td>Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Duchefa Biochemie, The Netherlands</td>
			<td style="width:113px;">A0104</td>
			<td>Antibacterial prophylaxis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Ketamine 1000</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">804 119</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Domitor</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">134737-1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Antisedan</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">134783-2</td>
			<td>Reversal of anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Xylocaine gel (2%) - this is Linisol</td>
			<td style="width:199px;">AstraZeneca</td>
			<td style="width:113px;">352 1206</td>
			<td>Local anesthetic for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>To prevent drying and infection of eyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Coelenterazine&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Prolume (Nanolight)</td>
			<td style="width:113px;">NF-CTZ-FB</td>
			<td>Light sensitive agent (must be kept in the dark)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodine isopropanol (1%)</td>
			<td style="width:199px;">3M&#8482; DuraPrep&#8482;&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Disinfectant for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.&#160;&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Cedium</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Disinfectant for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Cell counting chamber</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Insulin syringes (0.3 ml)</td>
			<td style="width:199px;">Terumo Myjector 29G</td>
			<td style="width:113px;">324826</td>
			<td>For injection of coelenterazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Electric razor</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>For small animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Sterile surgical tools</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Heating pad</td>
			<td style="width:199px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">14042321474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Skin suture</td>
			<td style="width:199px;">Johnson&#38;Johnson</td>
			<td style="width:113px;">K890H</td>
			<td>Surgical thread, needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath sonicator</td>
			<td>Branson 2210</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">BLI camera (IVIS Spectrum)&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Perkin Elmer, Alameda</td>
			<td style="width:113px;">IVISSPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Living Image software&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Perkin Elmer, Alameda</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>(version 4.2)&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging

Candida albicans desarrollo de biopelículas en superficies bióticos y / o abióticos representa una amenaza específica para los pacientes hospitalizados. Hasta ahora, C. biofilms albicans se han estudiado principalmente in vitro, pero hay una necesidad crucial para una mejor comprensión de este proceso dinámico en condiciones in vivo. Hemos desarrollado un modelo de rata subcutánea en vivo para estudiar C. la formación de biopelículas albicans. En nuestro modelo, múltiple (hasta 9) dispositivos infectados por Candida se implantan a la parte trasera del animal. Esto nos da una gran ventaja sobre el modelo de sistema de catéter venoso central, ya que nos permite estudiar varios biofilms independientes en un solo animal. Recientemente, hemos adaptado este modelo para estudiar C. el desarrollo del biofilm albicans en ratones Balb / c. En este modelo, madurar C. biofilms albicans se desarrollan dentro de 48 horas y demuestran la arquitectura de las biopelículas tridimensional típico. La cuantificación de biofilm fúngicaes tradicionalmente analizada post mortem y requiere sacrificio anfitrión. Debido a que este requiere el uso de muchos animales para llevar a cabo estudios cinéticos, se aplicó imágenes de bioluminiscencia no invasiva (BLI) longitudinalmente seguimiento in vivo madurar C. albicans biofilms desarrollar en nuestro modelo subcutánea. C. albicans células fueron diseñados para expresar el gen de la luciferasa Gaussia princeps (gluc) unido a la pared celular. La señal de bioluminiscencia es producido por la luciferasa que convierte la coelenterazina sustrato añadido a la luz que se puede medir. La señal de BLI parecía recuentos de células obtenidas de catéteres explantadas. Imagen no invasivas para la cuantificación de la formación de biopelículas vivo ofrece aplicaciones inmediatas para la selección y validación de fármacos antifúngicos en condiciones in vivo, así como para los estudios basados ​​en las interacciones huésped-patógeno, por este medio que contribuye a un mejor entenderción de la patogénesis de las infecciones asociadas al catéter.

En este estudio, mostramos el procedimiento quirúrgico de implante de catéter y explante in vivo durante el desarrollo de C. albicans biofilm en un ratón. Además, se muestra la cuantificación de los biofilms maduros no sólo por la enumeración UFC clásica, sino también por BLI. Como se muestra en la Figura 1A, no fosforescentes piezas catéter de poliuretano se cortaron en dispositivos 1 cm y posteriormente recubiertas con suero. Este paso es muy im...

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Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Candida albicans biopelícula Desarrollo de Cuerpos Extraños médicamente relevantes en un modelo de ratón subcutánea Seguido por bioluminiscencia Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

12.9K vistas.  Institute of Botany and Microbiology, VIB, KU Leuven. We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

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Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence imaging using IVIS Spectrum was employed to monitor the distribution and development of the tumor cells following the delivery procedure including DLIT reconstruction to measure the tumor signal and its location.
Development of metastatic lesions to the bone tissues triggers osteolytic activity and lesions to tibia and femur were evaluated longitudinally using micro CT. Imaging was performed using a Quantum FX micro CT system with fast imaging and low X-ray dose. The low radiation dose allows multiple imaging sessions to be performed with a cumulative X-ray dosage far below LD50. A mouse imaging shuttle device was used to sequentially image the mice with both IVIS Spectrum and Quantum FX achieving accurate animal positioning in both the bioluminescence and CT images. The optical and CT data sets were co-registered in 3-dimentions using the Living Image 4.1 software. This multi-mode approach allows close monitoring of tumor growth and development simultaneously with osteolytic activity.

An experimental mouse model of bone metastasis was established following intracardiac delivery of luciferase expressing mammary tumor cells. Tumor development and resulted osteolytic lesion were monitored longitudinally with bioluminescence and micro CT imaging.

Monitoreo metástasis tumorales y lesiones osteolíticas con bioluminiscencia y Micro Imágenes de TC

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

Investigación

Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 months. It is critical to have suitable animal models to mimic the hemodynamic spread of the metastatic cells in the clinical scenario. Here, we are introducing the use of small animal ultrasound imaging to guide an accurate injection of brain tropical breast cancer cells into the left ventricle of athymic nude mice. Longitudinal MRI is used to assessing intracranial initiation and growth of brain metastases. Ultrasound-guided intracardiac injection ensures not only an accurate injection and hereby a higher successful rate but also significantly decreased mortality rate, as compared to our previous manual procedure. In vivo high resolution MRI allows the visualization of hyperintense multifocal lesions, as small as 310 &#181;m in diameter on T2-weighted images at 3 weeks post injection. Follow-up MRI reveals intracranial tumor growth and increased number of metastases that distribute throughout the whole brain.

A breast cancer brain metastasis mouse model is established with ultrasound imaging-guided intracardiac injection of MDA-MB231/Br-GFP cells. Development of multifocal intracranial metastases has been monitored longitudinally using high-resolution 9.4 T MRI.

Guiada por imagen de ultrasonido de inyección intracardiaca de desarrollar un modelo de ratón de cáncer de mama metástasis cerebrales Seguido por Longitudinal MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Trauma cerebral aguda en ratones seguido de Longitudinal dos fotones de imágenes

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Evaluación de tumor infiltrante de leucocitos subconjuntos en un modelo de tumor subcutáneo

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

La bioluminiscencia de imágenes de un Modelo inmunocompetentes Animal para Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Un ratón neonatal lesión de médula espinal de compresión Modelo

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...