La enumeración de las unidades formadoras de colonias estaba limitando la reproducibilidad de la investigación en el campo de la ITU. Las imágenes de bioluminiscencia avanzarán en la investigación in vivo de la ITU sobre la fisiología de la vejiga, la patogénesis de la ITU y la susceptibilidad. Las imágenes de bioluminiscencia permiten un seguimiento longitudinal con información en tiempo real sobre la evolución de la infección.
Además, reduce drásticamente el número de animales necesarios. Las imágenes de bioluminiscencia facilitan la investigación sobre infecciones recurrentes o crónicas, que son frecuentes en humanos. Además, los investigadores pueden identificar infecciones ascendentes o diseminación a la sangre utilizando imágenes de bioluminiscencia.
Obtenga colonias individuales eliminando el stock de glicerol de bacterias con un bucle de inoculación en placas LB suplementadas con sulfato de kanamicina, y cultivando durante la noche a 37 grados centígrados. Llene un tubo inferior redondo estéril de poliestireno de 14 mililitros, con tapas de doble posición con cinco mililitros de caldo LB suplementado con sulfato de kanamicina. Elija una sola colonia bacteriana con un bucle de inoculación y agréguela al caldo LB.
Vórtice durante 10 segundos para garantizar una mezcla adecuada. Cultive estáticamente con la tapa de ajuste en la posición abierta a 37 grados centígrados durante la noche. Después de la incubación, vórtice el tubo durante 10 segundos para garantizar la homogeneización adecuada del cultivo bacteriano.
Hacer un subcultivo en el Erlenmeyer añadiendo 25 microlitros de la suspensión bacteriana a 25 mililitros de lb medio fresco sin antibióticos. Cierre el Erlenmeyer y el cultivo estáticamente durante la noche. El día de la instalación, vierta el cultivo del Erlennmeyer en un tubo de cultivo de 50 mililitros y centrífuga.
Decantar el sobrenadante y resuspend el pellet bacteriano en 10 mililitros de PBS estéril. Vuelva a vórtice el tubo durante 10 segundos. Elija la concentración experimental del inóculo y determine el OD correspondiente a 600 nanómetros utilizando la curva estándar.
Agregue un mililitro del cultivo bacteriano resuspendido en nueve mililitros de PBS estéril y ajuste hasta que se alcance el OD 600 nanómetro deseado. Monte una punta estéril de angiocatéter calibre 24 en una jeringa de 100 microlitros. Llene la jeringa con la solución bacteriana preparada.
Coloque un animal en una superficie de trabajo en posición supina y mantenga una anestesia estable de isoflurano utilizando un cono nasal durante la instalación. Aplique el ungüento para los ojos. Expulse la orina residual aplicando una compresión suave y haciendo movimientos circulares en la región suprapúbica, luego limpie la parte inferior del abdomen con etanol al 70%.
Lubrique la punta del catéter con solución salina normal. Coloque el dedo índice sobre la mano no dominante en el abdomen y empuje suavemente hacia arriba. Comience el cateterismo de la uretra verticalmente en un ángulo de 90 grados.
Una vez que se encuentre resistencia, inclínelo horizontalmente antes de insertarlo más. Realice una instalación lenta de 50 microlitros del inóculo bacteriano. Después de la instalación, mantenga la jeringa y el catéter en su lugar durante unos segundos más y luego retraiga lentamente para evitar fugas.
Utilice un catéter por grupo experimental. Coloque al animal en posición supina en el cono de la nariz para prepararlo para la obtención de imágenes y prepárelo para la obtención de imágenes utilizando un catéter por grupo experimental. Si es necesario, administrar antibióticos o medicamentos experimentales, como se menciona en el manuscrito de texto.
Abra el software de adquisición BLI y haga clic en Inicializar en el dispositivo de imágenes para probar la cámara y el sistema de controlador de escenario y para enfriar la cámara del dispositivo de carga acoplada a menos 90 grados centígrados. Haga clic en Adquisición, Guardar automáticamente para.Seleccione luminiscencia y fotografía. Compruebe la configuración luminiscente predeterminada configurando el filtro de excitación en Bloquear y el filtro de emisión en Abrir.
Establezca el tiempo de exposición en automático al tomar la primera imagen. Para mediciones in vivo y señales brillantes, establezca el tiempo de exposición en alrededor de 30 segundos. Reduzca el tiempo de exposición si aparece una advertencia debido a una imagen saturada.
Seleccione el binning medio, F/stop one, y elija el FOV correcto. Establezca la altura del sujeto en un centímetro al obtener imágenes de ratones. Imagine hasta cinco millas simultáneamente y separe a los animales usando el deflector de luz para evitar la reflexión.
Cierre la puerta y haga clic en Adquirir para iniciar la secuencia de imágenes, luego complete la información detallada sobre el experimento. Retire los ratones de la cámara de imágenes y devuélvalos a su jaula. Verifique la recuperación completa después de la anestesia, luego devuelva las jaulas a las rejillas ventiladas hasta el siguiente ciclo de imágenes.
Inicie el software de imágenes y cargue el archivo experimental haciendo clic en Examinar. Utilice la paleta de herramientas para ajustar la escala de colores de la imagen. Utilice las herramientas de ROI para dibujar una región de interés en la imagen, asegurándose de que sea lo suficientemente grande como para cubrir el área completa y utilizando las mismas dimensiones para todas las imágenes.
Luego haga clic en medición de ROI para cuantificar la intensidad de la luz. Las imágenes posteriores de ratones obtenidas inmediatamente después de la instalación mostraron que era robustamente detectable por encima de 20.000 unidades formadoras de colonias, y se estableció una correlación lineal entre las unidades formadoras de colonias del inóculo y la bioluminiscencia in vivo. La evolución natural de una infección urinaria se estudió en un grupo control que no recibió ningún tratamiento.
El efecto del tratamiento antibiótico sobre la cinética de la infección se visualizó en detalle en un grupo de animales tratados con antibióticos. Se observó una disminución inmediata de la carga bacteriana, medida por el flujo total de fotones, después de la primera dosis de enrofloxacina. Ninguno de los animales tratados tuvo un aumento posterior de la carga bacteriana.
La carga bacteriana global de cada animal se calculó utilizando el área bajo la curva del flujo total de fotones transformado en logaribo, mostrando una diferencia significativa entre los animales tratados con Enrofloxacina y los animales no tratados en el transcurso de 10 días. Estos resultados proporcionan una prueba de concepto de que BLI se puede utilizar para evaluar las diferencias en la cinética de la infección por ITU. La imagen de bioluminiscencia es una técnica no invasiva que se puede combinar con otros métodos, como la recolección regular de muestras urinarias para análisis bacterianos o bioquímicos o para los experimentos.
Aquí hemos demostrado que las imágenes de bioluminiscencia son una herramienta poderosa para evaluar nuevas estrategias terapéuticas sobre el curso de la enfermedad de las infecciones del tracto urinario.
