Los autores agradecen a los miembros Cirillo laboratorio valiosa para los debates y la asistencia a lo largo de este estudio. Agradecemos al Dr. Joshua Hill y el laboratorio del doctor James Samuel para obtener ayuda con durante el rodaje de este protocolo. Este trabajo fue financiado por la beca 48523 de la Fundación Bill &amp; Melinda Gates Foundation y AI47866 beca de los Institutos Nacionales de Salud.

1. La infección pulmonar por la intubación intratraqueal <ol><li> Pesar los ratones y, opcionalmente, se pueden hacer marcas en las orejas para una fácil identificación. </li><li> Anestesiar a los ratones con ketamina (100 mg por g de peso del ratón) y xilazina (10 mg por gramo de peso del ratón) mediante la inoculación intraperitoneal. </li><li> Ratones a cabo en jaulas hasta que esté completamente anestesiado. Apriete las almohadillas de sus patas para revisar pedal reflejo. Los ratones deben mostrar reducido o sin reacción refleja. </li><li> Coloque el ratón en el stand de la intubación acostado sobre su espalda. </li><li> Fijar una banda de goma para la intubación de pie y luego se coloca en los incisivos superiores del ratón. Utilice cinta adhesiva para fijar las piernas y los brazos en el stand de la intubación. </li><li> Suavemente mueva Tougue de la boca con unas pinzas. </li><li> Introduzca el espéculo dentro de octoscope de la boca y mirar en la orofaringe hasta la apertura de la laringe es visible. </li><li> Alambre de guía de avance cubierto con cathether en la tráquea hasta catether centro se encuentra en los incisivos. Retire el cable de guía. Poner aire en cathether para observar la expansión del tórax y confirmar la correcta intubación. </li><li> Inyectar 50 L de bacterias (en las imágenes mostradas se utilizó el bacilo de Calmette Guerin (BCG) que expresa clic escarabajo rojo luciferasa (CBRLuc), construido en nuestro laboratorio, pero ninguna cepa bacteriana luminiscente puede ser utilizado) solución a través de cathether utilizando una jeringa de 1 ml. </li><li> Coloque el ratón en una jaula y observar durante la recuperación de la anestesia. </li></ol> 2. Animal anestesia y preparación para imágenes de bioluminiscencia Los ratones son anestesiados con isoflurano con el XGI-8 Sistema de Gas Aneshesia. <ol><li> Antes de utilizar la XGI-8 sistema de anestesia, pesar cada recipiente de filtro de carbón y escribir el peso y la fecha de la misma. Si el peso es 50 gramos más del peso inicial, reemplazarlo con un nuevo envase. </li><li> Comprobar el nivel de isoflurano en el vaporizador y rellene si es necesario. </li><li> Encienda la bomba de evacuación en la parte delantera de la XGI-8 sistema de anestesia y se puso a 8 lpm (litros por minuite). </li><li> Abra el suministro de oxígeno del cilindro de alta presión y la puso a 55 psig. </li><li> Encienda el oxígeno cambiar (verde) en la parte frontal del sistema de anestesia XGI-8. </li><li> A su vez el flujo de gas a la cámara de imagen para ajustar el nivel de flujo de gas. Se establece en 0,25 lpm y luego apagar el flujo de gas. </li><li> A su vez el flujo de gas a la cámara de inducción de la anestesia para establecer el nivel de flujo de gas. A 1.5 lpm y luego apagar el flujo de gas. </li><li> Encienda el isoflurano con el vaporizador y se puso a 2-2,5 por ciento. El nivel de isoflurano puede ser ajustado en función del número de animales utilizados y el peso. </li><li> Ratones lugar en la cámara de inducción y cierre la tapa. A su vez el flujo de gas a la cámara de inducción. Ratones lugar en la cámara de 5 a 10 minuites hasta que se anestesiar por completo. </li><li> Aplique un ungüento ópticos de los ojos para proteger los ojos del ratón en la imagen y el lugar de los ratones en la cámara de imágenes en uno de los conos de ojiva en el colector de la anestesia. Use reflector lumínico entre los ratones para evitar el reflejo de la luz sobre los temas circundantes de animales. </li><li> Inyectar luciferina (150 mg / gramo de peso corporal) mediante la inoculación intraperitoneal. </li></ol> 3. Bioluminiscencia de imágenes <ol><li> Inicie el software de imágenes de vida. </li><li> Si el sistema no se inicia, inicializar el sistema de imágenes IVIS. </li><li> Establecer los parámetros de imagen, haga clic en configuración de la secuencia en el panel de control de la adquisición de IVIS. Seleccione la luminiscencia y la fotografía en el modo de imagen. Si la opción de llevar a cabo DLIT reconstrucción 3D se desea, seleccionar las imágenes fotográficas de luz, luminosa y estructurales, como parte de la secuencia de imágenes. Establecer el tiempo de exposición de 0,5 segundos a 10 minutos. Establecer Binning y F / parada según el brillo de espera de la muestra. Set de excitación filtro para bloquear y filtrar las emisiones de abrir, a menos que la planificación de la adquisición de longitudes de onda de luz específicas solamente. En el caso de DLIT 3D Constitución, establece varios filtros de emisión de diferentes longitudes de onda para permitir una localización precisa de la fuente. FOV conjunto de la A a D, dependiendo del número de ratones o región de origen animal a explorar. Seleccione A y B de un ratón, ratones C por 2-3, 4-5 y D para los ratones. </li><li> Haga clic en Agregar en el Asistente para imágenes en el Panel de Control de Adquisición de añadir la configuración de la secuencia. </li><li> Inicio de la secuencia de imágenes haciendo clic en adquirir. En el caso de DLIT construcción en 3D, imágenes luminosas serán adquiridas por múltiples filtros de emisión en longitudes de onda diferentes. Imágenes de luz fotográfica y estructurado también se adquirirán. </li><li> Durante la adquisición de la imagen y editar los niveles de la imagen paneles serán visibles. Rellene la información más detallada posible para cada experimento en edición de imágenes para asegurar un fácil seguimiento de las imágenes en los últimos tiempos y guardar sus imágenes. </li><li> ReRemove a los ratones de IVIS imágenes de cámara y devolverlos a sus jaulas. Observar la recuperación de unaestesis para asegurar los ratones no se vieron afectados significativamente por el procedimiento. Los animales deben ser monitoreados constantemente hasta que se recupera de la anestesia (generalmente 1-2 min). </li></ol> 4. Ex vivo de imágenes y análisis de UFC para la cuantificación de bacterias en los pulmones <ol><li> Se inyecta por vía intraperitoneal a ratones con luciferina de la misma manera que para la imagen, justo antes de la eutanasia. </li><li> La eutanasia a los ratones por inyección intraperitoneal de 100 mg / kg pentobarbitol 5 min después de la inyección luciferina. </li><li> Explante de los pulmones de los ratones y el lugar en placas petri estéril con pinzas estériles y tijeras. </li><li> Colocar petri plato que contiene órgano explantado en las imágenes de cámara y obtener imágenes de bioluminiscencia en la misma forma que para el ratón entero. </li><li> Después de la imagen, eliminar órganos explantados de placa de Petri con pinzas estériles y homogeneizar en 1 ml de PBS. </li><li> Hacer diluciones y el tejido de la placa de los medios selectivos apropiados. Tejido homogeneizado se pueden almacenar -80 ° C para volver a las placas, deberá de ser necesario. Por otra parte, el tejido homogeneizado se puede utilizar para la extracción de ADN o ARN para cuantificar el número de bacterias por qPCR. </li></ol> 5. Análisis de imágenes de luminiscencia <ol><li> Inicio »Software de estar imagen&quot; y navegar por los archivos de imagen. </li><li> Use &quot;paleta de herramientas para ajustar las imágenes. Haga clic en Ajuste de imagen para modificar la corrección / configuración de filtrado y min / max para las escalas de color. </li><li> Utilice las herramientas de ROI en la lista desplegable para la cuantificación de la intensidad de la luz. Seleccione la forma retorno de la inversión, el número y tamaño. Arrastre ROI marco de la región de interés en la imagen. Asegúrese de que todos ROI son del mismo tamaño y forma. Haga clic en el ROI de medición y guardar, copiar y / o exportación de datos cuantitativos. </li><li> En el caso de DLIT reconstrucciones en 3D, la carga de secuencia de imágenes incluyendo la imagen de luz estructurada. Haga clic en topografía de la superficie de la herramienta de Platte. En la lista desplegable, seleccione la ficha Reconstruir para generar la topografía de la superficie. Un lío superficie aparecerá en la ventana. </li><li> Seleccione la reconstrucción DLIT 3D en la herramienta de Platte. En la lista desplegable, seleccione la pestaña Propiedades para establecer las propiedades de los tejidos y el espectro de la fuente. Muscular se recomienda en la mayoría de las circunstancias. En la lista desplegable, haga clic en la ficha Analizar para seleccionar la longitud de onda para el análisis. Haga clic en la pestaña de parámetros y confirmar los valores por defecto o ajustar los parámetros de DLIT si es necesario. Haga clic en Reconstruir ficha para iniciar el análisis en 3D. </li><li> Cuando la reconstrucción 3D está terminado, la vista 3D se muestran los resultados de la reconstrucción en 3D. Haga clic en la ficha de resultados para ver el análisis de datos de densidad de fotones, voxels y los parámetros DLIT algoritmo. </li><li> Guardar y / o exportar los resultados de los análisis de la reconstrucción 3D en figuras y archivos de datos. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Las imágenes de bioluminiscencia de los ratones infectados con bacterias bioluminiscentes, junto con un control del ratón no infectado se muestra en la Figura 1. La pulmonar ratones infectados con bacterias bioluminiscentes producir una señal significativa de los pulmones (Figura 1). La intensidad de la luminiscencia se cuantifica como flujo total dentro de un ROI (región de interés) (Figura 2). Los datos cuantitativos para la intensidad de la luz está normalizado para las unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias obtenidas de los pulmones para confirmar que la señal es producida por las bacterias bioluminiscentes y pueden ser comparados con el control negativo. La ubicación y la intensidad de la señal pueden ser analizados por DLIT reconstrucción en 3D de la fuente de luminiscencia sobre la base de la tomografía de la superficie del ratón 11. Estos análisis permiten la cuantificación y localización de la señal de bioluminiscencia producida. Los resultados de la reconstrucción en 3D de una fuente luminosa en ratones infectados demuestra que la luz es producida a partir de los pulmones del ratón (Figura 3). Las imágenes ex vivo de los pulmones de los ratones resultantes confirman que la luminiscencia se emite desde los pulmones, en lugar de algún otro tejido u órgano estrechamente yuxtapuestos (Figura 2C). <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Imágenes de luminiscencia pulmonar ratones infectados con bacterias bioluminiscentes etiquetados con CBRluc. Control del ratón no infectado es a la izquierda y dos ratones infectados están a la derecha. Los ratones fueron infectados con bacterias que expresan CBRluc (n = 2) a través de la vía intratraqueal. 10 minutos después de la inyección luciferina, las imágenes de luminiscencia fueron adquiridas por 10 min a 4 posiciones: dorsal, ventral lateral, izquierda y derecha. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La intensidad de la luz cuantitativa de los ratones infectados con bacterias que expresan CBRluc. (A, B) imágenes de luminiscencia de análisis de retorno de la inversión y el flujo total de cuantificar la luz de retorno de la inversión en posiciones dorsal y ventral, respectivamente. Los ratones no infectados están a la izquierda y dos ratones infectados están a la derecha. Luminiscencia imágenes fueron adquiridas de los pulmones of ratones no infectados e infectados con CBRlux (n = 2). La intensidad de la luz alrededor de los pulmones se cuantificó mediante el análisis de retorno de la inversión. C) ex vivo imágenes de pulmones infectados (arriba) e infectados (abajo, dos conjuntos de los pulmones) de los ratones. Luciferina se inyectó 5 miniuts antes de la eutanasia y las imágenes fueron adquiridas. Los valores cuantificados se normalizan a UFC. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. La reconstrucción en 3D de la fuente de la bioluminiscencia (s) de un ratón infectado pulmonar. El ratón fue infectado con bacterias que expresan CBRluc por inyección intratraqueal. La secuencia de imagen fue adquirida el uso de filtros diferentes longitudes de onda de emisión de la serie de 540 nm a 700 nm. Una secuencia de imágenes se utilizó para la reconstitución en 3D para la fuente de luminiscencia en sujetos animales que contenía una imag estructurado. A) La tomografía de mouse se muestra en diferentes posiciones: delante, detrás, izquierda y derecha. Las fuentes de luz se muestran como voxels (cajas de color rojo dentro del ratón 3D) que se encuentran dentro de los pulmones según lo determinado por la reconstrucción. B) Photon densiy mapa de los datos medidos y simulados. Comparando las curvas de fotones medidos y simulados densidad proporcionar la información de la calidad de la reconstrucción. Reconstrucciones de buena calidad como resultado densidades similares fotones medidos y simulados.

<ol>
	<li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence.">Bioluminescence.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).</li><li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression.">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+coding+click+beetle+luciferases+can+elicit+bioluminescence+of+different+colors.">Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors.</a> Science. 244, 700-702 (1989).</li><li>Wet, J. R. d. e., Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+firefly+luciferase+cDNA+and+the+expression+of+active+luciferase+in+Escherichia+coli.">Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).</li><li>Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistries+and+colors+of+bioluminescent+reactions:+a+review.">Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review.</a> Gene. 173, 5-11 (1996).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo.">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).</li><li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li><li>Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li><li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).</li><li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging.">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).</li></ol>

Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Texas A &amp; M University.

Aunque después de estos protocolos por lo general resultan en imágenes de alta calidad, es importante tener en cuenta algunas cuestiones clave con el fin de obtener datos precisos y consistentes de los estudios de imagen. Imágenes de luminiscencia se deben adquirir que cuenta con entre 600 y 60.000 para asegurar que la señal está por encima de fondo y la cámara no está saturado. Si la señal obtenida es inferior a 600 las condiciones de exposición debe ser ajustada para aumentar el recuento. Si la señal obtenid...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VETONE</td>
<td>501027 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Butler animal health supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>158307</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GMT</td>
<td>LUCK-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal plus solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VOR tech pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cathether (22G x 1&#x201D;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TERUMO</td>
<td>OX2225CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guide wire </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>210A3491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octocope with speculum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>000A3748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenogen IVIS system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XGI-8-gas Anesthsia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Living Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transparent nose cones</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light baffle divider </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using luciferase to image bacterial infections in mice

Imágenes es una técnica valiosa que puede ser usado para monitorear los procesos biológicos. En particular, la presencia de células cancerosas, las células madre, los tipos específicos de células inmunes, los patógenos virales, parásitos y bacterias se pueden seguir en tiempo real en que viven los animales 1-2. Aplicación de imágenes de bioluminiscencia para el estudio de patógenos tiene ventajas en comparación con las estrategias convencionales para el análisis de las infecciones en modelos animales 3-4. Las infecciones pueden ser visualizados en animales individuales a través del tiempo, sin necesidad de la eutanasia para determinar la ubicación y la cantidad del patógeno. Imagen óptica que permite la evaluación integral de todos los tejidos y órganos, en lugar de muestreo de los sitios previamente sabe que están infectados. Además, la exactitud de la inoculación en tejidos específicos puede determinarse directamente antes de llevar adelante los animales que fueron inoculados sin éxito durante todo el experimento. Variabilidad entre animales puede ser controlada, ya que permite imágenes de cada animal que han de seguirse por separado. Imágenes tiene el potencial de reducir considerablemente el número de animales necesarios debido a la capacidad de obtener datos de los puntos de tiempo sin tener que numerosas muestras de tejidos para determinar la carga de patógenos 4.3. Este protocolo describe los métodos para visualizar las infecciones en los animales vivos con imágenes de bioluminiscencia de las cepas recombinantes de bacterias que expresan luciferasa. El escarabajo clic (CBRLuc) y luciferasas luciérnaga (FFluc) utilizan como sustrato luciferina 5-6. La luz producida por las dos CBRluc y FFluc tiene una longitud de onda amplia de 500 nm a 700 nm, por lo que esos reporteros luciferasas excelente para la obtención de imágenes ópticas en modelos animales vivos 7.9. Esto es principalmente porque las longitudes de onda de la luz superior a 600 nm se requieren para evitar la absorción por la hemoglobina y, por tanto, viajar a través de tejidos de mamíferos de manera eficiente. Luciferasa es genéticamente introducido en la bacteria para producir la señal de la luz 10. Los ratones son inoculados con la bacteria pulmonar bioluminiscentes intratraqueal para permitir el monitoreo de las infecciones en tiempo real. Después de la inyección luciferina, las imágenes se adquieren mediante el sistema de imágenes IVIS. Durante estas pruebas, los ratones son anestesiados con isoflurano con una XGI-8 Sistema de Gas Anethesia. Las imágenes pueden ser analizadas para localizar y cuantificar la fuente de señal, lo que representa el sitio de la infección bacteriana (s) y el número, respectivamente. Después de la filmación, la determinación de UFC se lleva a cabo en el tejido homogeneizado para confirmar la presencia de bacterias. Varias dosis de bacterias se utilizan para correlacionar el número de bacterias con luminiscencia. Imagen se puede aplicar al estudio de la patogénesis y la evaluación de la eficacia de los compuestos antibacterianos y vacunas.

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Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Métodos para obtener imágenes de bioluminiscencia de las infecciones bacterianas en los animales vivos se describen. Los patógenos son modificadas para expresar luciferasa permitiendo imágenes ópticas de todo el cuerpo de las infecciones en los animales vivos. Los modelos animales pueden ser infectados con agentes patógenos que expresan luciferasa y el curso de la enfermedad como resultado visualizado en tiempo real de imágenes de bioluminiscencia.

Luciferasa utilizando a las infecciones bacterianas de la imagen en ratones

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

using-luciferase-to-image-bacterial-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.3K vistas.  Texas A&M Health Science Center. Métodos para obtener imágenes de bioluminiscencia de las infecciones bacterianas en los animales vivos se describen. Los patógenos son modificadas para expresar luciferasa permitiendo imágenes ópticas de todo el cuerpo de las infecciones en los animales vivos. Los modelos animales pueden ser infectados con agentes patógenos que expresan luciferasa y el curso de la enfermedad como resultado visualizado en tiempo real de imágenes de bioluminiscencia.

Video: Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Evaluación de la respuesta estomática de las células bacterianas en vivo utilizando imágenes de Hoja Entera

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Investigación

Inmunología e Infección

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D de imágenes multimodalidad<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Las infecciones en ratones

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

Utilizando el protozoo Paramecium caudatum como un vehículo para las infecciones transmitidas por los alimentos en las larvas de pez cebra

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un alto rendimiento Shigella-ensayo bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...