We wish to thank Alison Dorsey for helping to develop the subretinal injection technique. We also acknowledge the National Eye Institute (NEI grants EY11254 and EY021416), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM grant TR1-01219), and the Lowy Medical Research Institute (LMRI) for very generous funding for this project.

NOTA: Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las normas éticas establecidas por el Instituto de Investigación Scripps. 1. Preparación de los materiales para la inyección (~ 20 min) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Solución de disociación celular Pre-caliente (preferiblemente uno que se inactiva a través de la dilución, no con suero), PBS estéril y medios de cultivo (Tabla 1). </li><li> Esterilizar la jeringa con una aguja de punta roma por el desmontaje y hervir las partes en agua durante 15 min. </li></ol> 2. Preparación de las células del EPR para inyección (~ 30 min a 1 hr) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Separe las células del EPR utilizando solución de disociación de células pre-calentado por 5-8 minutos a 37 ° C. </li><li> Raspe las células suavemente para liberar cualquier que todavía esté conectado. </li><li> Diluir las células con un gran volumen de medios de cultivo (llenar un tubo de 15 ml) para inactivar la solución de disociación y contarlos. </li><li> Centrifugar a 800 xg durante 5 min para sedimentar las células. </li><li> Resuspender las células a 200.000 células / l (para entregar 100.000 células en un volumen de 0,5 l) en PBS precalentado estéril y transferirlos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Opcionalmente, añada un marcador fluorescente transitoria de células vivas y se incuba a 37 ° C durante 30-45 min. </li><li> Cargar la jeringa con una aguja roma con 0,5 l de células. Inyectar las células tan pronto como sea posible. </li></ol> 3.-Sub retina Inyección (~ 5 min por inyección) NOTA: Si es posible, aprender la técnica con ratas albinas adultas desde los vasos del limbo son mucho más fáciles de visualizar. Inyectar solución verde cuando el aprendizaje rápido (antes de tratar de inyectar las células) para facilitar más fácilmente la visualización del sitio de la inyección. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Anestesiar el roedor. Utilice inyecciones intraperitoneales de 100 mg / ml de ketamina y 10 mg / ml de xilazina (20 l / 10 g cuerpo wocho) sobre la inhalación de isofluorano ya que es difícil de maniobrar el roedor y se inyecta en el ojo con el hocico en el inhalador. <ol><li> Asegúrese de que el animal se anestesió profundamente pellizcando una de sus patas. Si se estremece, esperar varios minutos y vuelva a intentarlo antes de comenzar la inyección subretiniana. </li></ol></li><li> Coloque el roedor a su lado para que el ojo que se inyecta se enfrenta el techo. </li><li> Bajo un microscopio de disección estirar suavemente la piel para que el ojo aparece ligeramente arriba de la toma (proptosis temporal) y se vuelve más accesible mediante la celebración de su cabeza con dos dedos justo por encima de la oreja y por su mandíbula y estirar suavemente la piel en paralelo a los párpados por lo que el ojo aparece ligeramente arriba de la toma (Ver Figura 1 C). No agarre el roedor demasiado cerca de la garganta. </li><li> Con una aguja previamente esterilizada desechable afilada 30 G, hacer un agujero justo debajo del limbo (si los vasos son golpeados, sangrado bE significativa y ser difícil de encontrar el agujero más adelante) y en un ángulo para evitar tocar la lente con la aguja (Figura 1D). Evite tocar la lente con la aguja (o roma) o la formación de cataratas inmediata va a producir. NOTA: Las inyecciones funcionan mejor con dos personas. De esta manera una persona puede pasar a la jeringa con la aguja roma a la persona que realiza la inyección después de haber creado el primer agujero con la aguja desechable afilado para mantener la atención en el dónde está el agujero. </li><li> Retraer la aguja desechable desde el ojo mientras se mantiene el agarre en la cabeza. Recuerde exactamente dónde está el agujero. </li><li> Después de cualquiera de montar la jeringa precargada con una aguja roma en un micromanipulador o sosteniéndolo con la mano, inserte la punta de la jeringa con la aguja roma a través del agujero, cuidando de nuevo de no tocar la lente, y empuje suavemente a través del ojo muy suavemente hasta sentir resistencia (Figura 1D). </li><li> Keeping todos los movimientos a un mínimo, inyectar cuidadosamente las células del EPR lentamente en el espacio subretiniano. NOTA: desprendimiento del EPR / retina se inducirá; esto es inevitable. Sin embargo, una inyección limpio minimiza el desprendimiento y mejora en gran medida las posibilidades de una reparación (Figura 1E). Cualquier movimientos exagerados pueden mover la aguja de nuevo en la retina, y movimientos laterales pueden dañar la retina. El uso de una bomba de inyección es opcional, pero permite una entrega muy precisa. </li><li> Retraer la jeringa lentamente. Aplicar hidratante gotas para los ojos para mantener el ojo hidratado. </li><li> Continúe controlando el animal hasta que recupera decúbito esternal. No deje de animales sin vigilancia o volver a una jaula con otros animales de alerta hasta que recupera decúbito esternal. </li></ol>

None of the authors have any commercial disclosures to declare.

En este artículo se describe un método relativamente simple para realizar inyecciones subretinianas de células del EPR en suspensión en ratas y ratones. El protocolo es fácil de aprender y más experiencia con la técnica se traducirá en un menor número de traumas (Figura 3, lo que representa uno de los mejores inyecciones), especialmente si se utiliza un micromanipulador (Figura 1A). Cualquier trauma se puede monitorizar in vivo con un sistema de cSLO y OCT (Fig...

The sensory retina is organized in functional tiers of neurons, glia, and endothelial cells. Photoreceptors at the back of the retina are activated by light; through phototransduction they convert photons into electrical signals that are refined by interneurons and transmitted to the visual cortex in the brain. Phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE are organized in a monolayer directly behind the photoreceptors and perform multiple and diverse functions integral to photoreceptor function and homeostasis. In fact, RPE and photoreceptors are so co-dependent that they are considered to be one functional unit. Death or dysfunction of RPE results in devastating secondary effects on photoreceptors and is associated with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly1,2.
While no cure has been discovered for AMD, several clinical studies have shown that RPE cell replacement may be a promising therapeutic option3-13. With the advent of stem cell technology, it is now possible to generate large numbers of RPE cells in vitro from embryonic and induced pluripotent stem cells (hES and hiPS) that strongly resemble their somatic counterparts functionally and anatomically14-26. Stem cell-derived RPE have also been shown to function in vivo by multiple independent groups, including our own, to significantly slow retinal degeneration in rat and mouse lines with spontaneous retinal degeneration16,18,21,22,25,28,29. This combination of clinical and preclinical supporting evidence is so compelling that several clinical trials to prevent retinal degeneration using stem cell-derived RPE cells are now ongoing30,31. 
RPE can be readily derived from hES and/or hiPS and implanted in the subretinal space of rodents using various derivation and injection techniques32,33. (See Westenskow et al. for a methods paper in multimedia format demonstrating the directed differentiation protocol we employ)34. There are critical remaining questions regarding the safety, survival, and functional capacity of exogenously delivered RPE cells upon implantation, therefore the ability to perform subretinal injections in rodents is a critical skill16,18,21,29,36,37. The delivery of RPE is not trivial, and the field is divided on the most effective injection technique. The protocol we describe here is a simple and effective way to deliver of bolus of RPE cells subretinally, and was used in the first clinical trial for stem cell-derived RPE transplantation31. (The reader may also refer to another JoVE article by Eberle et al. for an alternative depiction of subretinal injections in rodents.38) 
The technique outlined in this manuscript cannot be visualized and trauma is unavoidable (as with any subretinal injection technique). It is performed by making a hole just under the limbus vessels and inserting a blunt needle along a transscleral route to inject a bolus of cells under the diametrically opposed retina. The person doing the injection will feel resistance as the blunt needle touches the retina. The cells may be directly visualized after the injection, however, and the degree of the induced retinal detachment can be determined by labeling the RPE cells with a transient fluorescent marker and detecting them with a confocal scanning ophthalmoscope (cSLO). An optical coherence tomography (OCT) system can also be used to monitor the trauma and easily identify the injection site.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:419px;">Name of Material/ Equipment (A-Z)</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 mL x 1&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Scapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89260-222</td>
			<td>Case x 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CellTracker Green CMFDA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C34552</td>
			<td>50 ug x 20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>500 mL x 1&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258</td>
			<td>25 g x 1&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops&#160;</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>4060941</td>
			<td>25 mL x 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hamilton Model 62 RN SYR</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87942</td>
			<td>Syringe x 1&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Hamilton Needle 33 gauge, 0.5&#34;, point 3 (304 stainless steel)</td>
			<td style="width:145px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7803-05</td>
			<td>Needles x 6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>500 mL x 1&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>500 mL x 1&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>100 mL x 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:419px;">Magnetic Stand</td>
			<td style="width:145px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">39430216</td>
			<td>Stand x 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>100 mL x 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:419px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:145px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">3943001</td>
			<td>Manipulator x 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL x 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slip Tip Syringes without Needles BD&#160; (3 mL)&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309656</td>
			<td>Pack x 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Specialty-Use Needles BD&#160; (30 gauge, 1&#34;)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305128</td>
			<td>Box x 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>100 mL x 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension

La conversión de la luz en impulsos eléctricos se produce en la retina externa y se lleva a cabo en gran medida por conos y bastones fotorreceptores y células del epitelio pigmentario de la retina (RPE). RPE proporcionar apoyo crítico a los fotorreceptores y la muerte o la disfunción de las células del EPR es característico de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de la pérdida permanente de la visión en personas mayores de 55 años. Si bien no hay cura para la DMAE ha sido identificado, la implantación de RPE saludable en ojos enfermos puede llegar a ser un tratamiento efectivo, y un gran número de células del EPR puede generarse fácilmente a partir de células madre pluripotentes. Varias preguntas interesantes sobre la seguridad y eficacia de la entrega de células RPE todavía pueden ser examinadas en modelos animales, y los protocolos bien aceptados utilizados para inyectar RPE se han desarrollado. La técnica descrita aquí ha sido utilizado por varios grupos en diversos estudios y consiste en crear primero un agujero en el ojo con una aguja afilada. A continuación, una jeringa con una blunt aguja cargada con células se inserta a través del agujero y pasa a través del humor vítreo hasta que toque suavemente el RPE. El uso de este método de inyección, que es relativamente simple y requiere un mínimo de equipo, logramos la integración coherente y eficaz de las células RPE derivadas de células madre en entre el RPE host que impide cantidad significativa de degeneración de los fotorreceptores en modelos animales. Aunque no es parte del protocolo real, también se describe cómo determinar la extensión de la trauma inducido por la inyección, y cómo verificar que las células fueron inyectadas en el espacio subretiniano en el uso de técnicas de imagen in vivo. Finalmente, el uso de este protocolo no se limita a las células del RPE; puede utilizarse para inyectar cualquier compuesto o de células en el espacio subretiniano.

Podemos entregar una suspensión de células del EPR en el espacio subretiniano de roedores rápida y consistente con la técnica descrita en este manuscrito. Aunque no es necesario, traumas pueden minimizar en gran medida el uso de la configuración se muestra con un micromanipulador en la figura 1A &amp; B. Mantenga el roedor como se muestra en la Figura 1C para proptosis temporal. Los pasos son los mismos si se realiza con el micromanipulador oa mano; éstas se representan en los dib...

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Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

performing-subretinal-injections-rodents-to-deliver-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Medicine

17.1K vistas.  The Scripps Research Institute. Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.