The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children&#8217;s Hospital Mission Support Funds.

NOTA: Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Arizona. Una lista de los materiales y equipos recomendados se puede encontrar en la Tabla 1. 1. Preparación del tejido <ol><li> Perfusión <ol><li> La eutanasia a los roedores con una sobredosis de pentobarbital sódico (25 mg / kg, IP), y perfundir transcardially con tampón fosfato salino (PBS) hasta que esté completamente desangrado (3-5 min) a una velocidad de flujo de 8 ml / min. Para obtener instrucciones de perfusión en profundidad, ver Gage et al 2012 9. </li><li> Inmediatamente después de ras PBS, fijar el tejido por perfusión con paraformaldehído al 4% en PBS durante 15-20 min a una velocidad de flujo de 8 ml / min. </li><li> Eliminar cerebro y el lugar en el 4% de paraformaldehído durante 24 h, seguido por soluciones de sacarosa graduadas (15%, 30%, 30%, en secuencia; preparado en solución salina tamponada con Tris) a 4 ° C. Transferir el cerebro para la posterior solución de sacarosa oólo después de que el cerebro se ha hundido en cada solución. Nota: Por lo general, 5 días en cada solución es tiempo suficiente para que el tejido se hunda. </li></ol></li><li> La congelación de tejidos y cryosectioning <ol><li> Coloque el cerebro en medio de inclusión, tal como el compuesto OCT y se sumerja en isopentano a una temperatura de -35 ° C. Deje que el cerebro se congele por un mínimo de 10 minutos, y luego almacenar a -80 ° C. Pueden surgir problemas si no se toma la diligencia a la temperatura; por favor, véase la discusión para la solución de problemas de información. </li><li> Cortar secciones coronales en serie con un espesor de 20 micras y una temperatura de -20 ° C. Recoger el tejido en portaobjetos cargados positivamente. Secciones cerebrales pueden ser colocados en una caja portaobjetos envuelto en papel en una bolsa zip-top y almacenada a largo plazo a -80 ° C. Este método de almacenamiento crea una frontera doble para evitar la exposición al aire y las heladas. </li></ol></li></ol> Procesamiento 2. Tejido NOTA: equipos y materiales Ejemplo rEQUERIDO para la tinción se muestran en la Figura 3. Las alternativas están disponibles, sin embargo, estas imágenes ayudarán a los nuevos en la tinción inmunohistoquímica para visualizar elementos apropiados antes de la compra. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> Figura 3: Ejemplo de elementos necesarios para la tinción inmunohistoquímica El cuadro negro se muestra en (A) es una cámara de humedad ideal para inmunofluorescencia, como diapositivas están protegidos de la luz sin la necesidad de envolver la caja de papel de aluminio.. Después de seccionamiento, diapositivas se pueden almacenar en una caja como el cuadro amarillo se muestra en (B). Envolver la caja herméticamente en papel de aluminio y colocarlo en una bolsa zip-top antes del congelador ayuda a proteger las muestras de tejido de las quemaduras por congelación. Un ejemplo de diapositivas se da en (C), con diferentes platos de tinción representados en (D) y (E </strong&gt;). Cubreobjetos pueden variar en tamaño y espesor (F), sin embargo 1,2 cubreobjetos gruesas proporcionan buenos resultados de las imágenes en la mayoría de los microscopios verticales y confocal. Un lápiz tal como la mostrada en (G) se puede utilizar para etiquetar diapositivas. Marcadores permanentes deben ser evitados ya que la tinta puede correr, que afecta tanto a la tinción y la capacidad de determinar lo que la muestra es. Un mini pluma pap tal como la mostrada en (H) permite una frontera repelente que se puede sacar en las diapositivas. <ol><li> Preparación de diapositivas <ol><li> Eliminar diapositivas de congelador y descongelar a temperatura ambiente. <ol><li> Opcional: Si las secciones han flotado previamente de diapositivas, coloque las diapositivas descongeladas en un horno a 60 ° C durante no más de 4 horas para ayudar a prevenir las secciones de tejido de flotando diapositivas. </li></ol></li><li> Coloque los portaobjetos en un rack de diapositivas y el plato correspondiente. </li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 minutos cada uno, el cambio de solución entre lavados. A partir de este paso adelante, no tener sections sin líquido durante largos períodos de tiempo. Nota: Si las secciones se secan, la tinción de fondo se incrementa y datos significativos no se puede obtener de forma fiable. </li></ol></li><li> Tinción de tejidos <ol><li> En una caja de tinción hermética a la luz, crear una &quot;cámara de humedad&quot;, con tejidos sin pelusa humedecido con agua destilada. </li><li> Seque los bordes de la diapositiva con un pañuelo que no suelte pelusa, use un mini pluma pap para hacer un borde repelente de líquidos en el mismo borde de la diapositiva, lejos de las secciones de tejido. Esta frontera debe garantizar un amplio espacio entre el menisco del líquido y el borde del tejido de modo que la tensión superficial no afecta a la tinción. NOTA: El repelente frontera pluma pap se puede aplicar antes de la 2.1.3 si los anticuerpos de interés no requieren microondas recuperación de antígeno. Si la pluma de Papanicolaou se ha aplicado antes del lavado en PBS, la integridad de la frontera-líquido repelente debe comprobarse en este paso. Utilice una pluma mini-pap para llenar los vacíos en la frontera. </li><li&gt; Con las diapositivas en posición horizontal, el antígeno inespecífico bloque de unión incubando en el 4% v / v de suero en PBS (solución de bloqueo). Pipetear 300 l de solución de bloqueo por portaobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente. Asegúrese de que la solución de bloqueo se extiende a la pluma pap en el borde de la corredera y cubre completamente el tejido para evitar la tinción desigual causada por la tensión superficial cerca del tejido. <ol><li> Utilice el suero de la misma especie en la que se hace anticuerpo secundario. Nota: En este procedimiento, los anticuerpos secundarios se hacen en burro, y por lo tanto se utiliza suero de burro. Si se utilizan anticuerpos secundarios de dos o más especies diferentes, incluir el suero de cada especie. </li></ol></li><li> Pipetear anticuerpo primario en portaobjetos. Nota: Las concentraciones de anticuerpos para esta tinción se han optimizado a escala 1: 5.000 y 1: 500 para Iba1 y Pan-neuronal, respectivamente. Se han encontrado Estas concentraciones para mostrar tinción significativa con una ausencia de tinción de fondo. <ol><li> Diluir la solución de bloques deSuero 1% en PBS y añadir anticuerpos primarios. Pipetear 300 l de solución de anticuerpo primario en el 1% de suero por diapositiva. Una vez más, asegúrese de que el fluido es el borde de la pluma pap. Incubar durante la noche a 4 ° C. </li><li> Incluya tres portaobjetos de control: uno que contiene anticuerpos ni Iba1 ni Pan-neuronales, una con Iba1 sin anticuerpo pan-neuronal, y uno con el anticuerpo pan-neuronal sin Iba1. Tinción de estas diapositivas en la misma carrera con las mismas soluciones, sin embargo omitir los anticuerpos primarios para probar la unión no específica de los anticuerpos secundarios. </li></ol></li><li> A la mañana siguiente, se desliza de lavado tres veces en PBS durante 5 minutos cada uno, el cambio de solución entre lavados. </li><li> Anticuerpos fluorescentes son sensibles a la luz, por lo tanto, a partir de este paso adelante, reducir al mínimo la exposición de luz, garantizando contenedores de lavado se envuelven en papel de aluminio y cajas de hibridación son negro o se incubaron en la oscuridad. Pipetear los anticuerpos secundarios apropiados en todas las diapositivas y se incuba durante60 minutos a temperatura ambiente a una concentración de 1: 250 en solución de bloqueo (vea el paso 2.2.3) en una &quot;cámara de humedad&quot; hermética a la luz (véase el paso 2.2.1). <ol><li> Utilice anticuerpos secundarios de diferentes longitudes de onda. Aquí, para el anticuerpo primario de conejo anti-Iba1, utilice burro anti-conejo 594 como el anticuerpo secundario apropiado. Para el ratón anticuerpo primario anti-Pan-neuronal, utilice burro anti-ratón 488 como el anticuerpo secundario apropiado. Alternativamente, use anti-conejo 488 y anti-ratón 594. </li></ol></li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 min cada uno. </li><li> Opcional: realizar la tinción nuclear. <ol><li> Place en Hoechst (u otra mancha nuclear) a una concentración de 0,03 g / ml en doble H 2 0 destilada durante exactamente 60 segundos. </li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 min cada uno. </li></ol></li><li> Lave en ddH 2 0. </li></ol></li><li> Cubrición <ol><li> Diapositivas el cubreobjetos con un medio de montaje acuoso, tal como Fluoromount-G o ProlongGold. Tenga cuidado para eliminar todas las burbujas utilizando un aplicador con punta de algodón. Nota: Otros agentes de montaje podrían utilizarse, sin embargo alta derrame entre tintes ha sido señalado por algunos pocos días de cubreobjetos. </li><li> Utilice esmalte de uñas transparente para sellar los bordes, evitando que las secciones se seque debido a la evaporación. Deje que se seque el esmalte de uñas en un recipiente hermético a la luz, mientras que las diapositivas permanecen planas y a temperatura ambiente, y luego almacenar en un recipiente hermético a la luz envuelto en papel de aluminio a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Proyección de imagen del Tejido manchado <ol><li> Microscopía <ol><li> Deje que el esmalte de uñas se seque durante al menos una hora antes de comenzar la microscopía, que debería tener lugar en una habitación oscura. </li><li> Adquirir microfotografías utilizando un microscopio confocal o de investigación con una fuente de luz fluorescente y un accesorio de cámara digital. Utilizando el software que lo acompaña, ajustar la exposición para cada longitud de onda - 405, 488, y 594 - separado. Nota: en profundidad instrucciones de imágenes deben estar disponibles en línea desde el fabricante microscopio. </li><li> Adquirir microfotografías en cada canal sin mover las secciones o ajustar el enfoque. Tome imágenes en color o en escala de grises, alternativamente y convertir a color después. Nota: Las imágenes en escala de grises de cada canal de color o pueden ser cotejados en el post-procesamiento. </li><li> Asegúrese de que los cortes de tejido no se exponen a la luz ambiental o la luz microscópica durante largos períodos de tiempo, como foto-blanqueo de las secciones se producirá. Para evitar esto, aumentar el tiempo de exposición en lugar de intensidad de la luz / laser en aumento. </li><li> No apague la fuente de luz fluorescente en los 30 minutos de estar encendido. Nota: Cambio de la fuente de encendido y apagado en rápida sucesión puede disminuir la vida útil de la bombilla fluorescente. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

El objetivo general de esta comunicación fue la introducción de procedimientos de inmunohistoquímica para el lector. Para ello, el ejemplo de doble etiquetado con Iba1 y antígenos Pan-neuronales para observar microglia y neuronas en paraformaldehído perfundido, se utilizó sacarosa cerebro cryoprotected, rata cryosectioned. Esta técnica se puede adaptar para servir a los propósitos sin fin. Una serie de diferentes antígenos en una variedad de tipos de tejidos tales como, pero sin lim...

<html> La inmunohistoquímica es un proceso para la detección de antígenos (es decir, proteínas) en secciones de tejido mediante el uso de anticuerpos primarios que se unen específicamente a los antígenos de interés. La inmunohistoquímica fue iniciado por JR Marrack en 1934 cuando se determinó que los anticuerpos podrían localizar antígenos con gran especificidad 1. A partir de 1942, algunos de los primeros estudios in vitro usando anticuerpos fluorescentes para visualizar inmunohistoquímica se publicaron 2,3, después de lo cual el primer estudio in vivo en histoquímica fue publicado 4. Durante la década de 1960, tres décadas después de la creación de métodos de inmunohistoquímica, anticuerpos conjugados a enzima comenzaron a ser utilizados como reactivos secundarios. Estos métodos se han desarrollado de forma simultánea e independientemente en Francia y los EE.UU. 5,6. Hoy en día, una amplia gama de anticuerpos ofrece un sinfín de posibilidades para los estudios de inmunohistoquímica 7. &quot;&gt; El objetivo general de esta correspondencia es proporcionar una breve introducción en la tinción inmunohistoquímica, no pretende ser una revisión completa y exhaustiva de esta técnica en el método descrito, técnicas inmunohistoquímicas para dos antígenos son presentados (marcadores de la microglía y. neuronas) para la tinción de paraformaldehído perfundido, sacarosa cryoprotected, cerebro de rata cryosectioned. La tinción inmunohistoquímica comienza con el bloqueo de la unión no específica de antígeno para reducir la tinción de fondo. A continuación, la incubación con el anticuerpo primario permite por la unión a un antígeno específico en el tejido. Siguiendo el anticuerpo primario, otro anticuerpo, denominado anticuerpo secundario, se aplica a enlazar el anticuerpo primario a una señal de visualización conjugado 8. El anticuerpo secundario se dirige a la inmunoglobulina G (IgG) de dominio específico a las especies en las que se planteó el anticuerpo primario. El anticuerpo secundario amplifica la señal del anticuerpo primario desde las regiones Fab de tque se unen anticuerpo secundario a múltiples sitios en el dominio IgG del anticuerpo primario. Cualquiera de enzimas o moléculas fluorescentes conjugados con las regiones C de F del anticuerpo secundario permitir la visualización. Por ejemplo, un conejo anti-Iba1 anticuerpo primario es una molécula de IgG de conejo específico para Iba1. Cuando se aplica burro anti-IgG de conejo como anticuerpo secundario, se reconocer y unirse a múltiples regiones del anti-IgG de conejo Iba1 (ver Figura 1). El anticuerpo de burro puede ser visualizado por diversos métodos. Esta correspondencia se centra en la detección de un fluoróforo conjugado con el anticuerpo secundario, que reconoce el anticuerpo primario, para la visualización por microscopía fluorescente. En inmunohistoquímica fluorescente, un tinte nuclear, tales como Hoechst o DAPI se puede utilizar para visualizar todos los núcleos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> Figura 1: Schrepresentación Ematic de vs. directa técnicas de marcaje de anticuerpos indirecto. Los anticuerpos se unen al antígeno de interés y puede ser amplificada por anticuerpos secundarios dirigidos contra las especies de los anticuerpos primarios. Esta técnica se puede realizar utilizando complejo avidina-biotina (ABC) para la amplificación y DAB para la visualización (A), o un anticuerpo secundario fluorescente directamente conjugado (B). Alternativamente, los anticuerpos primarios se pueden conjugar directamente con muchas etiquetas diferentes, incluyendo biotina o un fluoróforo (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Un método alternativo para la visualización de la tinción inmunohistoquímica utiliza 3,3&#39;-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB; véanse las Figuras 1 y 2). Esto difiere de fluorescencia mediante el uso de un biotinilado operoxidasa de rábano picante (HRP) anticuerpo secundario conjugado, que proporciona una enzima para convertir DAB a un precipitado que es visible bajo microscopía de campo brillante. En los casos en que un solo antígeno es de interés o se requiere tinción a ser de larga duración, DAB puede ser más apropiado que la tinción fluorescente. Sin embargo, la tinción DAB no está bien adaptado para la diferenciación entre múltiples marcadores, especialmente si dos antígenos nucleares son de interés. Para obtener información sobre materiales DAB y modificaciones del protocolo, consulte la Tabla 1. Alternativamente, cloruro de nitro azul tetrazolio / 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT / BCIP) se puede utilizar para visualizar una fosfatasa alcalina (AP) secundario conjugado anticuerpo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Imágenes representativas de secciones de tejido cerebral de níquel-DAB mejorada de marcaje único rata rata cerebro del SEcciones que se etiquetan con DAB-níquel mejorada para Iba1 (A) y Pan-neuronal (B) permitir el análisis de larga duración de la microglia o neuronas solas. Barra de escala 20 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Hay que tener en cuenta la abundancia estimada del antígeno de interés dentro del tejido que se está analizando. Los métodos indirectos (como se describe más arriba) son útiles para los objetivos con baja abundancia. Cuando el antígeno de interés se encuentra en gran abundancia, los métodos directos se pueden aplicar. Los métodos directos implican un anticuerpo primario que se conjuga directamente a una señal de visualización, y por lo tanto no se requiere ningún anticuerpo secundario. Este método simplifica el proceso de tinción, pero elimina la amplificación logrado por métodos indirectos. El uso de un anticuerpo primario conjugado directamente también elimina la reactividad cruzada de anticuerpos secundariosal hacer doble etiquetado. Esta comunicación se detalla el protocolo de doble etiquetado con Iba1 y Pan-neuronales (detalles en la Tabla 1). Iba1 manchas microglia en muchos estados de activación, incluyendo ramificada, hiper-ramificados, que se activa, ameboide, y la varilla. Manchas Pan-neuronales neuronal axones, dendritas, y soma. Desde Iba1 tiñe la mayoría de la microglía y metas Pan-neuronales la neurona, esta combinación de manchas es útil en la obtención de una amplia comprensión de las interacciones microglia neuronas. En suma, la tinción inmunohistoquímica se basa en la cuidadosa selección de anticuerpos. Como la pregunta de investigación se hace más específica, los anticuerpos producidos contra antígenos alternativos pueden ser deseables. Para conseguir un estado de activación microglial específica, se puede optar por utilizar anticuerpos CD45 o CD68, en lugar de Iba1. Además, en el trabajo con ratones, F4 / 80 puede proporcionar los resultados necesarios. Del mismo modo, los elementos neuronales pueden ser dirigidos específicamente con anticuerpos razada contra el núcleo, sinapsis (pre o post), axón, y el cono de crecimiento. Además, hay otros marcadores que diferencian la edad de la neurona (doble Cortin, NeuN), y la regeneración neuronal (GAP-43).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1171">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:523px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td>Used for tissue mounting (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Oven</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51028112</td>
			<td>Used for tissue drying (2.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mini Pap pen</td>
			<td style="width:132px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">00-8877</td>
			<td>Used in step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-149-429</td>
			<td>Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666-A</td>
			<td>Used for drying slides (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Black Staining Box</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">21050</td>
			<td>Used for blocking and staining steps (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-413-253</td>
			<td>Used for block and antibody incubation (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse &#945;-Pan-neuronal</td>
			<td style="width:132px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB2300</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rabbit &#945;-Iba1</td>
			<td style="width:132px;">Wako Chemical</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-Rabbit 594</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">711-585-152</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-mouse 488</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-545-150</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Caterer&#39;s foil</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used in steps 1.2.2 and 2.3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:132px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">0100-01</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Coverslips</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12544E</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Clear Nail Polish&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axioskop A2</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CitriSolv&#160;</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ABC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAB Peroxidase kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-2001</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Wheaton slide racks and staining dishes</td>
			<td style="width:132px;">TedPella</td>
			<td style="width:119px;">21043</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex perfusion pump and tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Thermometer (-50 to 50 C)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-059-228</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM3500S</td>
			<td>Used for tissue sectioning (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish, Plastic with 2 Lids</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>353</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 Place Staining Rack, Slides Horizontal</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>354</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons

La inmunohistoquímica es una técnica ampliamente utilizada para detectar la presencia, localización, y la abundancia relativa de antígenos in situ. Este protocolo de nivel introductorio describe los reactivos, equipos y técnicas requeridas para completar la tinción inmunohistoquímica de tejido de cerebro de roedores, el uso de marcadores para microglia y elementos neuronales como un ejemplo. En concreto, este trabajo es un protocolo de paso a paso para la visualización fluorescente de la microglia y neuronas a través de inmunohistoquímica para Iba1 y Pan-neuronal, respectivamente. Fluorescencia doble etiquetado es particularmente útil para la localización de múltiples proteínas dentro de la misma muestra, proporcionando la oportunidad de observar con precisión las interacciones entre tipos de células, receptores, ligandos, y / o la matriz extracelular en relación el uno al otro, así como co-proteína localización dentro de una sola célula. A diferencia de otras técnicas de visualización, intensidad de la tinción inmunohistoquímica de fluorescencia puede disminuir enlas semanas a meses después de la tinción, si no se toman las precauciones adecuadas. A pesar de esta limitación, en muchas aplicaciones se prefiere la fluorescencia doble etiquetado sobre alternativas tales como tetrahidrocloruro de 3,3&#39;-diaminobencidina (DAB) o fosfatasa alcalina (AP), como fluorescencia es más eficiente en el tiempo y permite la diferenciación más precisa entre dos o más marcadores. La discusión incluye sugerencias para solucionar problemas y consejos para promover el éxito.

Este protocolo de tinción resultados en secciones de tejido de cerebro de rata que han microglia marcados con fluorescencia en el canal 594 (rojo) y neuronas marcadas en el canal 488 (verde; véase la Figura 4). Si una mancha nuclear se ha hecho, se mostrará en el canal 405 (azul). Las imágenes pueden ser tomadas en diferentes canales y superpuestos para la comparación directa de los tres canales, o entre dos canales. Muchos paquetes de software de adquisición digitales incluyen esta funcionalidad....

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Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primer para inmunohistoquímica en el tejido cryosectioned cerebro de rata: Ejemplo de tinción de microglía y neuronas

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.6K vistas.  University of Arizona College of Medicine - Phoenix. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example. 

Video: Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Investigación

Neurociencias

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

La inmunohistoquímica wholemount de Topografía Revelando Complex Brain

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As the first responders, microglia have important functions to mitigate neuron and glia dysfunction, and in this process, they undergo a broad range of morphologic changes. Microglia morphologies can be categorized descriptively or, alternatively, can be quantified as a continuous variable for parameters such as cell ramification, complexity, and shape. While methods for quantifying microglia are applied to single cells, few techniques apply to multiple microglia in an entire photomicrograph. The purpose of this method is to quantify multiple and single cells using readily available ImageJ protocols. This protocol is a summary of the steps and ImageJ plugins recommended to convert fluorescence and bright-field photomicrographs into representative binary and skeletonized images and to analyze them using software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) and FracLac for morphology data collection. The outputs of these plugins summarize cell morphology in terms of process endpoints, junctions, and length as well as complexity, cell shape, and size descriptors. The skeleton analysis protocol described herein is well suited for a regional analysis of multiple microglia within an entire photomicrograph or region of interest (ROI) whereas FracLac provides a complementary individual cell analysis. Combined, the protocol provides an objective, sensitive, and comprehensive assessment tool that can be used to stratify between diverse microglia morphologies present in the healthy and injured brain.

Microglia are brain immune cells that survey and react to altered brain physiology through morphologic changes which may be evaluated quantitatively. This protocol outlines an ImageJ based analysis protocol to represent microglia morphology as continuous data according to metrics such as cell ramification, complexity, and shape.

Cuantificar la morfología de la microglía de microfotografías de la inmunohistoquímica preparado tejido con ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.