The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children&#8217;s Hospital Mission Support Funds.

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات في الامتثال مع اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة ولاية اريزونا. ويمكن الاطلاع على قائمة المواد والمعدات الموصى بها في الجدول 1. 1. إعداد الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء القوارض مع جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال (25 ملغ / كغ، IP)، ويروي transcardially مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حتى exsanguinated تماما (3-5 دقيقة) بمعدل تدفق 8 مل / دقيقة. للحصول على تعليمات نضح في العمق، انظر غيج وآخرون 2012 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد PBS دافق، وإصلاح الأنسجة عن طريق perfusing مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 15-20 دقيقة بمعدل تدفق 8 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الدماغ ووضعه في 4٪ امتصاص العرق لمدة 24 ساعة، تليها حلول السكروز متدرج (15٪، 30٪، 30٪، في التسلسل؛ أعدت في تريس مخزنة المالحة) في 4 ° C. نقل الدماغ لاحقا السكروز حل سنلي بعد الدماغ قد غرقت في كل حل. ملاحظة: عادة، 5 أيام في كل حل هو الوقت الكافي للأنسجة لتغرق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد الأنسجة وCryosectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الدماغ في تضمين المتوسطة، مثل أكتوبر المجمع ويغرق في isopentane عند درجة حرارة -35 درجة مئوية. السماح للدماغ لتجميد مدة لا تقل عن 10 دقيقة، ومن ثم تخزين في -80 ° C. مشاكل يمكن أن تنشأ إذا لم يتم اتخاذ الحرص على درجة الحرارة؛ الرجاء انظر المناقشة لاستكشاف المعلومات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أقسام الاكليلية التسلسلية في سمك 20 ميكرون ودرجة حرارة -20 درجة مئوية. جمع الأنسجة على الشرائح ذات شحنة موجبة. قد تكون وضعت أقسام الدماغ في مربع الشريحة ملفوفة في احباط في كيس الرمز البريدي أعلى وتخزينها على المدى الطويل في -80 ° C. هذه الطريقة في التخزين يخلق الحدود مزدوجة لمنع التعرض للهواء والصقيع. </li></ol></li></ol> 2. معالجة الأنسجة ملاحظة: المعدات والمواد مثال صequired لتلطيخ في الشكل 3. هي البدائل المتاحة، ومع ذلك، فإن هذه الصور تساعد أولئك جديدة لتلطيخ المناعى لتصور العناصر المناسبة قبل الشراء. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> الرقم 3: مثال العناصر المطلوبة لتلطيخ المناعى مربع أسود هو مبين في (A) هو غرفة الرطوبة مثالية لالمناعي، كما يتم حماية الشرائح من الضوء دون الحاجة إلى التفاف مربع على احباط. بعد باجتزاء، والشرائح يمكن تخزينها في صندوق مثل المربع الأصفر هو مبين في (B). التفاف مربع بإحكام في احباط ووضع في كيس الرمز البريدي أعلى قبل الثلاجة يساعد على حماية عينات الأنسجة من حرق المجمد. تم اعطاء مثال من الشرائح في (C)، مع أطباق تلطيخ مختلفة صورت في (D) و (E </strong&gt;). يمكن Coverslips تختلف في الحجم والسمك (F)، ومع ذلك توفر 1.2 coverslips سميكة نتائج التصوير لطيفة على معظم المجاهر تستقيم ومتحد البؤر. قلم رصاص مثل تلك المبينة في (G) يمكن استخدامها لتسمية الشرائح. وينبغي تجنب علامات دائمة مثل الحبر يمكن تشغيل، مما يؤثر على تلطيخ والقدرة على تحديد ما هي العينة. قلم حلمة الثدي صغيرة مثل تلك التي تظهر في (H) تمكن الحدود طارد التي يمكن استخلاصها على الشرائح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الشريحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرائح من الفريزر وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: إذا أقسام قد طرحت في وقت سابق من الشرائح، ووضع الشرائح إذابة في فرن عند 60 درجة مئوية لمدة لا تزيد على 4 ساعات للمساعدة في منع المقاطع النسيجية من عائمة قبالة الشرائح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشرائح في رفوف الشريحة وطبق المقابلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما، وتغيير الحل بين يغسل. من هذه الخطوة إلى الأمام، وتجنب وجود sectiإضافات دون السائل لفترات طويلة من الزمن. ملاحظة: إذا أقسام تجف، يتم زيادة تلوين الخلفية، ولا يمكن أن يعتمد عليه الحصول على بيانات ذات مغزى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأنسجة تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في مربع تلطيخ ضوء محكم، إنشاء &quot;غرفة الرطوبة&quot; مع الأنسجة خالية من الوبر ينقع بالماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجف حواف الشريحة بمنديل خالية من الوبر، واستخدام PAP القلم مصغرة لجعل الحدود طارد السائل على حافة جدا من الشرائح، بعيدا عن أقسام الأنسجة. وينبغي أن تكفل هذه الحدود حيزا واسعا بين الغضروف المفصلي للسائل وحافة النسيج بحيث التوتر السطحي لا يؤثر تلطيخ. ملاحظة: يمكن تطبيق الحدود طارد حلمة الثدي من ركلة جزاء قبل 2.1.3 إذا كانت الأجسام المضادة التي تهم لا تتطلب الميكروويف استرجاع مستضد. إذا تم تطبيق القلم حلمة الثدي قبل الغسيل في برنامج تلفزيوني، يجب أن يتم التحقق من سلامة الحدود السائل طارد في هذه الخطوة. استخدام قلم مصغرة حلمة الثدي لملء أي ثغرات في الحدود. </li><li&gt; مع الشرائح وضعت أفقيا، كتلة المستضد غير محددة ملزمة التي يحتضنها في 4٪ ت / ت مصل في برنامج تلفزيوني (حل كتلة). ماصة 300 ميكرولتر من حل كتلة لكل شريحة ل1hr في درجة حرارة الغرفة. تأكد من حل كتلة يمتد إلى القلم حلمة الثدي عند حافة الشريحة ويغطي تماما الأنسجة لتجنب تلطيخ متفاوتة الناجمة عن التوتر السطحي بالقرب من الأنسجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المصل من نفس الأنواع التي يتم فيها الأجسام المضادة الثانوية. ملاحظة: في هذا الإجراء، يتم إجراء الأجسام المضادة الثانوية في الحمار، وبالتالي يستخدم المصل حمار. إذا تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية من اثنين أو أكثر من الأنواع المختلفة، وتشمل المصل من كل الأنواع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة الأجسام المضادة الأولية على الشرائح. ملاحظة: لقد تم تحسين تركيز الأجسام المضادة لهذا تلطيخ في 1: 5000 و 1: 500 للIba1 وعموم العصبية، على التوالي. تم العثور على هذه التركيزات لإظهار تلطيخ هادف مع غياب تلوين الخلفية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل كتلة ل1٪ مصل في برنامج تلفزيوني وإضافة الأجسام المضادة الأولية. ماصة 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية في 1٪ مصل لكل شريحة. مرة أخرى، وضمان السائل إلى حافة القلم حلمة الثدي. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشمل ثلاث شرائح التحكم: واحد يحتوي على لا Iba1 ولا عموم العصبية الأجسام المضادة، واحدة مع Iba1 دون الأجسام المضادة عموم العصبية، واحدة مع الأجسام المضادة عموم العصبية دون Iba1. وصمة عار هذه الشرائح في نفس المدى مع نفس الحلول، ولكن حذفت الأجسام المضادة الأولية لاختبار ملزمة من الأجسام المضادة الثانوية غير محددة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، وغسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما، وتغيير الحل بين يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجسام المضادة الفلورسنت هي حساسة للضوء، وبالتالي، من هذه الخطوة إلى الأمام، والحد من التعرض للضوء عن طريق ضمان يتم تغليف الحاويات غسل في احباط والتهجين صناديق إما أسود أو المحتضنة في الظلام. ماصة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة على كافة الشرائح واحتضان ل60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بتركيز 1: 250 في حل كتلة (راجع الخطوة 2.2.3) في &quot;غرفة الرطوبة&quot; الخفيفة محكم (راجع الخطوة 2.2.1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأجسام المضادة الثانوية من أطوال موجية مختلفة. هنا، للأرنب الأجسام المضادة الأولية ومكافحة Iba1، استخدم الحمار أرنب مكافحة 594 كما الأجسام المضادة الثانوية المناسب. الماوس الأجسام المضادة الأولية مكافحة عموم العصبية، استخدم الحمار مكافحة فأر 488 كما الأجسام المضادة الثانوية المناسب. بالتناوب، استخدم المضادة للأرنب 488 ومكافحة فأر 594. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: أداء تلطيخ النووي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في هويشت (أو وصمة عار النووية الأخرى) بتركيز 0.03 ميكروغرام / مل في ضعف H المقطر 2 0 بالضبط 60 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل في ده 2 0. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslipping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شرائح ساترة مع وسط مائي التركيب، مثل فلورomount-G أو ProlongGold. الحرص على إزالة جميع الفقاعات باستخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس. ملاحظة: يمكن أن تستخدم عوامل أخرى تصاعد مستمر، وقد لوحظ مع ذلك عالية تنزف من خلال بين الأصباغ من قبل بعض غضون أيام من coverslipping. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام طلاء الأظافر واضحة لختم الحواف، ومنع المقاطع من الجفاف بسبب التبخر. السماح طلاء الأظافر لتجف في وعاء محكم الخفيفة في حين تبقى الشرائح مسطحة وعند درجة حرارة الغرفة، ومن ثم تخزينها في حاوية للضوء ضيق ملفوفة في احباط في 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. تصوير الأنسجة الملون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للطلاء الأظافر لتجف لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل البدء المجهري، والتي ينبغي أن تتم في غرفة مظلمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول photomicrographs باستخدام متحد البؤر أو المجهر البحث مع مصدر ضوء الفلورسنت ومرفق الكاميرا الرقمية. استخدام البرمجيات المصاحبة لها، تعيين التعرض لكل طول موجي - 405، 488، و 594 - على حدة. ملاحظة: في عمق ينبغي أن تكون تعليمات التصوير على شبكة الإنترنت من الشركة المصنعة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول photomicrographs في كل قناة دون تحريك الفروع أو ضبط التركيز البؤري. التقاط صور في اللون، أو بالتناوب في الرمادي وتحويله إلى اللون بعد ذلك. ملاحظة: اللون أو الصور الرمادية من كل قناة يمكن ترتيبها في مرحلة ما بعد المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان عدم تعرض تلك المقاطع النسيجية للضوء المحيط أو ضوء المجهري لفترات طويلة من الزمن، كما قدم صورة تبيض الأقسام سيحدث. لتجنب هذا، وزيادة التعرض الوقت بدلا من زيادة شدة الضوء / ليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا إيقاف مصدر ضوء الفلورسنت غضون 30 دقيقة من التعرض للتشغيل. ملاحظة: التبديل المصدر وإيقاف في تتابع سريع قد يقلل من العمر الافتراضي للمصباح الفلورسنت. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+antigens+and+antibodies.">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> J Immunol. 45, 159-170 (1942).</li><li>Marshall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+adrenocorticotropic+hormone+by+histochemical+and+immunochemical+methods.">Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods.</a> The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).</li><li>Mellors, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+demonstration+of+the+in+vivo+localization+of+antibodies:+antigenic+components+of+the+kidney+and+the+pathogenesis+of+glomerulonephritis.">Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).</li><li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-labeled+antibodies:+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens.">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li><li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application.">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).</li><li>Cuello, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunohistochemistry. , (1983).</li><li>Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Junqueira's basic histology : text and atlas. , (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li><li>Christensen, N. K., Winther, L., Kumar, G. L., Rudbeck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. , 103-108 (2009).</li><li>Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+method+in+multiple-label+immunofluorescence+confocal+microscopy).">Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy).</a> Methods. 18, 459-464 (1999).</li><li>Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+sections+of+70-100+mum:+a+novel+technique+and+its+benefits+for+studying+the+nervous+system.">Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system.</a> Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وكان الهدف العام من هذه الاتصالات لإدخال إجراءات المناعية للقارئ. لهذا، مثال مزدوج وضع العلامات مع Iba1 ومولدات المضادات عموم العصبية لمراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في امتصاص العرق perfused ل، تم استخدام السكروز الدماغ cryoprotected، الفئران cryosectioned. <p class="...

<html> المناعية هي عملية للكشف عن المستضدات (أي البروتينات) في أقسام الأنسجة باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي تربط خصيصا لمولدات المضادات من الفائدة. كان رائدا المناعية التي كتبها JR ماراك في عام 1934 عندما قرر أن الأجسام المضادة يمكن أن توطين مستضدات مع خصوصية كبيرة 1. ابتداء من عام 1942، ونشرت بعض من أولى الدراسات في المختبر باستخدام الأجسام المضادة فلوري لتصور المناعية 2،3، وبعد ذلك لأول مرة في الجسم الحي الدراسة النسيجية تم نشره 4. خلال عام 1960، بعد ثلاثة عقود من إنشائها أساليب المناعى، بدأت الأجسام المضادة انزيم مترافق لاستخدامها الكواشف الثانوية. تم في وقت واحد وبشكل مستقل وضعت هذه الأساليب في فرنسا والولايات المتحدة 5،6. اليوم، مجموعة واسعة من الأجسام المضادة تقدم احتمالات لا نهاية لها للدراسات المناعية 7. &quot;&gt; ويتمثل الهدف العام من هذه المراسلات هو توفير مقدمة موجزة إلى تلطيخ المناعى، وليس المقصود أن يكون استعراضا شاملا وكاملا لهذه التقنية في الأسلوب المبين، وتعرض تقنيات المناعى لمدة المستضدات (علامات على الخلايا الدبقية الصغيرة و. الخلايا العصبية) لتلطيخ من امتصاص العرق perfused ل، السكروز cryoprotected، cryosectioned الدماغ الفئران. تلطيخ المناعى يبدأ حجب المستضد غير محددة ملزمة للحد من تلوين الخلفية. بعد ذلك، الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية تسمح للربط لمستضد معين في الأنسجة. وبعد الأجسام المضادة الأولية، الأجسام المضادة آخر، وصف الأجسام المضادة الثانوية، يتم تطبيقها على ربط الأجسام المضادة الأولية إلى إشارة التصور مترافق 8. والضد الثانوية يستهدف المناعي G (مفتش) مجال معين إلى الأنواع التي أثيرت الأجسام المضادة الأولية. يضخم الجسم المضاد الثانوي إشارة من الأجسام المضادة الأولية منذ المناطق فاب رانه الثانوي ربط الأجسام المضادة لمواقع متعددة في المجال مفتش من الأجسام المضادة الأولية. إما الإنزيمات أو جزيئات فلوري مترافق إلى ج مناطق F من الأجسام المضادة الثانوية تمكن التصور. على سبيل المثال، أرنب الأجسام المضادة الأولية مكافحة Iba1 هو أرنب جزيء مفتش محددة لIba1. عندما يتم تطبيق حمار المضادة للأرنب مفتش بمثابة الضد الثانوية، انها لن تعترف وربط مناطق متعددة من الأرانب مكافحة Iba1 مفتش (انظر الشكل 1). الأجسام المضادة حمار يمكن تصور بطرق مختلفة. وتركز هذه المراسلات على الكشف عن fluorophore مترافق الأجسام المضادة الثانوية، الذي يعترف الأجسام المضادة الأولية، لتصور بواسطة المجهر الفلورسنت. في المناعية الفلورسنت، وصمة عار النووية مثل هويشت أو دابي يمكن استخدامها لتصور كل نواة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> الشكل 1: شوبتمثيل ematic من مقابل المباشر تقنيات وضع العلامات الأجسام المضادة غير المباشر. الأجسام المضادة ربط المستضد من الفائدة ويمكن تضخيمها من قبل الأجسام المضادة الثانوية التي أثيرت ضد أنواع من الأجسام المضادة الأولية. هذه التقنية يمكن القيام بها باستخدام مجمع أفيدين البيوتين (ABC) لتضخيم وDAB التصور (A) أو الأجسام المضادة الثانوية فلوري مترافق مباشرة (B). بدلا من ذلك، الأجسام المضادة الأولية يمكن مترافق مباشرة مع العديد من العلامات المختلفة، بما في ذلك البيوتين أو fluorophore (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> طريقة بديلة لرؤية تلطيخ المناعى يستخدم 3،3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB؛ انظر الشكلين 1 و 2). هذا يختلف عن مضان باستخدام البيروكسيديز أوالغلوثانيون الحصان الفجل (HRP) الأجسام المضادة الثانوية مترافق، التي تنص على انزيم تحويل DAB إلى راسب التي مرئيا تحت مشرق المجهري الميدان. في الحالات التي تكون فيها مستضد واحد هو من مصلحة أو مطلوب تلطيخ أن تكون طويلة الأمد، قد يكون DAB أكثر ملاءمة من تلطيخ الفلورسنت. ومع ذلك، لا مناسبة تماما DAB تلطيخ للتمايز بين علامات متعددة، لا سيما إذا كان اثنان من المستضدات النووية المثيرة للاهتمام. للحصول على معلومات عن المواد DAB وتعديلات بروتوكول، راجع الجدول 1. بالتناوب، نيترو الأزرق كلوريد نتروبلو / 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl الفوسفات (NBT / BCIP) يمكن استخدامها لتصور والفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) مترافق الثانوية الأجسام المضادة. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> الشكل 2: صور الممثل DAB الفئران أقسام محسنة النيكل أنسجة المخ واحدة وصفت حد ذاتها دماغ الفئرانctions التي وصفت مع محسنة النيكل DAB لIba1 (A) وعموم العصبية (B) يسمح للتحليل طويل الأمد من الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا العصبية وحدها. مقياس شريط 20 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> يجب على المرء أن ينظر في وفرة المقدرة للمستضد المصالح داخل الأنسجة التي يجري تحليلها. وسائل غير مباشرة (كما هو موضح أعلاه) هي مفيدة للأهداف مع وفرة منخفضة. عندما مستضد من الفائدة في وفرة عالية، ويمكن تطبيقها الأساليب المباشرة. طرق المباشرة تنطوي على الأجسام المضادة الأولية التي مترافق مباشرة إلى إشارة التصور، وبالتالي لا يلزم الضد الثانوية. هذه الطريقة يبسط عملية التلوين، ولكن يلغي التضخيم من قبل وسائل غير مباشرة تحقيقها. باستخدام الأجسام المضادة الأولية مترافق مباشرة كما يلغي عبر التفاعل من الأجسام المضادة الثانويةعند النقر المزدوج وضع العلامات. هذا التواصل تفاصيل بروتوكول لمضاعفة وضع العلامات مع Iba1 وعموم العصبية (التفاصيل في الجدول 1). Iba1 بقع الخلايا الدبقية الصغيرة في العديد من الدول التنشيط، بما في ذلك متشعب، فرط متشعب، تنشيط، أميبية، وقضيب. البقع عموم العصبية محاور الخلايا العصبية، التشعبات، وسوما. منذ Iba1 البقع معظم الخلايا الدبقية الصغيرة والأهداف عموم العصبية في الخلايا العصبية، وهذا مزيج من البقع مفيد في الحصول على فهم واسع من التفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة الخلايا العصبية. باختصار، يعتمد تلطيخ المناعى على الاختيار الدقيق للأجسام. كما يصبح السؤال البحثي أكثر تحديدا، قد يكون المطلوب الأجسام المضادة التي أثيرت لمستضدات بديلة. استهداف دولة تفعيل دبقية محددة، يمكن للمرء أن يختار استخدام CD45 CD68 أو الأجسام المضادة، بدلا من Iba1. وعلاوة على ذلك، في العمل مع الفئران، F4 / 80 قد توفر النتائج اللازمة. وبالمثل، عناصر الخلايا العصبية يمكن أن تستهدف على وجه التحديد مع الأجسام المضادة راISED ضد النواة، المشبك (قبل أو ما بعد)، المحور، ومخروط النمو. بالإضافة إلى ذلك، هناك علامات أخرى والتي تفرق عمر الخلايا العصبية (انقر نقرا مزدوجا كورتين، NeuN)، وتجديد الخلايا العصبية (GAP-43).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1171">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:523px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td>Used for tissue mounting (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Oven</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51028112</td>
			<td>Used for tissue drying (2.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mini Pap pen</td>
			<td style="width:132px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">00-8877</td>
			<td>Used in step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-149-429</td>
			<td>Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666-A</td>
			<td>Used for drying slides (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Black Staining Box</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">21050</td>
			<td>Used for blocking and staining steps (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-413-253</td>
			<td>Used for block and antibody incubation (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse &#945;-Pan-neuronal</td>
			<td style="width:132px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB2300</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rabbit &#945;-Iba1</td>
			<td style="width:132px;">Wako Chemical</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-Rabbit 594</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">711-585-152</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-mouse 488</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-545-150</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Caterer&#39;s foil</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used in steps 1.2.2 and 2.3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:132px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">0100-01</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Coverslips</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12544E</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Clear Nail Polish&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axioskop A2</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CitriSolv&#160;</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ABC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAB Peroxidase kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-2001</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Wheaton slide racks and staining dishes</td>
			<td style="width:132px;">TedPella</td>
			<td style="width:119px;">21043</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex perfusion pump and tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Thermometer (-50 to 50 C)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-059-228</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM3500S</td>
			<td>Used for tissue sectioning (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish, Plastic with 2 Lids</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>353</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 Place Staining Rack, Slides Horizontal</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>354</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons

المناعية هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع للكشف عن وجود، والموقع، والوفرة النسبية للمستضدات في الموقع. يصف هذا البروتوكول المستوى التمهيدي الكواشف والمعدات والتقنيات اللازمة لاستكمال تلطيخ المناعى أنسجة الدماغ القوارض، وذلك باستخدام علامات لالخلايا الدبقية الصغيرة والعناصر العصبية كمثال على ذلك. على وجه التحديد، فإن هذه الورقة هي بروتوكول خطوة بخطوة لرؤية فلوري من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية عن طريق المناعية للIba1 وعموم العصبية، على التوالي. مضان مزدوج وضع العلامات مفيد بشكل خاص للتوطين بروتينات متعددة داخل نفس العينة، وتوفير الفرصة لمراقبة بدقة التفاعلات بين أنواع الخلايا، والمستقبلات، بروابط، و / أو المصفوفة خارج الخلية في علاقتها ببعضها البعض وكذلك البروتين المشارك توطين داخل خلية واحدة. على عكس تقنيات التصوير الأخرى، مضان المناعية كثافة تلطيخ قد ينخفض ​​فيمن أسابيع إلى أشهر التالية تلطيخ، ما لم تتخذ الاحتياطات المناسبة. على الرغم من هذا القيد، في العديد من التطبيقات ويفضل مضان مزدوج وضع العلامات على بدائل مثل tetrahydrochloride 3،3&#39;-diaminobenzidine (DAB) أو الفوسفاتيز القلوية (AP)، ومضان هو المزيد من الوقت الفعال ويسمح للتمايز أكثر دقة بين دولتين أو أكثر علامات. وتشمل المناقشة نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها والمشورة لتعزيز النجاح.

هذه النتائج بروتوكول تلطيخ في أقسام الأنسجة دماغ الفئران التي الخلايا الدبقية الصغيرة fluorescently المسمى في 594 قناة (الحمراء)، والخلايا العصبية المسماة في 488 قناة (الأخضر؛ انظر الشكل 4). إذا كان قد تم القيام به وصمة عار النووية، وسوف تظهر في القناة 405 (أزرق). يمكن ال...

Watch this Scientific Journal Video about Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons at JoVE.com

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

التمهيدي لالمناعية على نسيج Cryosectioned دماغ الفئران: مثال تلطيخ لالدبقية الصغيرة والخلايا العصبية

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

primer-for-immunohistochemistry-on-cryosectioned-rat-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.6K Views.  University of Arizona College of Medicine - Phoenix. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example. 

Video: Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

DiOLISTIC وصفها من الخلايا العصبية من القوارض والإنسان غير شرائح الدماغ الرئيسيات

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation من الخلايا العصبية من الدماغ القوارض شرائح لدراسة نقل صورة متشابك ومحطات قبل المشبكي

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Wholemount المناعية للكشف عن تضاريس دماغية معقدة

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

تحليل المناعى في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي الجرذ العقدة الليمفاوية أقسام الأنسجة

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

العزلة واستخراج الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As the first responders, microglia have important functions to mitigate neuron and glia dysfunction, and in this process, they undergo a broad range of morphologic changes. Microglia morphologies can be categorized descriptively or, alternatively, can be quantified as a continuous variable for parameters such as cell ramification, complexity, and shape. While methods for quantifying microglia are applied to single cells, few techniques apply to multiple microglia in an entire photomicrograph. The purpose of this method is to quantify multiple and single cells using readily available ImageJ protocols. This protocol is a summary of the steps and ImageJ plugins recommended to convert fluorescence and bright-field photomicrographs into representative binary and skeletonized images and to analyze them using software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) and FracLac for morphology data collection. The outputs of these plugins summarize cell morphology in terms of process endpoints, junctions, and length as well as complexity, cell shape, and size descriptors. The skeleton analysis protocol described herein is well suited for a regional analysis of multiple microglia within an entire photomicrograph or region of interest (ROI) whereas FracLac provides a complementary individual cell analysis. Combined, the protocol provides an objective, sensitive, and comprehensive assessment tool that can be used to stratify between diverse microglia morphologies present in the healthy and injured brain.

Microglia are brain immune cells that survey and react to altered brain physiology through morphologic changes which may be evaluated quantitatively. This protocol outlines an ImageJ based analysis protocol to represent microglia morphology as continuous data according to metrics such as cell ramification, complexity, and shape.

التحديد الكمي مورفولوجية Microglia من Photomicrographs Immunohistochemistry استعداد النسيج باستخدام إيماجيج

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.