Este protocolo le mostrará cómo manchar la microglia, realizar análisis cuantitativos de densidad y morfología, así como cuantificar la infiltración de macrófagos en el cerebro. Esta técnica permite al investigador medir los cambios en la distribución y morfología de la microglia de forma cuantitativa y diferenciar la microglia de la infiltración de macrófagos Este protocolo de análisis se puede aplicar fácilmente a otros modelos animales para medir los cambios en la distribución microgliaal y la morfología donde se dispone de anticuerpos anti-IBA1 y anti-TMEM119. Se recomienda llevar a cabo los recuentos celulares y trazas cegadas a la condición experimental y ser consistente en la forma en que se realiza este procedimiento.
Para comenzar este procedimiento, abra un programa de procesamiento de imágenes como Fiji o ImageJ que tenga instalado el complemento de distancia de vecino más cercano. Abra la imagen 20X si la escala está contenida en los metadatos del archivo y no se establece automáticamente a partir de los metadatos. En la barra de menús, seleccione Analizar, Establecer escala y, a continuación, introduzca la información correcta.
Para establecer la escala manualmente en función de una escala impresa en la imagen, seleccione la herramienta Línea recta. Coloque el cursor en el borde de la escala y mientras presiona la tecla Mayús, dibuje una línea lo más cerca posible de la escala de la imagen. Seleccione Analizar, Establecer escala.
Aparecerá una ventana que colocará la distancia y la unidad de longitud conocidas correctas para determinar la unidad de longitud del píxel y hacer clic en Aceptar. A continuación, seleccione Imagen, Color, Hacer compuesto para crear una imagen compuesta de todos los canales. En la barra de menús, seleccione Analizar, Definir medidas. Compruebe el área, centroide y perímetro.
En el menú desplegable Redirección a, seleccione Abrir archivo y, a continuación, haga clic en Aceptar. Vaya a Imagen, Color, Herramienta Canal para abrir la herramienta Canal. Utilice la herramienta Selección a mano alzada para dibujar un perímetro áspero alrededor de la región de interés. Haga doble clic en la herramienta Oval en la barra de herramientas para habilitar la herramienta Pincel de selección.
Asegúrese de que la casilla Habilitar pincel de selección esté activada y haga clic en Aceptar. Con el pincel de selección, ajuste el perímetro para que se ajuste mejor a la región de interés y, a continuación, presione T en el teclado en toda esta área para flechaR Y manager. Seleccione Analizar, Medir o Pulse la tecla M y aparecerá la ventana Resultados. Copie y pegue los resultados en una hoja de datos y guarde la información relativa al área.
Después de copiar el área de la región de interés, base la información desde la ventana Resultados haciendo clic en ella y presionando la tecla Retroceso. Seleccione la ventana Administrador de ROI, seleccione el seguimiento de ROI y cambie el nombre para que coincida con el nombre de la imagen pulsando Cambiar nombre. Haga clic en Aceptar y, a continuación, haga clic con el botón derecho en el nuevo nombre del seguimiento de ROI y guarde.
Haga doble clic en la herramienta Pincel en la barra de herramientas. Seleccione el color negro y el tamaño del pincel de 10. Asegúrese de que la opción Pintar en superposición esté desactivada.
En el canal TMEM119, coloque cuidadosamente un punto negro en el centro del soma para cada microglia positiva TMEM119. Coloque un punto blanco en el centro de las celdas que no sean positivas para TMEM119. Repita el mismo procedimiento para todas las celdas contenidas en la región de interés.
A continuación, seleccione Imagen, Color, Canal dividido, aparecerá una ventana para cada canal. Identifique el canal que tiene las anotaciones de puntos y cierre las otras dos ventanas. Para redirigir la nueva imagen de canal dividido, vaya a Analizar, Establecer medidas.
En el menú desplegable Redireccionar a, seleccione la imagen de canal dividido y haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione Imagen, Tipo y ocho bits. Vaya a Ajuste de imagen y seleccione Umbral. Ajuste los controles deslizantes hasta la izquierda en ambas barras.
Esto dejará sólo los puntos negros que ahora aparecerán blancos. Seleccione la región de interés en la ventana Administrador de ROI. En la barra de menús, seleccione Analizar, Analizar partícula.
En el cuadro de texto tamaño, introduzca uno a 20. La casilla de las unidades de píxeles debe permanecer desactivada mientras se activa la casilla que se encuentra para Mostrar resultados, Resumir y Agregar al administrador. Haga clic en Aceptar para mostrar la ventana Resumen que dará el número de puntos.
Copie y pegue esta información en la hoja de datos. A continuación, seleccione los complementos NND para mostrar la ventana NND. Cada número representa la distancia que cada microglia tiene a la microglia vecina más cercana.
Copie y pegue toda esta información en la hoja de datos. Vuelve a la ventana Umbral y ajusta el control deslizante superior hasta la derecha, lo que dejará todos los puntos blancos visibles, ahora apareciendo en blanco. Seleccione Analizar, Analizar partícula para mostrar la ventana emergente Analizar partículas.
Haga clic en Aceptar para mostrar la ventana Resumen que proporciona el número de puntos. Copie y pegue esta información en la hoja de datos. Vaya al Administrador de ROI y seleccione todos los puntos.
A continuación, haga clic con el botón derecho y guarde con el nombre de la imagen. Esto permitirá guardar todos los puntos de un archivo ZIP. En primer lugar, abra los archivos de imagen 4DX.
Aparecerá una ventana emergente preguntando si las imágenes deben abrirse en una pila. Haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione Imagen, Pilas, ZProject para abrir la ventana Proyección Z. Incluya todos los sectores desde el primer hasta el último sector.
Asegúrese de que la intensidad máxima está seleccionada en Tipo de proyección y haga clic en Aceptar. Haga clic en la nueva ventana que contiene el ZProject. Seleccione Imagen, Colores, Canales divididos y realice las trazas en las imágenes del canal IBA1. En la barra de menús, seleccione Analizar, Establecer medidas.
Compruebe el área, centroide y perímetro. En el menú desplegable Redireccionar a, seleccione el archivo abierto y haga clic en Aceptar. Para establecer la escala manualmente en función de una escala impresa en la imagen, seleccione la herramienta Línea recta. Coloque el cursor en el borde de la escala y mientras presiona la tecla Mayús, dibuje una línea lo más cerca posible de la escala de la imagen.
Seleccione Analizar, Establecer escala. Aparecerá una ventana. Introduzca la distancia conocida correcta y la unidad de longitud para determinar la unidad Píxeles por longitud y haga clic en Aceptar. Para medir el tamaño del soma en el canal IBA1, dibuje un perímetro áspero del soma con la herramienta Selección a mano alzada.
Haga doble clic en la herramienta Oval en la barra de herramientas para habilitar la herramienta Pincel de selección. Asegúrese de que la casilla Habilitar pincel de selección esté activada y haga clic en Aceptar. Con el Pincel de Selección, ajuste el trazo para que se ajuste mejor al soma. El acercamiento activará la precisión durante este paso.
A continuación, presione la tecla T para agregar el seguimiento soma al Administrador de ROI. Seleccione Analizar, Medir o pulse la tecla M para mostrar los resultados. Copie y pegue estos resultados en una hoja de datos.
Vaya a la ventana Administrador de ROI, seleccione la región de interés y cambie el nombre para que coincida con el nombre de la imagen pulsando Cambiar nombre. Haga clic con el botón derecho en la región de interés renombrada y haga clic en Guardar. Asegúrese de que el nombre especifica que el seguimiento es para soma y guarde el archivo.
Para medir el área de arborización en el canal IBA1, seleccione primero la herramienta Selección de polígonos. Haga clic en la extremidad del proceso microglial con la herramienta para iniciar la forma del polígono. Vaya alrededor de la microglia haciendo clic en las puntas de cada extremidad del proceso para formar un polígono que mejor represente el área cubierta por las arborizaciones microgliaales.
Cuando el polígono esté completo, haga clic en el punto de partida para cerrarlo. A continuación, presione la tecla T para agregar el seguimiento al Administrador de ROI. Seleccione Analizar, Medir o pulse la tecla M para agregar los datos a la ventana Resultados.
Copie y pegue estos datos en la hoja de datos. Para guardar la información relativa al área de arborización, vaya a la ventana Administrador de ROI, seleccione la región de interés y cambie el nombre para que coincida con el nombre de la imagen presionando Cambiar nombre. Haga clic con el botón derecho en la región de interés renombrada y haga clic en Guardar.
Asegúrese de que el nombre especifica que el seguimiento es para la arborización y guarde el archivo. Este estudio describió el flujo de trabajo paso a paso para la co-tinción inmunofluorescente de IBA1 y TMEM119 y para el análisis de la densidad microglial, distribución y morfología, así como de la infiltración celular mieloide periférica en el tejido cerebral del ratón. La microscopía de fluorescencia se utiliza para tomar imágenes del co-etiquetado de la microglia utilizando IBA1 y TMEM119 en la sección coronal del hipocampo dorsal con aumento de 20 veces.
Una tinción exitosa revela cuerpos celulares microgliales y sus procesos finos. La tinción permite la determinación de la densidad y distribución microglial y la identificación de cúmulos microgliales y macrófagos infiltrados. La microscopía confocal se utiliza para tomar imágenes del procedimiento de rastreo de arborización microglial escalonada a un aumento de 40X.
Estos resultados representativos muestran la microglia positiva DE IBA1 y la microglia positiva TMEM119, así como un ejemplo de rastreo del cuerpo celular. Es importante ser consistente al contar las células y prestar atención a ambas señales de IBA1 y TMEM119. Esta técnica permite al investigador identificar regiones del cerebro que se ven afectadas por un estímulo particular que luego se puede estudiar más en profundidad con técnicas complementarias.
