This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.

1. 3D cultivo celular y preparación de la Imagen <ol><li> Cultura una línea celular apropiada, es decir, colon HCT116 línea celular de carcinoma, en dos dimensiones, cultivo en monocapa. </li><li> Crecer HCT 116 células en un matraz T-25 con los medios de McCoy 5A + suero bovino fetal al 10% en un incubador de CO2 al 5% hasta 50-70% de confluencia, que toma generalmente unos pocos días. </li><li> Células liberan con solución de tripsina-EDTA 0,25% y cuentan una parte de las células utilizando un hemocitómetro y tinción con azul de tripán para comprobar la densidad celular y viabilidad. </li><li> Después de conteo, diluir las células con medio completo para lograr una densidad de siembra apropiada de 6.000 células / pocillo, o 30.000 células / ml. </li></ol> 2. Preparar agarosa revestidos placas de 96 pocillos <ol><li> Añadir 0,19 g de agarosa a 10 ml de medios estándar en un tubo cónico de 50 ml (solución de agarosa al 1,5% en medios de comunicación) 10. Asegurar la incorporación por mezcla suave. Autoclave la agarosa en un baño de aguadurante 20 min. </li><li> Con una pipeta multicanal, aspirado 50 l de la mezcla de agarosa + medios de comunicación en los 60 pozos centrales de la placa de cultivo de placa de fondo 96 plana. Como los pozos en los bordes periféricos de la placa tienen ligeramente más altas tasas de evaporación, añadir 200 l de fosfato 1x solución salina tamponada (PBS) en lugar de la agarosa a estos bordes. </li><li> Una vez que la mezcla de agarosa se ha añadido a los pozos internos, ajuste el plato a un lado enfriar a ~ 37 ° C antes de la adición de las células. </li></ol> 3. Las semillas y cuidar el cultivo tridimensional NOTA: Más o menos células se pueden sembrar en función de los requisitos de la cultura involucrados, pero se ha determinado que estas condiciones resultan en estructuras de cultivo de células en 3D de aproximadamente 1 mm de diámetro después de 10-14 días de cultivo (datos no mostrados) . <ol><li> Añadir 200 l de la solución celular apropiado (diluido para contener ~ 6000 células) a la agarosa recubiertaPlaca de 96 pocillos. Cubrir la placa y poner en incubador humidificado con 5% de CO2 a 37 ° C para el crecimiento celular. </li><li> Cambie medio celular un mínimo de cada 48 horas, o cuando aparezca el medio que se va cambiando de color. <ol><li> Cambio de medio por aspiración cuidadosamente los viejos medios de todo el pequeño cultivo de células 3D (visible a simple vista por día 2) en la parte inferior de la agarosa. Añadir 200 l de medio fresco suavemente sobre el cultivo celular en 3D. </li><li> (Paso opcional) Durante estos cambios de medio, añadir quimioterapia u otros medicamentos para la prueba. Diluir el fármaco de elección a la concentración final con medio completo y añadir los necesarios 200 l a cada pocillo. </li><li> Monitor 3D de crecimiento de cultivo de células mediante microscopio óptico, hasta que los cultivos de células 3D son aproximadamente 1 mm de diámetro. </li></ol></li></ol> 4. Cosecha los Cultivos Celulares 3D <ol><li> Use un 2 ml pipeta serológica para eliminar suavemente el cultivo de células en 3D de la cama de agarosa. </li> &lt;li&gt; Lavar los cultivos de células en 3D con PBS pipeteando suavemente en aproximadamente 1 ml de PBS en una placa de espera de 24. </li><li> Transferencia cosecha cultivos de células en 3D a través de una pipeta serológica a tubos de centrífuga de proteína o metabolito de extracción, o incrustarlos en un medio de corte para ayudar a cortar para aplicaciones de imagen. </li></ol> 5. Integrar los cultivos celulares 3D en gelatina <ol><li> Preparar una solución de ~ 175 mg / ml de gelatina en agua de alta pureza (18 MΩ preferido). 22,23 Mezclar la gelatina con vigor. Observe la solución convertirse viscoso y difícil de manipular. Coloque el tubo cónico que contiene gelatina en un baño de agua a ~ 60 ° C y caliente hasta que la solución se vuelva clara y fácil de aspirado. NOTA: La solución de gelatina caliente se endurece rápidamente a medida que se enfría, por lo que realizar todos los pasos siguientes rápidamente antes de la congelación. </li><li> Después se calienta, tomar la gelatina de inmediato a la campana de cultivo celular. Mantenga el tubo con la gelatina en un beaker con agua precalentado a unos 60 ° C para evitar el endurecimiento de la solución de gelatina. </li><li> Utilizando una pipeta serológica de 2 ml, depositar 0,6 ml de la solución de gelatina caliente en el pocillo de una placa de fondo plano de 24. Este volumen es suficiente para cubrir el fondo en una capa delgada. Depositar suavemente los cultivos de células 3D inmediatamente en la parte superior de la capa de gelatina utilizando una pipeta de 2 ml diferente para evitar la ruptura de la estructura 3D. NOTA: Se debe tener cuidado en esta etapa no colocar PBS en la gelatina. Si esto sucede, sin embargo, eliminar el PBS desde la parte superior de la gelatina utilizando una pipeta de 200 l. </li><li> Después de que los cultivos de células 3D se colocan en la superficie de la capa de gelatina, cuidadoso pipeteado otro 0,6 ml de la mezcla de gelatina caliente sobre los cultivos de células 3D, a fin de no perturbar la posición de las culturas. Después se coloca la segunda capa, la congelación de los cultivos de células 3D de gelatina embebido a -80 ° C. </li></ol> 6. Corta y Descongele Monte ªe Gelatina incrustado-Cultivos Celulares 3D para espectrometría de masas Imaging <ol><li> Retire la placa de 24 pocillos que contienen los cultivos de células en 3D desde el congelador. Calentar la parte inferior de la placa con el calor de la mano hasta una pinza o un bisturí se deslice suavemente hacia abajo el lado del pozo. </li><li> Suavemente deslice la pinza o un bisturí, liberando la gelatina sin descongelar el centro. Tome una gota de agua para el apoyo criostato y usar esto para adherir el disco de gelatina al soporte. <ol><li> Cultivos de células 3D incrustados en gelatina son más susceptibles de cortar a -30 ° C. Limpiar la cuchilla criostato y vidrio con etanol al 70% antes de su uso. Use una parte distinta de la hoja o una cuchilla nueva para cada disco cultura-gelatina celular 3D para evitar embotamiento de la hoja. </li></ol></li><li> Utilizando el criostato, cara suavemente el exceso de gelatina hasta que los cultivos de células 3D se hacen visibles. </li><li> En este punto lentamente cortar los cultivos de células en 3D con un movimiento suave de 12 a 16 micras secciones. NOTA: Los factores críticos a rebanar incluyen la distancia del vidrio a la hoja, el ángulo de la hoja, la temperatura del criostato, y el ángulo del disco sobre el soporte, por lo que todos ellos se debe comprobar para asegurar resultados consistentes. </li><li> Descongelar cuidadosamente las rebanadas y montarlos en óxido de titanio (ITO) portaobjetos de vidrio recubiertas de indio etiquetados adecuadamente y guárdelo en un desecador. Utilice las rodajas lo más rápido posible para obtener la máxima calidad. </li></ol> Aplicación 7. Matriz y Preparación de muestras para MALDI Imaging <ol><li> Antes de las imágenes MALDI, preparar las rebanadas con la matriz apropiada. <ol><li> Para análisis de moléculas pequeñas, generalmente se requiere ningún paso de lavado. Para la detección de la proteína intacta, lavar las rodajas en frío 100% de acetona, el fluido de Carnoy, o 70% / 95% de isopropanol para eliminar las pequeñas moléculas tales como lípidos que podría enmascarar la señal de 24 - 26. </li><li> Lave con cuidado para no más de 30 segundos a la vez. Nomolestar a algún segmento. </li></ol></li><li> Preparar la matriz en una solución de disolvente orgánico y agua, con 0,1% de TFA. Para la pequeña molécula tal como α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA), utilizar 60% de ACN: 40% H 2 O: 0,1% de TFA (10 mg / ml). Para la detección de proteínas, tales como el ácido sinápico (30 mg / ml), utilizar la misma solución de disolvente. Para solubilidad óptima del ácido sinápico, disolver primero en acetonitrilo antes de la adición del TFA: H 2 O solución. Otras matrices se pueden utilizar según sea apropiado. NOTA: Matrix se puede aplicar con varios métodos diferentes, pero debe tenerse en cuenta se han encontrado algunas matrices de co-cristalizar con la gelatina, tal como ácido ferúlico, haciendo que la muestra inutilizable. Cristales más pequeños producen espectros de masas más consistente, lo que permite más especies moleculares para ser detectado y atribuido a diferencias biológicas en lugar de los efectos de matriz. </li><li> Aplicar la matriz por el método handspotting. <ol><li> Use una jeringa con punta fina para aplicar 0,5 l de la matrsolución ix en la rebanada de cultivo de células en 3D y permite la matriz a cristalizar. </li></ol></li><li> Como alternativa, utilice el método aerógrafo. Llene un aerógrafo de calidad comercial con la solución de matriz. <ol><li> Sostenga el pulverizador 8.12 pulgadas de distancia de la diapositiva, apuntar una pulverización fina en el segmento. En entre pasadas, permita que la matriz se seque durante 1 min para permitir la mejor formación de cristales. Hasta 10-20 pasadas del aerógrafo se requiere para producir una capa óptima de matriz 22. </li></ol></li><li> Como alternativa, utilice el método de sublimación detalla en otras partes. 25,27 </li><li> Diapositivas seca en un desecador durante al menos 30 min antes de MALDI-MSI, independientemente del método de aplicación de la matriz. 25 </li></ol> 8. MALDI-MSI Análisis Utilizando un sistema MALDI-TOF (es decir, AUTOFLEX III) NOTA: Esta sección contiene instrucciones y consejos para establecer los parámetros para un experimento de imágenes MALDI-TOF. Dependiendo de las insfabricante y el software utilizado instru-, el proceso puede variar. <ol><li> Colocar los portaobjetos en un adaptador hecho para sostener con seguridad 75 mm diapositivas x 25 mm a la imagen las rodajas de cultivo de células en 3D adjuntado a las diapositivas recubiertos de ITO. Cargue el adaptador de diapositivas en el instrumento. </li><li> Prepare el instrumento para MALDI-MSI, puede seleccionar un estándar de calibración adecuado para el rango de masas en cuestión. Para interrogatorio de pequeñas moléculas, las señales detectadas que corresponden a la matriz utilizada, α-CHCA, son un grupo común de calibradores. Para el análisis de las proteínas, se seleccionan patrones de proteína conocida (es decir, la ubiquitina, tripsinógeno) en el rango de masas de interés y manchado adyacente a los cultivos celulares 3D como calibradores. Calibre el instrumento antes de continuar con el desarrollo del método. </li><li> Antes de las imágenes, el desarrollo de métodos de adquisición de datos para el rango de masas de elección mediante el software proporcionado por el fabricante del instrumento. Ver las figuras 1 y 2 parapequeña molécula y de formación de imágenes de proteínas. Para imágenes molécula pequeña, utilice reflectrón modo para la más alta resolución de masas. <ol><li> Ajuste el rango de masas para la adquisición de datos de moléculas pequeñas entre 100-1.000 m / z y de proteínas entre 8,000 25,000 m / z. Ajuste el rango de masas para abarcar la región de elección mientras que proporciona la resolución más alta masa posible con el instrumento. </li><li> Ajuste la potencia del láser, la frecuencia, el número de disparos de láser y tamaño de punto que utilizan la solución de calibración y un cercano rebanada cultivo celular 3D &#39;sacrificio&#39;. Observar estos ajustes en el software de control principal instrumento. Utilice la siguiente configuración como punto de partida recomendado: 60% de potencia, 400 disparos de láser, ultra-pequeño tamaño del punto. Estos ajustes variarán de instrumentos y métodos, de modo de optimizar los parámetros del instrumento para dar a los espectros de alta calidad para cada instrumento específico. Otros parámetros que se pueden ajustar incluyen la ganancia del detector, frecuencia de muestreo, y la ganancia electrónica. Save este método para su uso en el software de imagen (es decir., Método autoexecute que FlexImaging aprovechará). NOTA: iones Suprimir debajo de la gama de masa de interés (de nuevo encontraron en el control de instrumentos) a fin de no interferir con la detección. </li><li> Desarrollar métodos de adquisición de datos de proteínas para el rango de masas de elección. Siga los mismos pasos descritos anteriormente, pero para los rangos de masa-medias y altas, por encima de aproximadamente 3 kDa, utilice el modo lineal. NOTA: los ajustes difieren de los utilizados para los métodos de moléculas pequeñas. </li></ol></li><li> Parámetros de los instrumentos de configuración específicos de EM utilizando el software de imagen proporcionada por el fabricante del instrumento, como FlexImaging para sistemas de Bruker MALDI-TOF. <ol><li> Crear un nuevo archivo de imágenes y la carpeta, usando los métodos desarrollados previamente y guardado. Seleccione los parámetros del instrumento tales como tamaño de punto de trama (el cambio desde el valor predeterminado 200 micras a 50 micras), podrá establecer el método de control de instrumentos (instalación del paso 8.3.2 o 8.3.3), y posición donde para escanear el cultivo de células en 3D. </li><li> Seleccione tres puntos enseñar apropiadas en la muestra, se mueve el láser para cada uno de ellos. Obtenga la fotografía óptica desde el software de control del láser MALDI-TOF utilizando &#39;Imprimir pantalla&#39;. NOTA: Muchos programas de software de formación de imágenes requieren una fotografía óptica de la muestra de &quot;enseñar&quot; el software donde se encuentra el láser, que se puede obtener con un escáner o una cámara a menudo el instrumento. </li></ol></li><li> A continuación, iniciar el proceso de formación de imágenes del software de imagen (no el control de instrumentos) y adquirir los espectros de masas de cada rebanada. Observe mayoría de las masas de todo el cultivo de células en 3D y otras localizadas en áreas particulares. </li></ol> 9. Métodos de análisis de datos opcionales <ol><li> Para el análisis objetivo, ejecutar el análisis manual de los espectros haciendo clic en una masa en el espectro medio, o permitir que el software de imágenes para recoger automáticamente masas por encima de un umbral determinado (por ejemplo., Picos above el umbral superior al 20%). Para el control de calidad, examinar la distribución de los picos de la matriz o el espectro media. </li><li> Realizar análisis estadísticos con datos extraídos de software matemático como R o Matlab. <ol><li> Exportación espectros solo en formato ASCII, un archivo de texto legible, para cargar en el software de su elección. </li><li> Convertir los espectros individuales a ASCII, mzXML, de formato mzML para la lectura de varios programas de software diferentes, 28 -. 31 o exportar los datos como un Analizar (.img) archivo de formato, un formato común utilizado para otras aplicaciones de imagen como la resonancia magnética 32 Dos opciones de código abierto para el análisis son MSiReader y BioMap 32,33. </li><li> Una vez que los archivos se exportan en un formato legible por el software, cargar el conjunto de datos a través de las instrucciones del software respectivo. Después de la carga, un tratamiento posterior a la adquisición, tales como la eliminación de línea de base y la normalización. </li><li> Con este conjunto de datos, realice Statitratamientos stical tales como el análisis de componentes principales de la agrupación jerárquica ya sea utilizando scripts o construidas en los algoritmos de software como Matlab 18 personalizados. </li></ol></li></ol>

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G. a., Eng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+open+representation+of+mass+spectrometry+data+and+its+application+to+proteomics+research.">A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research.</a> Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).</li><li>Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+mzXML+good+for.">What is mzXML good for.</a> Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).</li><li>Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -. J., Binz, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+the+data+explosion.+A+report+on+the+HUPO-PSI+Workshop.+August+2008,+Amsterdam,+The+Netherlands.">Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands.</a> Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).</li><li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSiReader:+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform.">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction.</a> Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).</li></ol>

This article is part of a special issue on Multimodal Pre-Clinical Imaging, sponsored by Bruker Biospin. The MALDI-TOF system used to obtain the representative results is a Bruker AutoFlex III.

Utilizando los métodos descritos anteriormente, los cultivos celulares pueden cultivarse en 3D y se analizaron con MALDI-MSI. Muchas líneas celulares inmortalizadas formarán estructuras 3D cuando se cultivan adecuadamente 9,10. Se debe tener cuidado para cultivar células que no se han pasado demasiadas veces, es decir, tener bajos números de paso. En general, las células con un número de paso de diez e inferior son óptimas para el crecimiento de los cultivos de células en 3D. Crecimiento de los cultivos de células en 3D en un soporte de agarosa tradicional proporciona una manera rentable para los grupos de investigación interesados ​​en el cultivo de células en 3D para probar este sistema. Este método utiliza algunos componentes no ya en la mayoría de los laboratorios de cultivo de células de mamíferos. Es necesario prestar cuidadosa atención a la preparación de las placas de agarosa para el crecimiento de manera que los cultivos celulares 3D son compatibles en tamaño y forma; algunos aspectos que requieren una cuidadosa atención incluyen la comprobación de que no hay burbujas de aire quedan atrapadas a la mezcla y que un menisco adecuado se forma en la parte inferior de cada well. Si el menisco no se forma correctamente, las células pueden crecer en formas no esferoide o en pequeños grupos. Además, debe tener cuidado de no colocar PBS en la gelatina con los esferoides cuidado. Si esto ocurre, retire el PBS desde la parte superior de la gelatina con una pipeta 200 microlitros. Si el coste no es un factor, placas de fondo redondo de unión ultra-bajas son comercialmente disponibles y ofrecen simplificación de estos pasos. Mientras que otros métodos de incrustación de tejidos también pueden ser compatibles espectrometría costoso y no masa, gelatina-incrustación se ha demostrado que ser barato y versátil. Estrategias de preparación antes mencionados han sido optimizados para cultivos de células en 3D para obtener los datos de la más alta calidad. Si bien la gelatina-incrustación se ha demostrado que ser compatible con el análisis de espectrometría de masas, este proceso hace disminuir las matrices disponibles debido a la co-cristalización. Una vez congelados, los cultivos celulares 3D son estables durante meses, siempre y cuando no se descongelan por congelación. La gelatina se vuelve opaca cuando se congela, y la célula 3Dculturas son de un color similar, por lo que es aconsejable antes de la congelación para documentar la colocación de cultivo de células en 3D para ayudar en la corte. En la preparación de diapositivas, la matriz se puede aplicar con varios métodos diferentes, pero debe tenerse en cuenta que se han encontrado algunas matrices de co-cristalizar con la gelatina, tal como ácido ferúlico, haciendo que la muestra inutilizable. Cristales de la matriz pequeños producen espectros de masa más consistente. Mientras handspotting es el método más simple de aplicación de la matriz, el volumen de disolvente más grande puede dar lugar a tamaños de los cristales más grandes y la migración analito significativo. En el espectrómetro de masas, los avances en las tecnologías de MALDI-MSI han reducido los conocimientos especializados necesarios para los análisis de inicio. Adquisición y análisis de datos es sencillo en la mayoría de los sistemas, lo que permite que incluso un novato para obtener información de alta calidad a partir de diapositivas recubiertos de ITO. La selección cuidadosa de los parámetros del instrumento, optimizado en la cercana sin imagen cultur celular digno 3Des, es fundamental para la obtención de datos de alta calidad. Por ejemplo, el aumento de la potencia del láser puede aumentar la intensidad del pico, pero la disminución de la potencia del láser puede mejorar la resolución y dar formas de los picos más simétricas. Cultivos de células en 3D deben utilizarse rápidamente después de rebanar para garantizar la calidad de la muestra óptima. Degradación de la señal de proteína puede ser visto en menos de una semana sin almacenamiento adecuada (desecador / -80 ° C congelador), en particular en la región de masas de alta (por encima de 20 kDa). Debido a la creciente demanda, muchos programas de software de visualización diferentes han sido desarrollados y son gratis para el público de investigación. La mayoría de los espectrómetros de masas de imagen han instalado el software necesario para visualizar masas individuales con los formatos propietarios usados ​​en cada instrumento. Estos programas de software pueden ser utilizados para obtener imágenes de una sola masa y exportar los datos. La mayoría del software también permitirá la superposición de dos o más masas de interés. Además, muchos de los espectadores diferentes para los datos de MSI son de descarga gratuita, como un MSiReaderd BioMap 32,33 Los datos de espectrometría de masas obtenidos también pueden ser procesados ​​después de la adquisición con facilidad, con lo que la información más útil a la vanguardia.. De farmacéuticos a los lípidos a las proteínas, el sistema descrito anteriormente permite la adquisición rápida de datos para evaluar la distribución de moléculas de interés a través de una estructura de cultivo celular en 3D. Las secciones seriadas se pueden tomar a la imagen de toda la estructura en 3D mediante la construcción de cada imagen 2D de una rebanada del cultivo celular 3D. Las técnicas y las notas en el protocolo serán de utilidad para los investigadores que desean empezar un cultivo celular tridimensional como un puente entre la cultura monocapa y modelos animales. Una vez dominado, estas técnicas se pueden aplicar a varios tipos de 3D culturas celulares, tejidos y cultivos celulares, permitiendo a los investigadores a la imagen lo que muestras que eligen.

Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1&#8211;4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5&#8211;7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8&#8211;11
3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12&#8211;14
All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15&#8211;21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCT116 Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-247</td>
			<td>Potential hazard, handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16600-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin, unflavored</td>
			<td>Knox</td>
			<td>--</td>
			<td>Available at most grocery stores in single-packets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITO-coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Limited</td>
			<td>CG-90IN-S115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sinapic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set</td>
			<td>RoyalMax Airbrush</td>
			<td>--</td>
			<td>Many options available on sites such as Amazon.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3d cell culture models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Formación de imágenes MSI tiene el potencial para revelar muchos distribución molecular diferente en cultivos de células 3D. Utilizando el método descrito anteriormente, las especies de moléculas pequeñas (Figura 1) a las proteínas grandes (Figura 2) pueden ser rastreados a través de la cultura. Estos resultados muestran la visualización de un solo ion con la herramienta gratuita MSiReader. 32 Los resultados pueden ser analizados para los iones individuales de interés a través del cultivo de células 3D con software de visualización, ya sea en una región de interés o la totalidad de la región escaneada. Además la mayoría de software visualizará automáticamente iones por encima de un determinado umbral fijado por el usuario, lo que puede ayudar a los esfuerzos de descubrimiento. Una vez que se obtienen mapas individuales de iones, la mayoría del software incluye la capacidad de superponer las imágenes para ver la colocalización de iones. Ya sea en enfoques basados ​​en el descubrimiento o de una manera específica, de formación de imágenes espectrometría de masas es una herramienta poderosa para analizar cultivos de células 3D. Figura 1. Los resultados representativos de crecimiento del cultivo celular 3D y seccionamiento. Izquierda) Imagen óptica de una estructura de cultivo de células intactas HCT-116 3D colorrectal como se ve en el día 14 antes de la cosecha. Derecha) Imagen Óptico de una rodaja de aproximadamente ecuatorial de un colorrectal deshielo cultivo celular 3D montada sobre un portaobjetos recubiertos de ITO para la imagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> Figura 2. Los resultados representativos de molécula pequeña MALDI-MSI de una sección ecuatorial de un cultivo de células 3D. Top) los espectros de masa media alcanzada con α-CHCA en la gama baja de masas (pequeña molécula). Bottom) Imágenes representativas deuna sola masa: 327,8 m / z localiza principalmente en el interior del cultivo celular en 3D y 429,7 m / z localizada principalmente en el borde del cultivo celular en 3D. La línea de puntos indica el borde aproximada del esferoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> Figura 3. Los resultados representativos de formación de imágenes de proteínas por MALDI-MSI de una sección ecuatorial de un cultivo de células 3D. Top) los espectros de masa media alcanzada con ácido sinápico en el (rango de proteína) de masa superior. Bottom) Imágenes representativas de una sola masa: 10.871 m / z localizada principalmente en el borde del esferoide, y 12.184 m / z localizada más hacia el interior del esferoide. La línea de puntos indica el borde aproximada del esferoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Líneas celulares de cáncer inmortalizadas pueden ser cultivadas como cultivos de células en 3D, un modelo valioso para la investigación biológica. Este protocolo describe imágenes espectrometría de masas de cultivos de células en 3D, incluyendo mejoras en la plataforma de preparación de la muestra. El objetivo de este protocolo es instruir a los usuarios preparar cultivos de células en 3D para el análisis de imágenes de espectrometría de masas.

Preparación de la muestra Estrategias para Espectrometría de Masas de imágenes de modelos de cultivo celular en 3D

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

sample-preparation-strategies-for-mass-spectrometry-imaging-3d-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.0K vistas.  University of Notre Dame.  Líneas celulares de cáncer inmortalizadas pueden ser cultivadas como cultivos de células en 3D, un modelo valioso para la investigación biológica. Este protocolo describe imágenes espectrometría de masas de cultivos de células en 3D, incluyendo mejoras en la plataforma de preparación de la muestra. El objetivo de este protocolo es instruir a los usuarios preparar cultivos de células en 3D para el análisis de imágenes de espectrometría de masas. 

Video: Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Investigación

Bioingeniería

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Preparación de fibrina Andamios 3D para Aplicaciones madre para cultivo celular

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Obtención de imágenes de tejidos biológicos por desorción ionización electrospray espectrometría de masas

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

La eliminación selectiva de células de Cultura mezclada 3D mediante técnica de infrarrojo cercano Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Todo el cuerpo de Espectrometría de Masas de imágenes por infrarrojos asistida por matriz de desorción láser de ionización electrospray (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparación de geles de colágeno en 3D y microcanales para el estudio de las interacciones 3D<em&gt; En Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Establishing the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture

To begin, take the pellet of the GFP-HUVECs grown to a confluence level of 80 to 100%and resuspend the cells in an appropriate volume of basal medium to achieve a concentration of one times 10 to the seventh cells per milliliter of stock solution. Prepare 50-milliliter conical centrifuge tubes containing the required volume of basal medium supplemented with the respective growth factors. Add the GFP-HUVECs from the stock solution at a dilution of one to 66.67 to achieve a concentration of 1.5 times 10 to the fifth cells per microliter.Then aspirate the medium from the plate containing the stromal monoculture and add 200 microliters per well of the prepared GFP-HUVECs suspension. Incubate at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide in a humidified atmosphere, changing the medium every three to four days. Monitor the development of the culture by bright-field and fluorescence microscopy using a five times objective.Differences between the cultures could be observed from the bright-field and fluorescence images showing only the GFP-HUVECs. The cultures appeared less developed without any growth factor, However, faster development was observed in the presence of FGF-2. In contrast, the bright-field images showed the densest cultures in the presence of BMP-2.However, vascular like networks formed in both growth factor-containing conditions and the most extensive and interconnected networks were formed with FGF-2.

Establecimiento del cocultivo 3D de células estromales-endoteliales

Generación escalable de esferoides de célula uniforme mediante un dispositivo de ensamblaje acústico 3D

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Autor destacado: Desarrollo de un método de ensamblaje acústico sin andamios para el cultivo de esferoides celulares 3D de alta calidad 

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Dispositivo de montaje acústico tridimensional para la fabricación en masa de esferoides celulares

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...