Agradecemos sinceramente al Dr. Cindy N. Chiu ayuda con electroforesis en gel, y Andy Zhou y Michael Grodick por su generosa donación de ADN y enzimas de restricción. Agradecemos el profesor J. Heath y el profesor D. Prober para generoso acceso a equipos y materiales. Agradecemos al Dr. Karn Sorasaenee para sugerencias útiles. Damos las gracias a Mary H. Tang para la creación de la figura utilizada en la visión esquemática en el video. El financiamiento fue proporcionado por Johnson &amp; Johnson y USC Y86786.

NOTA: Cuando se trabaja con RNA mantener un ambiente de trabajo limpio para evitar la contaminación por DNasa y RNasa enzimas que degradan el ADN y el ARN. Asegúrese de que las puntas de pipeta y tubos son DNasa y RNasa libre. También es útil para limpiar superficies de laboratorio y equipos tales como pipetas, sostenedores de tubos, etc., con una solución de descontaminación. 1. ARN Transcripción con Tratamiento Corrole <ol><li> Prepare el corrole y compuestos inhibidores en un 0.01: 1 proporción molar de [complejo]: [ADN]. NOTA: En nuestro caso, la proporción era de 4,3 fmol complejo: 0,43 pmol de ADN, donde la plantilla de ADN utilizado fue vector APET-28 quater con el gen Liga de E. coli bajo el control del promotor T7. Otros ADN con el promotor de T7 también son candidatos válidos para ejecutar el ensayo de transcripción. <ol><li> Disolver actinomicina D, triptolide, tpfc, y Ga (tpfc) en dimetilsulfóxido (DMSO) en recipientes limpios diferentes. Obtener la concentración final de un 0,01: 1 relación molar de [complex]: [ADN] utilizando diluciones seriadas con agua libre de nucleasa. <ol><li> Disolver 1 mg actinomicina D en 1,8 ml de DMSO. Alícuota de 10 l a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una dilución 1/100. Alícuota 1 l de la dilución a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una dilución 1 / 1.000. NOTA: La concentración de la solución final de la actinomicina D es 4,3 fmol. </li><li> Disolver 1 mg de triptolida en 0,64 ml de DMSO. Alícuota 1 l a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una dilución 1 / 1.000. Alícuota 1 l de la dilución a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear un segundo 1/1000 dilución. NOTA: La concentración de la solución final de triptolida es 4,3 fmol. </li><li> Disolver 1 mg tpfc en 2,9 ml de DMSO. Alícuota de 10 l a otro recipiente y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una centésima dilution. Alícuota 1 l de la dilución a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una dilución 1 / 1.000. NOTA: La concentración de la solución final de tpfc es 4,3 fmol. </li><li> Disolver 1 mg Ga (tpfc) en 2,6 ml de DMSO. Alícuota de 10 l a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una dilución 1/100. Alícuota 1 l de la dilución a un recipiente separado y diluir a 1 ml con agua libre de nucleasa para crear una dilución 1 / 1.000. NOTA: La concentración de la solución final de Ga (tpfc) es 4,3 fmol. NOTA: Estos corroles e inhibidores no son solubles en agua y deben ser previamente disueltos en DMSO. Pequeñas cantidades de DMSO (inferior al 1%) no inducen la citotoxicidad en las células (datos no publicados). </li></ol></li></ol></li><li> Antes de comenzar la reacción de transcripción, preparar los reactivos necesarios individual o comprarlos a un proveedor comercial. <ol><li> Deshielo en hielo todo se congelón reactivos (consulte la Tabla 1 para obtener una lista de los reactivos congelados). </li><li> Permitir el 10x tampón de reacción y el 4 ribonucleótido (ATP, CTP, GTP y UTP) soluciones hora de mezclar hasta que esté completamente disuelto en solución. </li><li> Centrifugar brevemente todos los reactivos para evitar la pérdida de material en el borde del tubo. Una vez descongelado, almacenar ribonucleótidos en hielo mientras se mantiene el 10x tampón de reacción a temperatura ambiente. </li><li> Combine los reactivos para la reacción de transcripción a RT (consulte la Tabla 2 para obtener una lista de los reactivos). NOTA: La espermidina en el tampón de reacción 10x puede coprecipitar la plantilla de ADN si la reacción está montado sobre hielo en lugar de a temperatura ambiente. </li><li> Mezclar bien con un movimiento rápido del tubo o pipetear la mezcla arriba y abajo suavemente. Después de mezclar, centrifugar brevemente para recoger mezcla de reacción en la parte inferior del tubo. </li><li> Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante un total de 2-4 h. NOTA: Los tiempos de reacción necesarios variaráncon el tamaño de plantilla de ADN y la secuencia. Este paso puede requerir optimización para secuencias específicas. Plantillas más cortas pueden requerir tiempos de reacción más largos para un alto rendimiento de ARN total. </li><li> Retire los 4 alícuotas de cada reacción después de cada hora y almacenar a -20 ° C. Modifique según sea necesario para los puntos de tiempo deseados. </li></ol></li></ol> 2. ARN spin columna <ol><li> Después de la reacción de transcripción, purificar el ARN utilizando columnas de cromatografía compatible con microcentrífuga. NOTA:. El uso de columnas de espín ARN para purificar el ARN con mayor que 20 bases resultados en la recuperación mayor que 80% 44 NOTA: La cromatografía en columna es un método común y conveniente para purificar el ARN. Otros métodos de purificación también existen tales como precipitación con cloruro de litio, extracción con fenol: cloroformo, precipitación con isopropanol, así como otros kits disponibles comercialmente. <ol><li> Uniformemente resuspender la matriz de Sephadex en el tampón de la columna mediante la inversión de la vigorosamentela columna tres o más veces. Haga esto con un movimiento rápido de la columna bruscamente. </li><li> Retire la tapa superior de la columna. Habrá alguna matriz Sephadex residual en la tapa; Si la tapa está lleno de la matriz, coloque la tapa en la columna y repita el paso anterior hasta que la mayoría de la matriz es en la columna. </li><li> Encajar la punta inferior de la columna. NOTA: Algunos líquido puede escapar de la columna. </li><li> Empaque la columna. <ol><li> Colocar la columna en una estéril (RNasa y DNasa) tubo de 1.5 ml. </li><li> Centrifugar el tubo en una centrífuga de mesa a 1000 xg durante 1 min. </li></ol></li><li> Desechar el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con tampón eluye de la columna. </li><li> Inmediatamente colocar la columna en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y pipetear la muestra al centro de la cama de la columna. Utilice 20-50 l de muestra para evitar la sobrecarga de la columna. </li><li> Centrifugar el tubo en una centrífuga de mesa a 1000 xgdurante 1 min. NOTA: El eluyente es la muestra de ARN purificado. </li></ol></li></ol> 3. agarosa electroforesis en gel (1% en gel de agarosa) 42 NOTA: El bromuro de etidio emite fluorescencia tras la unión a ADN y ARN, por lo tanto, estas biomoléculas se puede visualizar con la luz UV mediante la incubación con 0,5 mg ml de bromuro de etidio solución /. <ol><li> Preparar una solución de stock 1,000x de bromuro de etidio (0,5 mg / ml) por disolución de 5 mg de bromuro de etidio en 10 ml de agua. </li><li> Preparar Tris acetato EDTA (TAE) tampón de desarrollo para la electroforesis en gel. Para hacer un tampón 50x TAE combinan 2,0 M Tris-acetato con 0,05 M de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y ajustar el pH a 8,5. </li><li> Preparar un gel de agarosa al 1% (peso / volumen) mediante la disolución de 10 g UltraPure agarosa en 1 L de tampón 1x TAE y la fusión de la agarosa con un horno de microondas convencional. Una vez que se ha enfriado a 50 ° C, añadir 1 ml de bromuro de etidio 1,000x a la solu gel de agarosa al 1%ción, mezclar girando suavemente o invirtiendo en un recipiente cerrado, a continuación, vierta la solución de agarosa en una plataforma para fundición de gel y permitir que el gel se solidifique a temperatura ambiente. NOTA: El bromuro de etidio es un mutágeno y carcinógeno potencial. Use guantes y manejar soluciones cuidadosamente. Para los procedimientos adecuados de manipulación de bromuro de etidio, consulte: <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</a> . </li><li> Después de que el gel se ha solidificado, colocar el gel de conjunto en el tanque de electroforesis. Agregar suficiente tampón TAE para cubrir el gel hasta que se sumergen los pozos. Compruebe que el nivel del tampón TAE es de aproximadamente 1 mm por encima del nivel del gel. Quite el peine de gel. NOTA: Quitar el peine después pozos están sumergidos evita bolsas de aire quede atrapado en los pozos. </li><li> Preparar las muestras de ARN. Combine 1 l de cada alícuota de la muestra purificada con gel 1 l Loading Buffer (o con 1 l de 10x tampón de carga y diluted a 10 l con agua libre de nucleasa) y mezclar bien con la pipeta de arriba abajo con una micropipeta. NOTA: 10x tampón de carga contiene 20% de Ficoll 400, 0,1 M Na 2 EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% de azul de bromofenol. 0,25% xilenocianol También se puede añadir a la solución tampón de carga, ya que se ejecuta ~ 50% tan rápido como azul de bromofenol y puede ser útil para el seguimiento de tiradas muy largas. 42 </li><li> Cargar el gel con cada muestra pipeteando cuidadosamente la solución en la parte inferior de cada pocillo. Tenga cuidado de no dejar burbujas de aire o mezclar muestras entre pocillos. NOTA: Una escalera de ARN también se puede utilizar para determinar el tamaño de la transcripción. </li><li> Conecte los cables de modo que el ADN se migrar en el gel hacia el cable positivo. Ajustar la tensión hasta el nivel deseado, típicamente de 1 a 10 V / cm de gel. Ejecutar el gel durante todo el tiempo es suficiente para la separación significativa entre los fragmentos de ARN, utilizando la migración de tintes para monitorear el progreso de la separación. NOTA: A 23 cm x 25 cm de gel a 250 V tomará aproximadamente 1 hora, mientras que un niño de 8 cm x 8 cm de gel a 150 V tomará aproximadamente 20 minutos. Fragmentos de ARN más pequeñas tienen mejor resolución cuando se ejecuta a voltajes más altos. </li><li> Apague la fuente de alimentación cuando el colorante del tampón de carga se ha desplazado una distancia juzgado suficiente para la separación entre los fragmentos de ARN. </li><li> Image el ARN bajo luz UV como el bromuro de etidio será fluorescente. </li><li> Tome una fotografía de la imagen y comparar la intensidad de fluorescencia del ARN purificado de cada condición. </li></ol> 4. Cuantificación de ARN a través de la radiación UV-Vis Spectroscopy <ol><li> Coloque 2 l H 2 O en un NanoDrop 2000 o máquina similar, y medir el blanco. </li><li> A continuación, colocar 2 l de cada muestra de ARN, después de la purificación, en el espectrofotómetro y medir UV-Vis a partir de una gama de longitud de onda de 200 nm a 800 nm. NOTA: Una A 260 lectura de 1.0 es equivalente a cerca de 40 g / ml de ARN,y ARN puro tiene una A 260 / A 280 relación de 2,1. 45 </li><li> En el caso de que la absorbancia está por encima de 1 OD, diluir las muestras en agua libre de nucleasa para obtener una DO inferior a 1. </li><li> Utilice software de gráficos para representar las diversas muestras y comparar DO a 260 nm. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este ensayo demuestra que la adición de Ga (tpfc) inhibe la transcripción del ARN comparable al de los complejos de unión al ADN contra el cáncer conocidos actinomicina D y de triptólido. El comportamiento citotóxico de Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1 a 154,7 M) puede debido a sus propiedades inhibidoras. Puesto que ninguna inhibición de la transcripción se observó en tpfc, la citotoxicidad de tpfc no es debido a la inhibición de la transcripción de ARN sino que es causada por otros medios aún no estudiad...

La quimioterapia implica a menudo agentes citotóxicos de amplio espectro con efectos secundarios no deseados y la orientación limitada, sin embargo, con una mayor comprensión de la biología del cáncer, existe una demanda cada vez mayor de agentes contra el cáncer con una mayor eficacia cáncer de metas y menos efectos secundarios. 1 las células cancerosas humanas se convierten en frecuencia depende de un solo oncogen activado o sobreexpresa para la supervivencia 2 Por lo tanto., muchos fármacos anticancerígenos son evaluados por su capacidad para inhibir la transcripción del ARN. Los tratamientos que bloquean la expresión de estos genes transformantes son eficaces en la eliminación de las células cancerosas y conducen a la muerte celular. 3 Las células transformadas son más sensibles a las alteraciones en la transcripción de ARN que son células normales correspondientes. 4 Los fármacos anticancerosos que inhiben la transcripción se espera que inhiben selectivamente la expresión de los oncogenes que son necesarias para la célula cancerosa para sobrevivir. 5 En consecuencia, i transcripción del ARNnhibition es una forma útil de identificar posibles candidatos a fármacos contra el cáncer y aprender más acerca de su mecanismo de acción. Este protocolo demuestra que Ga (tpfc) inhibe la transcripción del ARN en el mismo orden que los medicamentos de quimioterapia actinomicina D y triptolida; comparaciones similares se pueden hacer usando este protocolo con otros candidatos a fármacos contra el cáncer. Actinomicina D es un inhibidor de la transcripción de ARN comúnmente utilizado para tratar el cáncer gestacional trofoblástico, cáncer testicular, tumor de Wilms, rhabdomyosacoma y del sarcoma de Ewing 6. Actinomicina D ha sido utilizado en la terapia del cáncer durante casi cincuenta años desde que se aprobó por primera vez por la FDA en 1964.Triptolide es un inhibidor de la transcripción selectiva que ha sido investigado in vitro y en varios modelos animales portadores de tumores de 30 años. 7 La naturaleza macrocíclico anfifílico de corroles imparte ventajas significativas sobre otras clases de fármacos, tales como pequeñas moléculas o biológicos. 8-14 El carácter macrocíclico permite la permeabilidad celular que es mayor de lo esperado para tales moléculas grandes, y son lo suficientemente grandes como para interactuar con superficies macromoleculares, tales como las de las proteínas. 8 Corroles se conocen para formar complejos no covalentes apretados con biomoléculas y drogas. 10 Además de la citotoxicidad inherente del marco corrole, hemos demostrado que un sulfonados actos corrole como una molécula portadora para los agentes quimioterapéuticos, específicamente la antraciclina doxorrubicina, un medicamento ADN intercalante. Cuando el corrole sulfonado se administró junto con doxorubicina, se observó una mejora de 3 veces en la IC 50 de doxorubicina para DU-145 células. 9 El marco corrole es estable y tiene absorbancia y fluorescencia propiedades inherentes que, cuando funcionalizado, se someten a cambios de absorbancia únicas que puede ser utilizado para la caracterización. 10 Funcionalización del andamio no lo hace inherentemente affect las propiedades fotofísicas de la corrole, 9-15, pero, como se ha visto con un corrole sulfonado, modificando selectivamente el marco de la corrole puede cambiar sustancialmente sus propiedades biológicas. 16 Anteriormente evaluaron seis metallocorroles contra siete líneas celulares de cáncer humano. Los resultados indican que la toxicidad hacia las células de cáncer humano es dependiente de la ion metálico específico, así como la sustitución de grupo funcional. Por ejemplo, corroles galio sulfonados experimentaron alta captación celular y penetraron de forma selectiva en el núcleo de las células cerebrales del cáncer de próstata metastásico (DU-145); células de la misma corrole, aunque no penetra en el núcleo de otras líneas celulares, presenta una mayor citotoxicidad de mama (MDA-MB-231), melanoma (SK-MEL-28), y de ovario (OVCAR-3) de cáncer que para cáncer de próstata. 9 Ensayos basados ​​en células iniciales indican que estos compuestos son prometedores como agentes terapéuticos contra el cáncer, que merece furthinvestigación er en el mecanismo de acción. La inhibición de la transcripción se observa con ciertos complejos organometálicos 17-27 y nos trató de examinar este proceso como un posible mecanismo para el comportamiento citotóxico de la familia corrole. Este ensayo de transcripción proporciona un método sencillo, barato y fácil de evaluar la inhibición de la transcripción, lo que conducirá a una información más detallada acerca de los efectos de estas moléculas en las células vivas. Aquí, la inhibición de la transcripción de galio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) y su análogo de base libre 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figura 1) son probados. A diferencia de algunos complejos de metales de transición, galio (III) es redox inactiva y por lo tanto no está involucrado directamente en el proceso redox de las rutas metabólicas redox basada. 28 Independientemente, galio (III) no exhibir propiedades citotóxicas y ha sido investigado con fines terapéuticos. El galio es el segundo metal más prometedor para la terapia contra el cáncer después de platino y ha sido objeto de muchos estudios e investigaciones; sales de nitrato y cloruro de galio se han evaluado en ensayos clínicos contra hepatoma, linfoma, cánceres de la vejiga, y otras enfermedades. 29-34 de galio (III) es por lo tanto ideal para el cáncer estudios corrole. Los datos iniciales muestran Ga (tpfc) y tpfc tener baja GI 50, la concentración necesaria de medicamentos para inhibir el 50% de la proliferación celular máxima, con varias líneas celulares de cáncer (véase la Figura 2); Esto confirma la validez de experimentos adicionales sobre estos dos compuestos para determinar sus propiedades inhibidoras. Comparamos estos compuestos con los medicamentos contra el cáncer común actinomicina D y triptólido. Actinomicina D se intercala ADN, ARN inhibe la elongación, e induce la apoptosis en cierta línea celular a concentraciones picomolares 6,35-37 triptolida se ha demostrado que inhibe el crecimiento del tumor.; se une a XPB / ERCC3 humano, una o subunidadfactor de transcripción f TFIIH, conduce a la inhibición de la actividad de la ARN polimerasa II. 6-7,38-40 Mientras que se sabe comúnmente que corroles exhiben propiedades citotóxicas, existe poca información sobre los diferentes mecanismos derivados de funcionalización. Inhibición Corrole de la transcripción del ARN ofrecería un mayor conocimiento sobre sus interacciones con biomacromoléculas. Otros complejos sabe que se unen al ADN, tales como dirrodio (II, II), complejos de cromo (III), rutenio (II) complejos polypyridyl, rodio (III), y varios otros, se sometieron a ensayos de transcripción de ARN, 18- 27 resulta en una mayor comprensión de sus interacciones con biomacromoléculas. Este experimento fácil y ampliamente disponible es también una buena prueba inicial para evaluar las propiedades de citotoxicidad de una molécula dada y determinar si merece más pruebas biológicas. El ensayo de transcripción de ARN también permite muchas modificaciones, tales como varying la cantidad de compuesto o las enzimas utilizadas; variando el período de incubación, tiempo de reacción y los puntos de tiempo de la muestra; y variando la longitud de la plantilla de ADN y la secuencia de, entre otras variables de interés, por tanto, potencialmente proporcionando una gran cantidad de datos. Este ensayo de transcripción es también fácilmente disponibles como kits asequibles con todos los componentes de reacción necesarios previstos, aunque los componentes pueden ser comprados y preparados individualmente. En estos experimentos, se utiliza un kit disponible comercialmente conocido por tener un alto rendimiento. 41 Para evaluar la inhibición de la transcripción, se utilizan dos métodos: la electroforesis en gel de agarosa y espectroscopia UV-Vis. Electroforesis en gel de agarosa es un método sencillo y eficaz para la separación, identificación y purificación de 0,5 a fragmentos de ADN y ARN-25 kb. 42 espectroscopía UV-Vis se puede utilizar para determinar la concentración y pureza del ARN. 43

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:219px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1410</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triptolide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3652</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">nuclease-free H2O&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td>CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tris Acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mini Quick Spin RNA Columns</td>
			<td style="width:219px;">Roche Life Science</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11814427001</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , do not freeze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:219px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3232S</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

La quimioterapia implica a menudo agentes citotóxicos de amplio espectro con muchos efectos secundarios y focalización limitada. Corroles son una clase de macrociclos tetrapirrólicos que exhiben propiedades citostáticos y citotóxicos diferenciales en líneas celulares específicas, dependiendo de las identidades del metal quelado y grupos funcionales. El comportamiento único de corroles funcionalizados hacia líneas celulares específicas introduce la posibilidad de quimioterapia dirigida. Muchos medicamentos contra el cáncer son evaluados por su capacidad para inhibir la transcripción del ARN. Aquí se presenta un protocolo paso a paso para la transcripción del ARN en presencia de los inhibidores conocidos y potenciales. La evaluación de los productos de ARN de la reacción de transcripción por electroforesis en gel y espectroscopía de UV-Vis proporciona información sobre las propiedades inhibidoras de los posibles candidatos a fármacos contra el cáncer y, con modificaciones en el ensayo, más sobre su mecanismo de acción. Pocose sabe sobre el mecanismo molecular de acción de la citotoxicidad corrole. En este experimento, se consideran dos compuestos corrole: galio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) y analógica freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Un ensayo de la transcripción del RNA se utilizó para examinar las propiedades inhibidoras de los corroles. Se prepararon cinco reacciones de transcripción: ADN tratado con actinomicina D, triptolida, Ga (tpfc), tpfc en una [complejo]: [base de ADN de la plantilla] relación de 0,01, respectivamente, y un control no tratado. Se analizaron las reacciones de transcripción después de 4 horas utilizando electroforesis en gel de agarosa y espectroscopia UV-Vis. Hay clara inhibición por Ga (tpfc), actinomicina D, y triptolide. Este ensayo de transcripción de ARN se puede modificar para proporcionar más detalles mecanicista variando las concentraciones del complejo contra el cáncer, el ADN, o enzima polimerasa, o incubando el ADN o polimerasa con el complexes antes de la transcripción de ARN; estas modificaciones podrían diferenciar entre un mecanismo de inhibición que implica el ADN o la enzima. Añadir el complejo después de la transcripción del RNA puede ser usado para probar si los complejos se degradan o hidrolizar el ARN. Este ensayo también se puede utilizar para estudiar los candidatos anticancerígenos adicionales.

RNA Transcripción Cualitativamente Evaluado por electroforesis en gel de agarosa Electroforesis en gel de agarosa se utiliza para la imagen de la ARN transcrito. El bromuro de etidio fluoresce en la unión (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46 lo que permite imágenes de ARN. Bandas oscuras en el gel corresponden a mayores concentraciones de ARN. Si actinomicina D, triptolida, o ya sea complejo corrole inhibe la transcripción del ARN,...

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An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Galio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole y su análogo freebase presentan baja citotoxicidad celular micromolar. Este manuscrito describe una reacción de transcripción de ARN, ARN de formación de imágenes con un gel teñido con bromuro de etidio, y la cuantificación de ARN con espectroscopía UV-Vis, con el fin de evaluar la inhibición de la transcripción por corroles y demuestra un método directo de la evaluación de propiedades contra el cáncer candidatos.

Una<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimática Ensayo para medir la transcripción Inhibición por galio (III) y H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

an-vitro-enzymatic-assay-to-measure-transcription-inhibition

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

11.5K vistas.  California Institute of Technology.  Galio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole y su análogo freebase presentan baja citotoxicidad celular micromolar. Este manuscrito describe una reacción de transcripción de ARN, ARN de formación de imágenes con un gel teñido con bromuro de etidio, y la cuantificación de ARN con espectroscopía UV-Vis, con el fin de evaluar la inhibición de la transcripción por corroles y demuestra un método directo de la evaluación de propiedades contra el cáncer can...

Video: An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Investigación

Bioingeniería

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

Desarrollo de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Plataforma ocular para probar las lentes de contacto

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Órgano Cultura Modelo Murino del disco intervertebral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Una novedosa técnica quirúrgica como base para In Vivo parcial ingeniería hígado de rata

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Un método automatizado para realizar el ensayo de micronúcleos In Vitro mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

Ensayo estandarizado y escalable para estudiar la brotación angiogénica 3D perfundida de células endoteliales derivadas de iPSC in Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...