Acceder a las interacciones de los objetivos de microARN neuronal con las funciones de MicroRNA es fundamental para entender cómo los MicroRN reguladas regulan diversos procesos biológicos tanto en estados sanos como enfermos. Este protocolo describe la reproducción a través de la estrategia para identificar los objetivos de microARN y los microARN funcionales, ya que la validación del objetivo directo de los microARN es un desafío. Nuestro protocolo puede proporcionar información sobre la función de los microRNAs individuales y la implicación de un microARN en la terapia oncológica.
El cálculo de la concentración inhibitoria media máxima es un método importante, no sólo para los estudios de microARN, sino para la evaluación eficaz de otros fármacos contra el cáncer. Nuestro protocolo será útil para los nuevos investigadores ya que describimos el método fundamental para entender el nivel de microRNAs en una célula. Para comenzar el protocolo, cuente las celdas con el contador de celdas.
Placar las células en una placa de 96 pozos. Al día siguiente, preparar un conjunto de mezclas de transfección para transfecar las células en varias concentraciones finales de imitación de control de microARN, y microRNA-107 imitar. A partir de un stock de 25 micromolares microRNA control mímico, o microRNA-107 imitar, diluir y añadir control imitar o microRNA-107 imitar en los medios séricos reducidos junto con el reactivo de transfección en tubos de microcentrífuga.
Mezcle suavemente las mezclas que contienen oligoconsúceos con una micropipeta. Después de una incubación de 10 minutos en la capucha de cultivo celular, mezcle suavemente las mezclas que contienen oligoconteniendo de nuevo, y luego agregue 50 microlitros de las mezclas en cada pocóyo. Mantener las células trans infectadas en una incubadora de cultivo celular.
Aspirar cuidadosamente el medio de cultivo celular en cada pozo de la placa y llenar rápidamente 100 microlitros de 10%ácido tricloroacético, o TCA, en cada pozo. Mantenga la placa que contiene 10%TCA a cuatro grados Celsius durante una hora. A continuación, lave la placa varias veces sumergiéndola en una bañera con agua del grifo.
Retire el exceso de agua del interior de los pozos tocando la placa hasta que no quede agua y seque la placa. Pipetear 50 microlitros de solución de 0,4% SRB en cada pozo, incluidos los pozos en blanco. Agitar suavemente la placa hasta que la solución 0.4%SRB cubra uniformemente la parte inferior de los pozos.
Luego, incubar el plato durante 40 a 60 minutos. Después de la incubación, lave el plato con 1%ácido acético hasta que el tinte sin ataduras se lave totalmente. Pipetear 100 microlitros de 10 mililitros de solución base Tris en los pozos correspondientes, incluyendo pozos en blanco.
Mantenga el plato en una coctelera durante 10 minutos. Mida la absorbancia a 492 nanómetros. Calcular el porcentaje de absorbancia media y la desviación estándar de cada grupo utilizando los valores de absorbancia del ensayo SRB.
Importe los datos sin procesar, incluidas las concentraciones de tratamiento, la absorbancia media y la desviación estándar en el software alineando verticalmente los datos. Haga clic en la pestaña Crear gráfico y elija las barras de error de dispersión simple. Seleccione columnas de hoja de cálculo como Valores de símbolo y haga clic en Siguiente.
En el panel Formato de datos, seleccione Pares X-Y y haga clic en Siguiente. Seleccione las columnas de datos correspondientes en el panel Seleccionar datos. Haga clic en Finalizar para crear el trazado.
Haga doble clic en el eje X para modificar el tipo de escala en la escala del eje. Cambie el tipo de escala de lineal a log. Modifique el número de rango inicial y final a 0.01 y 200, respectivamente.
Haga clic con el botón derecho en cualquier gráfico de dispersión, elija Ajuste de curva y vaya a la subcategoría Definido por el usuario. Seleccione la curva de respuesta a la dosis. Haga clic en los botones siguientes y, a continuación, haga clic en Finalizar.
Vaya a la pestaña Informe y, a continuación, compruebe los valores n, k y R. Ejecute el PCR como se detalla en el protocolo de texto adjunto. A continuación, pasar a la doble digestión mediante la combinación de las mezclas de reacción, incluyendo las enzimas de restricción Exo1 y Not1 uno en un tubo.
Incubar las mezclas durante tres a cuatro horas en un baño de agua Celsius de 37 grados. Ejecuta los productos de doble digestión con un gel de 1% de agarosa. A continuación, corte las bandas bajo la luz UV.
Purificar los productos de PCR de doble digestión y los vectores de luciferasa de las bandas extirpadas. Continuar con la ligadura de los productos PCR en los vectores de luciferasa mediante la preparación de 20 microlitros de mezclas de reacción de ligadura incluyendo la ligasa de ADN. Centrifuga brevemente el tubo durante 10 a 15 segundos.
Incubar la ligadura a 16 grados centígrados durante la noche usando un ciclor térmico. Al día siguiente, realice la transformación añadiendo las mezclas de ligadura en el tubo que contiene células competentes. Toque suavemente el tubo y manténgalo sobre hielo durante 20 minutos.
Transfiera rápida y suavemente el tubo a un bloque de calor a 42 grados Celsius durante 30 segundos a un minuto. Después de un choque de calor, coloque el tubo sobre hielo durante 20 minutos. Extienda las células competentes en una placa de agar LB.
Cultivar células competentes en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, escoge una colonia individual y resuspend E.coli en uno de los tubos de 8 tiras que contienen agua ultrapura, y repite este paso para resuspender E.coli de cuatro a ocho colonias seleccionadas al azar. Transfiera 25 microlitros de suspensión E.coli a otro conjunto de tubos de 8 tiras.
Realice la pcR de la colonia utilizando la suspensión E.coli. Prepare el ensayo de luciferasa en un plato de 24 pozos. Agregue de una a dos veces diez a las cuatro células en un medio de cultivo celular de 500 microlitrotros para cada pozo.
Después de la incubación durante la noche, transfect 50 nanogramos de vectores de luciferasa en las células con imitación de control o un microARN específico imitando usando un reactivo de transfección. Al día siguiente, lave el interior de los pozos dos veces usando solución salina tamponada con fosfato. Aplicar 200 microlitros de reactivo de lelisis en los pozos y realizar suficientemente la lelisis celular antes de medir la actividad de la luciferasa.
Mantenga la placa agitada durante al menos 15 minutos. Transfiera de cinco a 10 microlitros de celtuado en el nuevo tubo, y agregue 100 microlitros de reactivo uno y mezcle inmediatamente la solución por pipeteo. Luego lee la actividad de la luciferasa de la luciérnquea usando el iluminamínómetro durante 10 a 15 segundos.
Añadir 100 microlitros de reactivo dos en el mismo tubo y luego mezclar por pipeteo dos veces. Por último, lea la actividad de renilla luciferasa durante 10 a 15 segundos utilizando el iluminamínómetro. RTPCR muestra una reducción significativa de las células microRNA-107 y PANC-1 y CAPAN-1 en comparación con las células HPNE.
Los niveles de microRNA-301 fueron significativamente regulados en células PANC-1 y CAPAN-1, en comparación con las células HPNE. El ensayo SRB en este estudio demuestra claramente que la proliferación de células PANC-1 disminuyó después de una transfección imitada de microRNA-107. El cribado de 11 posibles dianas predichas de microRNA-107 muestra claramente que sólo la sinucleína gamma, o SNCG, un regulador positivo del crecimiento de células tumorales interactúa directamente con las células microRNA-107 y PANC-1, lo que indica que el microRNA-107 puede regular negativamente la proliferación de células PANC-1 modulando la expresión SNCG.
Los ensayos de proliferación celular para adultos que utilizan la entidad basada en tetrahidleono y CFSE son aplicables para analizar el efecto de tales, como imitaciones de microARN, dependiendo de los tipos de células. Sobre la base de la función validada experimentalmente de los microRNAs, se requiere una revisión sistemática de la base de datos y el programa de predicción de objetivos para reducir la lista de objetivos candidatos antes de los ensayos de luciferasa. Para la evaluación de la eficiencia combinada de microARN con fármacos contra el cáncer, es ventajoso calcular los valores de IC ajustados basados en nuestro protocolo para la evaluación del índice de combinación.
