The authors would like to thank John Kristensen and S&#248;ren Braad Andersen from the Department of Communication, Aarhus University Hospital, Denmark, for their exceptional help with filming and editing. Animal technician Diana Gyldenl&#248;ve and veterinarian Birgitte Kousgaard, Institute of Clinical Medicine Aarhus University Hospital, Denmark for assisting with animal care. This study was supported by the Lundbeck Foundation, the Laerdal Foundation for Acute Medicine, Central Denmark Region&#8217;s Research Foundation, Augustinus Foundation, Aase and Ejnar Danielsens Foundation, the Institute of Clinical Medicine Aarhus University Hospital, Br&#248;drene Hartmanns Foundation, Karen Elise Jensens Foundation, Fonden til L&#230;gevidenskabens Fremme, and Marie Dorthea og Holger From, Haderslevs Fond.

El presente protocolo fue aprobado por el danés Experimentos con Animales Inspección. Todos los animales de prueba fueron anestesiados lo largo de los procedimientos. La reproducción de este protocolo debe llevarse a cabo de acuerdo con la ética nacionales y directrices de bienestar animal, y aprobado por los comités de ética locales. 1. Los animales <ol><li> Lechones Landrace danés &lt;24 horas de edad con un peso aproximado de 1.500 - 2.000 g. </li></ol> 2. Anestesia y mantenimiento Fluidos <ol><li> Preparar el equipo necesario para la anestesia (Figura 1): Una máscara para la administración de sevoflurano, algodones con alcohol, catéter intravenoso periférico, goma elástica, jeringas con solución salina, propofol (5 mg / kg), fentanil (10 mg / kg), y bencilpenicilina procaína (15.000 IU / kg). </li><li> Inducir la anestesia mediante la entrega de un 1-2% de sevoflurano a través de una máscara de respiración. <ol><li> Evaluar la profundidad de la anestesia mediante la evaluación de palpebral y la retirada reflexes. Cuando la certeza de que el lechón está profundamente anestesiado, percutánea insertar un catéter intravenoso periférico en la vena de la oreja. </li><li> Para confirmar la permeabilidad del catéter intravenoso periférico, lavar el catéter con 1-2 ml de estéril al 0,9% de solución salina. Administrar inyecciones en bolo de propofol (5 mg / kg) y fentanilo (10 g / kg). Con posterioridad a la administración de la inyección en bolo enjuagar el catéter intravenoso por segunda vez usando 1-2 ml de estéril al 0,9% de solución salina. </li><li> Coloque jeringas con propofol (10 mg / ml) y fentanilo (10 g / ml) en dos bombas de infusión de jeringa separadas. Conectar los tubos de IV de las dos bombas de jeringa a una llave de paso de tres vías unirse infusiones en una sola línea que está conectado al catéter intravenoso. Iniciar la infusión IV continua de propofol (4-12 mg / kg / hr) y fentanilo (10 g / kg / hr). Una vez infusiones continuas se están ejecutando, no le dé más inyecciones en bolo de propofol y fentanilo. </li><li> Suspenda la administración de la anest gas sevofluranohesia. </li><li> Inyectar bencilpenicilina procaína (15.000 UI / kg) por vía subcutánea o intramuscular según las directrices locales para la profilaxis antibiótica. Repita todos los días. El vídeo muestra la administración sc, que en los lechones se ha demostrado que el resultado en una mayor concentración en plasma y la vida media más larga en comparación con la administración IM. </li><li> Aplique un ungüento lubricante ocular para prevenir la sequedad de los ojos. Tire del párpado inferior hacia abajo suavemente para formar una abertura de bolsa. Coloque una pequeña cantidad de pomada en el interior del bolsillo. Cerrar los ojos a distribuir pomada. Compruebe si hay sequedad por hora y volver a aplicar cuando sea necesario. </li><li> Iniciar una infusión a velocidad continua de dextrosa al 5% / 0,45% de NaCl iv a 10 ml / kg / hr. Reducir la tasa de 5 ml / kg / h durante y después de la hipoxia. Ajuste la velocidad de infusión para mantener los niveles de glucosa en sangre entre 2-10 mmol / L. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig1.jpg" /> Figure 1. Equipo para la anestesia y la intubación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 3. La intubación y ventilación <ol><li> Preparar el equipo necesario para la intubación (Figura 1): bromuro de rocuronio (1 mg / kg) para la relajación muscular, una eslinga (atar ambos extremos de la misma cuerda de nylon 4 mm entre sí para formar un círculo como se representa en la figura 1) para abrir la boca, una punta de algodón hisopo y laringoscopio veterinaria con hoja recta, aerosol xilocaína (100 mg / ml), varios tubos endotraqueales con manguito de tamaño (tamaños de 3,0 mm, 2,5 mm, 2,0 mm), 500 ml bolsa autoinflable (válvula de la bolsa enmascarar) para la ventilación, 2 ml jeringa para inflado del manguito y estetoscopio. </li><li> Intubate siguiendo los pasos a continuación: <ol><li> Lugar de lechones en la posición supina apoyar el cuello de cada lado para asegurar una recta pas laríngeossabio para la intubación. </li><li> Estimar la longitud del tubo endotraqueal midiendo desde la punta del hocico hasta la horquilla esternal (por lo general alrededor de 13 cm). </li><li> Lugar eslinga alrededor de la mandíbula superior (boca abajo) y mantenga la mandíbula inferior y la lengua hacia arriba para mantener la boca abierta. </li><li> Administrar bromuro de rocuronio (1 mg / kg) iv para inducir la relajación muscular. </li><li> Utilice laringoscopio para levantar la lengua hacia arriba. </li><li> Utilice el hisopo de algodón con punta para liberar epiglotis largo del lechón, que puede estar en retroversión, ya sea en el esófago o atrapado detrás del paladar blando. </li><li> Avanzar laringoscopio para mantener la epiglotis levantado en contra de la base de la lengua que permite la vista de los cartílagos aritenoides y las cuerdas vocales. </li><li> Aplicar por pulverización xilocaína (100 mg / ml) por vía tópica en la laringe para evitar los espasmos laríngeos. </li><li> Avanzar tubo endotraqueal a través de las cuerdas vocales. Use un movimiento de rotación para facilitar el paso de los estrechos cartílagos traqueales. Alojamiento tubo Avancerding a la distancia previamente medida y conectarse a una bolsa autoinflable (bolsa máscara válvula) para la ventilación manual. Para ayudar a reducir la fricción durante la intubación rociar el tercio distal del tubo endotraqueal con spray xilocaína. </li><li> Para confirmar la colocación del tubo endotraqueal correcta: observar para cualquier indicación de dificultad para respirar, ausculate el pecho para escuchar la entrada de aire bilateral en ambos pulmones, confirmar visualmente la presencia de condensación en el aspecto proximal del tubo endotraqueal, y verificar la presencia de final de carbono de las mareas dióxido de con un detector de dióxido de carbono colorimétrica o por espiratorio CO 2 lectura en el ventilador mecánico si está disponible. Final normal de dióxido de carbono de las mareas es de alrededor de 5%. Un valor superior a 2% junto con una forma de onda de apariencia normal confirmará que el tubo endotraqueal es en la tráquea. </li><li> Inflar el manguito del tubo endotraqueal para evitar la aspiración. La presión de inflado del manguito debe ser inferior a 25 cm H 2 O para evitar el daño isquémico<html> al tejido circundante. Sosteniendo el tubo endotraqueal en su lugar, enrollar un trozo de cinta alrededor del tubo, cerrar la mandíbula y continuar grabando alrededor del hocico para asegurar el tubo en su lugar. Tire suavemente del tubo para asegurar que se mantenga en su lugar. </li><li> Conecte el tubo endotraqueal a ventilador mecánico. </li></ol></li><li> Ajustar la configuración de ventilador: ventilación controlada por volumen, volumen corriente (TV): 10 ml / kg [o la presión inspiratoria pico (PIP) de 15 cm con ventilación controlada a presión]. La presión positiva al final de la espiración (PEEP): 5 cm. Relación I: E 1: 2. Frecuencia respiratoria: 35 (ajustar la velocidad para mantener final de la espiración de CO 2 entre 4.5 a 5.5 kPa). </li></ol> 4. Seguimiento y Cuerpo de muestreo de fluidos <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig2.jpg" /> Figura 2. Equipo para monitoreo.ank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <ol><li> Preparar el material necesario para el seguimiento (Figura 2): cinta adhesiva, lubricante estéril, sonda para medir la temperatura rectal continuo, electrocardiograma (ECG) electrodos, electrodos oxímetro de pulso, afeitar, y EEG. <ol><li> Coloque la sonda de saturación en una pata trasera, lubricar la sonda de temperatura rectal e inserte 6 cm en el recto, coloque el calentador radiante sobrecarga y / o un colchón de aire inflable climatizada para mantener la temperatura rectal a nivel fisiológico de 38,5 a 39 ° C, y el lugar de ECG electrodos. </li><li> Coloca los lechones en la posición prona para afeitar áreas de 1 cm x 1 cm para la colocación de electrodos EEG aguja subcutáneos; una delante de cada oreja, y el electrodo de referencia en la línea media, justo detrás de los ojos. Limpie el sitio de electrodo con un algodón con alcohol, luego inserte el electrodo de aguja por vía subcutánea. Electrodos Asegure con cinta adhesiva y el retorno de los lechones a la po supinasición. </li><li> Encienda el monitor aEEG. NOTA: La amplitud integrado EEG consiste de una traza denso, con márgenes superior e inferior. Márgenes inferior y superior en este modelo son típicamente 15 a 50 mV, a menudo más altos que los observados en los lactantes. Durante la hipoxia es importante señalar, que el artefacto de ECG puede elevar falsamente la traza aEEG. Medicamentos (bolo de propofol o fentanilo) también pueden suprimir transitoriamente la traza aEEG y deben evitarse si es posible durante el experimento. La administración de fármacos y eventos clínicos se debe marcar para facilitar la interpretación de la traza aEEG. </li></ol></li><li> Preparar el equipo necesario para la colocación de catéteres umbilicales para el monitoreo de la presión arterial central y tomar muestras de sangre (Figura 3): guantes estériles, drapeado estéril, bisturí, algodones con alcohol, toallitas estériles, catéter de la vena umbilical (5 Fr), catéter en la arteria umbilical (3,5 Fr ), sutura conjunto con pinzas, fórceps curvos micro, tijeras, porta agujas y suturas (por ejemplo, el tamaño 3-0), parche adhesivo transparente, 5 ml jeringas para toma de muestras de sangre. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig3.jpg" /> Figura 3. Equipo para líneas umbilicales y toma de muestras de sangre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="3"><li> Esterilizar y cubre el área alrededor del ombligo. Utilice un bisturí para cortar el cordón umbilical tan cerca de la piel como sea posible. Si esto no expone los vasos umbilicales en el lechón anestesiado, cortar la piel umbilical 2 mm por debajo del cordón umbilical para exponer los vasos. Identificar las dos pequeñas arterias umbilicales y el más grande de la vena umbilical (Figura 4). </li><li> Utilice unas pinzas curvas micro para dilatar la arteria (Figura 4) e insertar el catéter arterial umbilical(3,5 Fr). Estimación longitud de inserción en cm a 3 x peso (kg) + 10 (fórmula empírica basada en la colocación correcta en la aorta descendente por encima de las arterias renales en la autopsia). </li><li> Coloque un segundo catéter de 5 Fr 5 cm en la vena umbilical (Figura 4). Compruebe la colocación del catéter intravascular por el retorno de la sangre. Catéteres seguros mediante la colocación de una sutura en bolsa de tabaco alrededor del ombligo, pasan la sutura termina alrededor de cada uno de los catéteres umbilicales y haga un nudo. Cubra catéteres con apósito adhesivo transparente. </li><li> Recoger muestras de sangre en puntos de tiempo pre-especificado: 1) inmediatamente antes de la hipoxia, 2) 30 min en insulto hipóxico 3) al final de la 45 min hipóxico insulto 4) 2 horas después de insulto hipóxico. Dependiendo del propósito del experimento otros puntos de tiempo para las muestras de sangre se puede elegir. </li><li> Utilice el análisis de gases en sangre arterial a partir de muestras de sangre tomadas durante la hipoxia para verificar los cambios de gases sanguíneos causados ​​por la hipoxia-isquemia (Tabla 1). Tenga en cuenta que los lechones tienen hemoglobina baja unt nacimiento (alrededor de 8 g / dl) y puede llegar a ser anémica de toma de muestras de sangre frecuentes. Retirar menos de 2 ml de sangre / kg de peso corporal por sorteo, a menos de 5 ml de sangre / kg de peso corporal dentro de 24 h y se adhieren a las directrices locales para el muestreo de sangre. Los signos de la anemia incluyen la disminución del hematocrito y taquicardia. </li><li> Conecte línea arterial a un monitor de vigilancia continua de la presión arterial intra-arterial (PAM). Utilice vía venosa para la administración de líquidos y fármacos. </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig4.jpg" /> Figura 4. Los buques umbilicales. Vena umbilical (derecha) y una de las dos arterias umbilicales (izquierda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 5. La hipoxia <ol><li> Espere 60 minutos después de terminar el monitoreo. Inducir la hipoxia por el cambio a un 4% de O 2 </sub&gt; / 96% N2 mezcla de gases. Monitorear los parámetros vitales y aEEG estrechamente y continuar la hipoxia durante 45 minutos. </li><li> Una vez que la traza aEEG es plana (margen superior &lt;7 mV), ajuste la oxigenación mediante la alteración de la fracción de oxígeno inspirado (FiO 2) y la presión media de la vía aérea con el más alto nivel de FiO2 mantener una traza plana aEEG de acuerdo con el diagrama de flujo mostrado en la figura 5. Trate de PAM por debajo del 70% de la línea de base durante al menos 10 minutos y si es necesario FiO 2 inferior para asegurar hipotensión e isquemia. El nivel de hipotensión descrito previamente se ha demostrado por otros 19,13,30 para producir lesión cerebral hipóxico-isquémica relevante. </li><li> En caso de hipotensión grave (PAM &lt;25 mm Hg) a tratar por etapas como sigue: aumentar brevemente FiO 2 por 1-5%, bolo de solución salina (10 ml / kg), la infusión de dopamina (5-20 mg / kg / min), y la infusión de noradrenalina (20 ng-1 g / kg / min). </li><li> En caso de convulsiones que duran&gt; 10 min (clónicas, tónicas or crisis mioclónicas, típicamente focal o como se indica por cambios repentinos en aEEG amplitud) tratan por etapas con (permitiendo 30 min antes de proceder a la siguiente inyección): lenta en bolo iv de fenobarbital 20 mg / kg, iv repetir fenobarbital 20 mg / kg, y midazolam iv 0,5 mg / kg. <ol><li> Si las convulsiones se desarrollan y son insensibles a la eutanasia terapia con medicamentos está indicado. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig5.jpg" /> Figura 5. La hipoxia-isquemia diagrama de flujo. Diagrama de flujo que muestra los ajustes en la oxigenación (F i O 2 y P aw) de acuerdo a la respuesta aEEG. La presión de la vía aérea (P aw) La media se ajusta cambiando PIP / TV (menor PIP da menor aw P) y la frecuencia respiratoria (RR menor da menor aw P). Objetivo aEEG = margen superior de la traza &lt;5 mV y menor margen de traza&gt; 3 mV (promedio 4 mV). Objetivofrecuencia cardíaca (FC) =&gt; 80. Objetivo presión arterial media (PAM) = PAM&gt; 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Supervivencia 6. 72 horas <ol><li> Monitorear el lechón de cerca después del insulto hipóxico, y reducir gradualmente las tasas de infusión de propofol y fentanilo. Retirar la intubación en el punto en el que el animal está respirando voluntariamente. </li><li> Durante el período de supervivencia, mantener lechones en un centro de animales con el reloj de 24 horas por personal especializado en cuidados intensivos y el seguimiento. Administrar las infusiones de glucosa iv 20 ml / kg por hora 2-3. En 26 a 48 horas después de la hipoxia-isquemia parcial con biberón de alimentación puede ser iniciada. La aspiración a la tráquea y los pulmones puede ocurrir por la alimentación con biberón si el reflejo nauseoso no está presente. </li><li> Si es relevante para el experimento, evaluar el estado neurológico usando el sistema de puntuación desarrollado por Thoresen et al., Se describe endetalle en la publicación original 17. </li></ol> Evaluación 7. Resultado <ol><li> Después de 72 horas, anestesiar y ventilar de nuevo como se describe en la sección 2 y 3. Realice Imagen de resonancia magnética con técnicas de imagen pertinentes descritos por Munkeby et al 31 y 2 otros. </li><li> Al final del experimento la eutanasia a los lechones con una dosis letal de pentobarbital (5 g / kg iv). </li><li> Preparar el cerebro para su examen de acuerdo con el objetivo del experimento. <ol><li> Para la histología cerebral en tejido fijado con formalina:.. Utilizar la perfusión cardiaca con 4% de paraformaldehído en PBS, seguido por disección y post-fijación en paraformaldehído como se describe por Robertson et al 2, Chakkarapani et al 1 o Liu et al 18 o quitar el cerebro y sumergirse en 4% de paraformaldehído como se describe por Andresen et al. 32 </li><li> Para el análisis que requiere el tejido-snap congelado (por ejemplo, ARNensayos de actividad de análisis o de la enzima 33):. Retire el cerebro, diseccionar las regiones cerebrales de interés y complemento de congelación bloques de tejido de un máximo de 1 cm x 1 cm de nitrógeno líquido como se describe por Munkeby et al 33 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Chakkarapani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenon+enhances+hypothermic+neuroprotection+in+asphyxiated+newborn+pigs.">Xenon enhances hypothermic neuroprotection in asphyxiated newborn pigs.</a> Annals of. 68, 330-341 (2010).</li><li>Robertson, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+augments+hypothermic+neuroprotection+in+a+perinatal+asphyxia+model.">Melatonin augments hypothermic neuroprotection in a perinatal asphyxia model.</a> Brain : a journal of neurology. 136, 90-105 (2013).</li><li>Lawn, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Every+Newborn:+progress,+priorities,+and+potential+beyond+survival.">Every Newborn: progress, priorities, and potential beyond survival.</a> Lancet. 384, 189-205 (2014).</li><li>Lee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrapartum-related+neonatal+encephalopathy+incidence+and+impairment+at+regional+and+global+levels+for+2010+with+trends+from+1990.">Intrapartum-related neonatal encephalopathy incidence and impairment at regional and global levels for 2010 with trends from 1990.</a> Pediatric research. 74, 50-72 (2013).</li><li>Kurinczuk, J. J., White-Koning, M., Badawi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+neonatal+encephalopathy+and+hypoxic-ischaemic+encephalopathy.">Epidemiology of neonatal encephalopathy and hypoxic-ischaemic encephalopathy.</a> Early human development. 86, 329-338 (2010).</li><li>Shankaran, S., Woldt, E., Koepke, T., Bedard, M. P., Nandyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+neonatal+morbidity+and+long-term+central+nervous+system+sequelae+of+perinatal+asphyxia+in+term+infants.">Acute neonatal morbidity and long-term central nervous system sequelae of perinatal asphyxia in term infants.</a> Early human development. 25, 135-148 (1991).</li><li>Robertson, C. M., Finer, N. N., Grace, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=School+performance+of+survivors+of+neonatal+encephalopathy+associated+with+birth+asphyxia+at+term.">School performance of survivors of neonatal encephalopathy associated with birth asphyxia at term.</a> The Journal of pediatrics. 114, 753-760 (1989).</li><li>Bennet, L., Booth, L., Gunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+biomarkers+for+hypoxic-ischemic+encephalopathy.">Potential biomarkers for hypoxic-ischemic encephalopathy.</a> Seminars in feta., &amp; neonatal medicine. 15, 253-260 (2010).</li><li>Yager, J. Y., Ashwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+perinatal+hypoxic-ischemic+brain+damage.">Animal models of perinatal hypoxic-ischemic brain damage.</a> Pediatric neurology. 40, 156-167 (2009).</li><li>Buckley, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+circulatory+system+in+three+mammalian+models+of+human+development.">Maturation of circulatory system in three mammalian models of human development.</a> Comparative biochemistry and physiology. A, Comparative. 83, 1-7 (1986).</li><li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+the+brain+growth+spurt.">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early human development. 3, 79-83 (1979).</li><li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+growth+and+development+of+human+brain.">Quantitative growth and development of human brain.</a> Archives of disease in childhood. 48, 757-767 (1973).</li><li>Foster, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+survival+model+of+hypoxia/ischaemia+in+the+piglet+suitable+for+neuroprotection+studies.">An improved survival model of hypoxia/ischaemia in the piglet suitable for neuroprotection studies.</a> Brain research. 919, 122-131 (2001).</li><li>LeBlanc, M. H., Li, X. Q., Huang, M., Patel, D. M., Smith, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+antagonist+LY293558+does+not+affect+the+severity+of+hypoxic-ischemic+injury+in+newborn+pigs.">AMPA antagonist LY293558 does not affect the severity of hypoxic-ischemic injury in newborn pigs.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 26, 1908-1914 (1995).</li><li>Andresen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+affects+the+expression+of+brain-derived+neurotrophic+factor+mRNA+and+protein+in+the+hippocampus+of+hypoxic+newborn+piglets.">Nicotine affects the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the hippocampus of hypoxic newborn piglets.</a> J Perinat Med. 37, 553-560 (2009).</li><li>Cheung, P. Y., Gill, R. S., Bigam, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+swine+model+of+neonatal+asphyxia.">A swine model of neonatal asphyxia.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Thoresen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+piglet+survival+model+of+posthypoxic+encephalopathy.">A piglet survival model of posthypoxic encephalopathy.</a> Pediatric research. 40, 738-748 (1996).</li><li>Liu, X., Tooley, J., Loberg, E. M., Suleiman, M. S., Thoresen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+hypothermia+reduces+cardiac+troponin+I+after+hypoxic-ischemic+encephalopathy+in+newborn+pigs.">Immediate hypothermia reduces cardiac troponin I after hypoxic-ischemic encephalopathy in newborn pigs.</a> Pediatric research. 70, 352-356 (2011).</li><li>Bjorkman, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic/Ischemic+models+in+newborn+piglet:+comparison+of+constant+FiO2+versus+variable+FiO2+delivery.">Hypoxic/Ischemic models in newborn piglet: comparison of constant FiO2 versus variable FiO2 delivery.</a> Brain research. 1100, 110-117 (2006).</li><li>Robertson, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+neuroprotective+agents+are+ready+for+bench+to+bedside+translation+in+the+newborn+infant.">Which neuroprotective agents are ready for bench to bedside translation in the newborn infant.</a> The Journal of pediatrics. 160, 544-552 (2012).</li><li>Jacobs, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooling+for+newborns+with+hypoxic+ischaemic+encephalopathy.">Cooling for newborns with hypoxic ischaemic encephalopathy.</a> Cochrane Database Syst Rev. 1, CD003311 (2013).</li><li>Andresen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resuscitation+with+21+or+100%+oxygen+in+hypoxic+nicotine-pretreated+newborn+piglets:+possible+neuroprotective+effects+of+nicotine.">Resuscitation with 21 or 100% oxygen in hypoxic nicotine-pretreated newborn piglets: possible neuroprotective effects of nicotine.</a> Neonatology. 93, 36-44 (2008).</li><li>Karlsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+hypothermia+as+selective+head+cooling+or+whole+body+cooling+does+not+protect+brain+or+body+in+newborn+pig+subjected+to+hypoxia-ischemia.">Delayed hypothermia as selective head cooling or whole body cooling does not protect brain or body in newborn pig subjected to hypoxia-ischemia.</a> Pediatric research. 64, 74-78 (2008).</li><li>Kovacs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asphyxia-induced+release+of+alpha-melanocyte-stimulating+hormone+in+newborn+pigs.">Asphyxia-induced release of alpha-melanocyte-stimulating hormone in newborn pigs.</a> Peptides. 22, 1049-1053 (2001).</li><li>Varvarousi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asphyxial+cardiac+arrest,+resuscitation+and+neurological+outcome+in+a+Landrace/Large-White+swine+model.">Asphyxial cardiac arrest, resuscitation and neurological outcome in a Landrace/Large-White swine model.</a> Laboratory animals. 45, 184-190 (2011).</li><li>Tammela, O., Pastuszko, A., Lajevardi, N. S., Delivoria-Papadopoulos, M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+tyrosine+hydroxylase+in+the+striatum+of+newborn+piglets+in+response+to+hypocapnic+hypoxia.">Activity of tyrosine hydroxylase in the striatum of newborn piglets in response to hypocapnic hypoxia.</a> Journal of neurochemistry. 60, 1399-1406 (1993).</li><li>Cote, A., Barter, J., Meehan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+metabolic+effects+of+repeated+hypoxemia+in+piglets.">Age-dependent metabolic effects of repeated hypoxemia in piglets.</a> Canadian journal of physiology and pharmacology. 78, 321-328 (2000).</li><li>Tichauer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+severity+of+perinatal+hypoxia-ischemia+in+piglets+using+near-infrared+spectroscopy+to+measure+the+cerebral+metabolic+rate+of+oxygen.">Assessing the severity of perinatal hypoxia-ischemia in piglets using near-infrared spectroscopy to measure the cerebral metabolic rate of oxygen.</a> Pediatric research. 65, 301-306 (2009).</li><li>Jasani, M. S., Salzman, S. K., Tice, L. L., Ginn, A., Nadkarni, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetic+regimen+effects+on+a+pediatric+porcine+model+of+asphyxial+arrest.">Anesthetic regimen effects on a pediatric porcine model of asphyxial arrest.</a> Resuscitation. 35, 69-75 (1997).</li><li>Chakkarapani, E., Thoresen, M., Liu, X., Walloe, L., Dingley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenon+offers+stable+haemodynamics+independent+of+induced+hypothermia+after+hypoxia-ischaemia+in+newborn+pigs.">Xenon offers stable haemodynamics independent of induced hypothermia after hypoxia-ischaemia in newborn pigs.</a> Intensive care medicine. 38, 316-323 (2012).</li><li>Munkeby, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+piglet+model+for+detection+of+hypoxic-ischemic+brain+injury+with+magnetic+resonance+imaging.">A piglet model for detection of hypoxic-ischemic brain injury with magnetic resonance imaging.</a> Acta radiologica. 49, 1049-1057 (2008).</li><li>Andresen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+piglets+exposed+to+hypoxia+after+nicotine+or+saline+pretreatment:+long-term+effects+on+brain+and+heart.">Newborn piglets exposed to hypoxia after nicotine or saline pretreatment: long-term effects on brain and heart.</a> J Matern Fetal Neonatal Med. 22, 161-168 (2009).</li><li>Munkeby, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resuscitation+with+100%+O2+increases+cerebral+injury+in+hypoxemic+piglets.">Resuscitation with 100% O2 increases cerebral injury in hypoxemic piglets.</a> Pediatric research. 56, 783-790 (2004).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Debido a su complejidad, el modelo descrito sólo puede implementarse en instalaciones acreditadas y con experiencia en la investigación con animales. La aprobación por los comités de ética locales debe obtenerse antes de la iniciación de los experimentos, y el bienestar óptimo de los animales debe garantizarse en todo momento. A medida que el modelo se basa en la supervivencia de los animales de ensayo, es importante que un ambiente estéril se mantiene durante procedimientos invasivos para prevenir las infeccion...

La asfixia perinatal es una condición aguda y con frecuencia impredecible asociado con encefalopatía hipóxico-isquémica (EHI). El objetivo general de este protocolo es demostrar un modelo de supervivencia de los lechones de perinatal encefalopatía hipóxico-isquémica. Este modelo se puede utilizar para investigar el efecto de varios grados de hipoxia-isquemia en el cerebro neonatal y de los tratamientos experimentales sobre la neuropatología, la resonancia magnética y la espectroscopia (MRI y MRS) y biomarcadores en fluidos corporales tales como sangre, líquido cefalorraquídeo y orina . El modelo también ha demostrado ser útil para investigar el sistema cardiovascular, sistema respiratorio, renal y hepática, todos los cuales se ven afectados en la hipoxia-isquemia global. La asfixia perinatal es el resultado de peligro el suministro de oxígeno durante el parto o en el puerperio inmediato. Eventos de hipoxia intraparto representan 0.660.000 muertes en el mundo cada año, alrededor de una cuarta parte del mundo 2.9 millSe estima que han desarrollado encefalopatía neonatal después de la asfixia al nacer 4 iones muertes neonatales en 2012 3. En 2010 1,15 millones de bebés. HIE definido como encefalopatía en niños nacidos después de 34 semanas de gestación se produce en 1-3 / 1.000 nacidos vivos 5 en el mundo industrializado y de hasta 8,5 / 1000 nacidos vivos en los países en desarrollo 4. El riesgo de muerte es 10 a 60%, y el riesgo de discapacidad neurológica en los sobrevivientes de 30-100% 6,7. 50,2 millones de años de vida ajustados por discapacidad (AVAD) se atribuyen a los eventos de hipoxia intraparto 4. Actualmente el único tratamiento que no sea de apoyo para HIE es la hipotermia post-hipóxica. Por lo tanto, los avances en los procedimientos de diagnóstico y estrategias de tratamiento son esenciales para mejorar la gestión de HIE 8. Las mejoras en el pronóstico después de la asfixia y la gestión de la lesión cerebral neonatal perinatal se basan en ampliar el conocimiento de los mecanismos subyacentes de la enfermedad de und posibles tratamientos. Los modelos animales de HIE son particularmente útiles como diferentes eventos clínicos pueden conducir a HIE y la incidencia en cualquier centro de maternidad sola es baja 5. Una configuración experimental en el que la influencia de la variación biológica puede ser minimizado, es esencial al probar nuevas herramientas de pronóstico y diagnóstico y estrategias de tratamiento. Un modelo animal debe aproximarse a la situación clínica tanto como sea posible, lo que contribuye a la comprensión de los mecanismos patológicos subyacentes a la lesión inducida y el proceso dinámico que participan en la evolución de la enfermedad y ES 9. Los modelos animales de HIE neonatal han incluido un número de especies, incluyendo roedores, cordero, y cerdo. En comparación, el lechón recién nacido tiene mayor parecido con un recién nacido humano con respecto al tamaño, el sistema cardiovascular 10 y la madurez del cerebro en el momento de la entrega 11,12. Monitoreo, instrumentación y evaluación de resultados en el modelo de los lechones es similar a that utilizado en la atención clínica de los recién nacidos con EHI. Por consiguiente, existe un alto grado de atención del recién nacido traducción a partir de este modelo. Lechones modelos de hipoxia perinatal y HIE son utilizados por muchos grupos y varían en un número de áreas 13. De acuerdo con el propósito del experimento, se debe prestar especial atención a la elección de los medicamentos, el método de inducción de hipoxia-isquemia, método de control de la duración y la gravedad insulto, reanimación y cuidados post-insulto, y la evaluación de resultados. Para evitar el sesgo de un diseño de ensayo aleatorio siempre se debe utilizar en los estudios de intervención. El método aplicado cuando se provoque lesiones hipóxico-isquémica es importante. Hipoxia global que lleva a HIE a menudo resulta en fallo multiorgánico que implica cerebro, el corazón, los pulmones, los riñones y el hígado. Dependiendo de los resultados evaluados, los modelos de HIE deben basarse en la hipoxia isquemia global y lugar de confiar en la isquemia focal, por ejemplo., Por ligación de cochearterias OTID 14. Un artículo reciente aplica una combinación de hipoxia (FiO 2 12%) y la compresión de la arteria carótida, mientras que el mantenimiento de la presión sanguínea arterial media&gt; 40 mm Hg 2. Otro grupo indujo hipoxia global al 8% de O 2 hasta que el exceso de base negativa&gt; 20 mmol / L o la presión arterial media arterial (PAM) &lt;15 mm Hg, y sacrificó a los animales a las 4 h 15. La hipoxia también ha sido valorada por el gasto cardíaco (a 30-40% de la línea de base), MABP (a 30-35 mm Hg) y el pH arterial (6,95-7,05) 16. Modelos de hipoxia-isquemia global valorada por la supresión aEEG similar a la presentada en este informe, han demostrado que la encefalopatía es clínicamente, electrofisiológicamente y neuropatológicamente comparable a la condición de que se encuentra en el recién nacido a término asfixiados 17,18. El grado de HIE inducida es esencial. Un modelo animal útil de HIE también debe permitir la prueba de nuevos diaprocedimientos y opciones de tratamiento gnóstico. Para permitir esto, los modelos deben inducir HIE moderada, donde hay un potencial tratamiento como lesión cerebral severa con poco o ningún potencial tratamiento sería menos relevante en la evaluación de nuevos tratamientos. La tolerancia a la hipoxia varía considerablemente entre los animales de prueba. Estudios anteriores han demostrado que una lesión cerebral más consistente se puede lograr y que más animales sobrevivir 17,19 individualizando la hipoxia inducida según la respuesta cerebral de cada lechón evaluadas por amplitud integrado electroencefalografía (aEEG) en lugar de utilizar un conjunto FiO valor 2 en todo el evento hipóxico. La duración de la supresión aEEG se correlaciona con el grado de lesión cerebral, con pocos cambios histopatológicos a &lt;20 min aEEG supresión y convulsiones severas crecientes en&gt; 45 min aEEG supresión. Una reciente revisión de tratamientos neuroprotectores para HIE identificó la necesidad de modelos de supervivencia que permite meas de resultado conductualesUres en modelos animales 20. Hay numerosas ventajas del modelo de lechones HIE presentado. Se basa en una especie donde los resultados son altamente probable que se traducen a la fisiología humana. Los modelos globales hipoxia-isquemia fallo multiorgánico y la titulación de la hipoxia-isquemia por aEEG induce un grado consistente de lesión cerebral con la supervivencia resultados clínicos relevantes, tales que los biomarcadores, MRI y el comportamiento pueden ser evaluados en puntos de tiempo relevantes. Modelos cochinillo de asfixia perinatal y HIE no sólo han contribuido de manera significativa a la visión actual en HIE fisiopatología, pero también han precedido con éxito los ensayos clínicos, en última instancia, lo que resulta en nuevos tratamientos en humanos. Estudios en modelos Piglet jugaron un papel clave en el establecimiento de la hipotermia como tratamiento para la HIE 21, y se utilizan en la investigación de resucitación neonatal 22. Varios grupos han utilizado modelos de lechones al realizar la investigación dentro de la asfixia y la HIE, und estudios incluyen la hipotermia 23, alfa-melanocitos hormona estimulante 24, paro cardíaco 25, la tirosina hidroxilasa actividad 26, la exposición hipóxica repetida 27, la actividad del receptor NMDA 14, y espectroscopia de infrarrojo cercano 28. El modelo de HIE lechones se presenta en este informe es técnicamente difícil de trabajar, como pequeños ajustes durante el curso del procedimiento pueden resultar en una lesión cerebral demasiado suave o demasiado severa 29,2. Encontramos que la literatura existente carecía de suficiente detalle para reproducir modelos publicados anteriormente. Por lo tanto, aquí demostramos cada paso de los procedimientos técnicos necesarios para el establecimiento de un modelo de supervivencia de 72 horas de los lechones en este informe, lo que permite a los investigadores a establecer este modelo avanzado para el estudio de HIE.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:647px;">Warm-touch-pediatric blanket</td>
			<td style="width:211px;">Covidien</td>
			<td style="width:176px;">5030840</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesive Apertrue Drape</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>915447</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Utility Drape (sterile) 75x80 cm</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>800530</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neoflon</td>
			<td>BD - Luer</td>
			<td>391350</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:647px;">Laryngoscope</td>
			<td style="width:211px;">Miller</td>
			<td style="width:176px;">85-0045</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endotracheal tube 2.5 mm&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>111-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endotracheal tube 3.0 mm with cuff</td>
			<td>Unomedical</td>
			<td>MM61110030</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endotracheal tube 3.5 mm with cuff</td>
			<td>Unomedical</td>
			<td>MM61110035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:647px;">Anesthesia machine</td>
			<td style="width:211px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:176px;">1009-9002-000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EEG - electrodes/disposable subdermal needle electrode</td>
			<td>Cephalon</td>
			<td>ACCE120550</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECG - electrodes</td>
			<td>medtronic</td>
			<td>3010107-003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECG-electrodes for MR</td>
			<td>philips</td>
			<td>ACCE120550</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Arterial blood sampler - aspirator</td>
			<td>Radiometer medical ApS</td>
			<td>956552</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyurethane Umbilical vein catheter (5 Fr/Ch)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8888160341</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyurethane Umbilical vein catheter (3,5 Fr/ch)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8888160333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suture set (size 3-0)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8886 623341</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Spinal needle 0.7x38mm</td>
			<td>BD needles</td>
			<td>405254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:647px;">Gas with 96% Nitrogen / 4% oxygen</td>
			<td style="width:211px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:176px;">made on order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:647px;">NeuroMonitor (CFM) system</td>
			<td>Natus Medical Incorporated</td>
			<td>OBM70002</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy

Asfixia en el nacimiento, lo que causa la encefalopatía hipóxico-isquémica (EHI), representa 0.660.000 muertes en el mundo cada año, alrededor de un cuarto de 2,9 millones de muertes neonatales en el mundo. Los modelos animales de HIE han contribuido a la comprensión de la fisiopatología en HIE, y han puesto de relieve el proceso dinámico que se producen en la lesión cerebral debido a la asfixia perinatal. Por lo tanto, los estudios en animales han sugerido una ventana de tiempo para las estrategias de tratamiento post-injuria. La hipotermia ha sido probado como un tratamiento para HIE en modelos pdiglet y posteriormente demostrado ser eficaz en ensayos clínicos. Variaciones del modelo se han aplicado en el estudio de los métodos neuroprotectores complementarios y estudios de lechones de xenón y la melatonina han llevado a fase clínica I y II de los ensayos 1,2. El modelo de HIE lechones se utiliza más para los estudios resuscitation- y hemodinámicos neonatales, así como en las investigaciones de la hipoxia cerebral a nivel celular. Sin embargo, es un desafío técnicomodelo y las variaciones en el protocolo pueden conllevar lesiones cerebrales demasiado suave o demasiado severa. En este artículo, nos demuestran los procedimientos técnicos necesarios para el establecimiento de un modelo estable de lechones EHI neonatal. En primer lugar, el lechón recién nacido (&lt;24 horas de edad, la mediana de peso 1500 g) es anestesiado, intubado, y monitoreado en una configuración similar a la encontrada en una unidad de cuidados intensivos neonatales. Global hipoxia-isquemia es inducida mediante la reducción de la fracción inspiratoria de oxígeno para lograr la hipoxia global, isquemia a través de la hipotensión y un EEG de amplitud traza plana integrado (aEEG) indicativo de la hipoxia cerebral. La supervivencia se promueve mediante el ajuste de la oxigenación de acuerdo con la respuesta aEEG y la presión arterial. La lesión cerebral se cuantifica por histopatología y la resonancia magnética después de 72 horas.

Los efectos de la hipoxia-isquemia en el cerebro que ocurren durante el insulto inducida se documentan mediante el registro de la huella aEEG. Un representante aEEG traza se muestra en la Figura 6. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig6.jpg" /> Figura 6. Representante aEEG rastro. Baja amplitud debido a la hipoxia-isquemia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig6large.jpg" ...

Watch this Scientific Journal Video about A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy at JoVE.com

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Un modelo del cochinillo de Neonatología encefalopatía hipóxico-isquémica

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

a-piglet-model-of-neonatal-hypoxic-ischemic-encephalopathy

Research

JoVE Journal

Medicine

19.5K vistas.  Institute of Clinical Medicine, Aarhus University Hospital. Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. 

Video: A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

A Swine Model of Neonatal Asphyxia

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, perfusion deficit, hypoxic-ischemic encephalopathy, pulmonary hypertension, vasculopathic enterocolitis, renal failure and thrombo-embolic complications. Animal models are developed to help us understand the patho-physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. In comparison to rodents and newborn lambs, the newborn piglet has been proven to be a valuable model. The newborn piglet has several advantages including similar development as that of 36-38 weeks human fetus with comparable body systems, large body size (&tilde;1.5-2 kg at birth) that allows the instrumentation and monitoring of the animal and controls the confounding variables of hypoxia and hemodynamic derangements.
We here describe an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia and allow us to examine the systemic and regional hemodynamic changes during the asphyxiating and reoxygenation process as well as the respective effects of interventions. Further, the model has the advantage of studying multi-organ failure or dysfunction simultaneously and the interaction with various body systems. The experimental model is a non-survival procedure that involves the surgical instrumentation of newborn piglets (1-3 day-old and 1.5-2.5 kg weight, mixed breed) to allow the establishment of mechanical ventilation, vascular (arterial and central venous) access and the placement of catheters and flow probes (Transonic Inc.) for the continuously monitoring of intra-vascular pressure and blood flow across different arteries including main pulmonary, common carotid, superior mesenteric and left renal arteries. Using these surgically instrumented piglets, after stabilization for 30-60 minutes as defined by Z&lt;10% variation in hemodynamic parameters and normal blood gases, we commence an experimental protocol of severe hypoxemia which is induced via normocapnic alveolar hypoxia. The piglet is ventilated with 10-15% oxygen by increasing the inhaled concentration of nitrogen gas for 2h, aiming for arterial oxygen saturations of 30-40%. This degree of hypoxemia will produce clinical asphyxia with severe metabolic acidosis, systemic hypotension and cardiogenic shock with hypoperfusion to vital organs. The hypoxia is followed by reoxygenation with 100% oxygen for 0.5h and then 21% oxygen for 3.5h. Pharmacologic interventions can be introduced in due course and their effects investigated in a blinded, block-randomized fashion.

Large animal models have good translational values in the examination of physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. Using newborn piglets, we develop an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia which has advantages of studying the systemic and regional hemodynamics, oxygen transport with biochemical and pathologic pathways and correlations.

Un modelo porcino de la asfixia neonatal

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, ...

Investigación

Medicina

Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the age of 50, yet it is the least understood and studied chronic pelvic pain disorder. A significant subset of patients with chronic pelvic pain report having experienced early life stress or abuse, which can markedly affect the functioning and regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis. Mast cell activation, which has been shown to be increased in both urine and expressed prostatic secretions of CP/CPPS patients, is partially regulated by downstream activation of the HPA axis. Neonatal maternal separation (NMS) has been used for over two decades to study the outcomes of early life stress in rodent models, including changes in the HPA axis and visceral sensitivity. Here we provide a detailed protocol for using NMS as a preclinical model of CP/CPPS in male C57BL/6 mice. We describe the methodology for performing NMS, assessing perigenital mechanical allodynia, and histological evidence of mast cell activation. We also provide evidence that early psychological stress can have long-lasting effects on the male urogenital system in mice.

We are measuring perigenital mechanical sensitivity and mast cell activation in the prostate of male C57BL/6 mice that underwent an early life stress paradigm &#8211; neonatal maternal separation, in order to induce a preclinical model of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome.

Evaluación de perigenital Sensibilidad y Prostática mástil activación celular en un modelo de ratón de la separación materna neonatal

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Un ratón neonatal lesión de médula espinal de compresión Modelo

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

Una batería de pruebas de motor en un modelo de ratón neonatal de la parálisis cerebral

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

El infarto de miocardio en ratones recién nacidos, un modelo de regeneración cardiaca

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Use of a Piglet Model for the Study of Anesthetic-induced Developmental Neurotoxicity (AIDN): A Translational Neuroscience Approach

Anesthesia cannot be avoided in many cases when surgery is required, particularly in children. Recent investigations in animals have raised concerns that anesthesia exposure may lead to neuronal apoptosis, known as anesthesia-induced developmental neurotoxicity (AIDN). Furthermore, some clinical studies in children have suggested that anesthesia exposure may lead to neurodevelopmental deficits later in life. Nonetheless, an ideal animal model for preclinical study has yet to be developed. The neonatal piglet represents a valuable model for preclinical study, as they share a striking number of developmental similarities with humans.
The anatomy and physiology of piglets allow for implementation of rigorous human perioperative conditions in both survival and non-survival procedures. Femoral artery catheterization allows for close monitoring, thus enabling prompt correction of any deviation of the piglet's vital signs and chemistries. In addition, there are multiple developmental similarities between piglets and human neonates. The techniques required to use piglets for experimentation will require experience to master. A pediatric anesthesiologist is a critical member of the investigative team. We describe, in a general sense, the appropriate use of a piglet model for neurodevelopmental study.

Use of a Piglet Model for the Study of Anesthetic-induced Developmental Neurotoxicity AIDN: A Translational Neuroscience Approach

Anesthesia-induced developmental neurotoxicity (AIDN) research has focused on rodents, which are not broadly applicable to humans. Non-human primate models are more relevant, but are cost-prohibitive and difficult to use for experimentation. The piglet, in contrast, is a clinically relevant, practical animal model ideal for the study of anesthetic neurotoxicity.

Uso de un Modelo de Cochinillo para el Estudio de la Neurotoxicidad de Desarrollo inducida por Anestesia (AIDN): Un Enfoque de Neurociencia Translacional

Anesthesia cannot be avoided in many cases when surgery is required, particularly in children.  Recent investigations in animals have raised concerns that ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Un modelo de ratón BALB/c neonatal de enterocolitis necrosante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. Here, we describe a protocol to generate a two-dimensional (2D) monolayer from three-dimensional (3D) non-human primate enteroids derived from intestinal crypts of the terminal ileum. These enteroid-derived monolayers were then utilized in an in vitro scratch wound assay to test the ability of hyaluronan 35 kDa (HA35), a human milk HA mimic, to promote cell migration and proliferation along the epithelial wound edge. After the monolayers were grown to confluency, they were manually scratched and treated with HA35 (50 &#181;g/mL, 100 &#181;g/mL, 200 &#181;g/mL) or control (PBS). Cell migration and proliferation into the gap were imaged using a transmitted-light microscope equipped for live-cell imaging. Wound closure was quantified as percent wound healing using the Wound Healing Size Plugin in ImageJ.&#160;The scratch area and rate of cell migration and the percentage of wound closure were measured over 24 h. HA35 in vitro accelerates wound healing in small intestinal enteroid monolayers, likely through a combination of cell proliferation at the wound edge and migration to the wound area. These methods can potentially be used as a model to explore intestinal regeneration in the preterm human small intestine.

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

This protocol describes a method to establish and perform a scratch wound assay on two-dimensional (2D) monolayers derived from three-dimensional (3D) enteroids isolated from non-human primate ileum.

Efecto del ácido hialurónico 35 kDa en un modelo in vitro de lesión prematura del intestino delgado y curación utilizando monocapas derivadas de enteroides

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...