Nuestro protocolo proporciona un enfoque fácil y rápido para el aislamiento primario de fibroblastos con un enfoque claro en evitar la contaminación bacteriana, lo que puede ser un gran problema. Especialmente para principiantes. La principal ventaja de nuestra técnica es su simplicidad.
Como no requiere amplias habilidades manuales o experiencia y puede ser fácilmente aprendido por todo el mundo dentro de un corto período de entrenamiento. Presentando la técnica estará Manja Newe, un técnico del laboratorio. Antes de comenzar la disección, ponte dos pares de guantes desechables, uno encima del otro.
Y fija el ratón a una almohadilla de poliestireno. Desinfectar el pelaje con 70%etanol, asegurándose de que el animal esté empapado. Y usa fórceps quirúrgicos esterilizados con etanol y tijeras atraumáticas para copar la piel justo por encima del tracto urogenital.
Corte de tres a cuatro centímetros a lo largo de la línea media desde la incisión inicial hasta el cuello, añadiendo cortes de alivio en las extremidades. Y fijar la piel a la almohadilla para lograr un acceso óptimo a la musculatura que cubre la cavidad abdominal. Luego, desinfecta la musculatura abdominal dos veces con 70% de etanol fresco.
Cuando el etanol se haya secado, retire el primer par de guantes. Y usa un nuevo conjunto estéril de fórceps y tijeras para incitar a la capa muscular para abrir la cavidad abdominal y el tórax. Para extraer los órganos de interés, agarre suavemente cada órgano con los fórceps quirúrgicos sin perforar el tejido.
Y use las tijeras para cortar cuidadosamente los vasos sanguíneos suministradores cerca del punto de entrada del órgano. Coloque cada órgano en un tubo de PBS estéril y frío y cierre bien el tubo. Colocar cada tubo sobre hielo húmedo a medida que se recogen los órganos.
Cuando todos los órganos han sido cosechados, rocíe los tubos con 70% de etanol antes de colocarlos en una campana de cultivo celular estéril. Usando un par de guantes frescos, usa fórceps estériles para transferir cada órgano a la mitad de un plato estéril de seis centímetros de Petri. Y lave brevemente los órganos con PBS fresco para eliminar el exceso de sangre.
Transfiera los órganos enjuagados a la segunda mitad de cada plato de Petri y retire el exceso de PBS. Usando dos bisturíes estériles, pica los órganos en fragmentos de uno a dos milímetros. Y usa una espátula estéril para transferir las piezas de tejido a tubos nuevos, individuales, estériles y de 15 mililitros.
Añadir dos mililitros de 0.25%Trypsin solución a cada tubo. Y coloque los tubos en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Al final de la incubación, vórtice los tubos a unas 1400 rotaciones por minuto durante diez segundos.
Y detener la reacción de La Trippsina con cuatro mililitros de un medio de cultivo apropiado complementado con suero de ternera fetal por tubo. A continuación, agregue el volumen adecuado de solución de mezcla de colagenasa a cada tubo. Y coloque los tubos en un baño de agua ultrasónico de 37 grados Celsius durante 10 minutos.
Al final de la sonicación, vórtice suavemente los tubos durante 10 segundos. Antes de colocar los tubos de nuevo en el baño de agua ultrasónica durante 10 minutos más. Al final de la segunda sonicación, vórtice los tubos durante 10 segundos más.
Y desinfectar los tubos con 70% etanol. En la capucha de cultivo celular, filtre las suspensiones celulares a través de coladores individuales de 40 micrómetros en un nuevo tubo estéril de 15 mililitros. Y recoger las células por centrifugación.
Vuelva a suspender los pellets en un mililitro de medio fresco por tubo. Y ver las células en recipientes de cultivo celular adecuados en densidades de chapado adecuadas. Luego, coloque las células en la incubadora de cultivo celular durante la noche.
A la mañana siguiente, lave cada cultivo tres veces con PBS antes de agregar un medio fresco y devolver las células a la incubadora. Usando este protocolo, se pueden obtener fibroblastos viables para su uso en experimentos posteriores. Como la tinción amino fluorescente o los experimentos de proliferación.
Los fibroblastos adultos son células planas en forma de husillo con múltiples procesos celulares que normalmente crecen en monocapas. Sin embargo, se pueden observar diferencias morfológicas distintas en las poblaciones de fibroblastos de diferentes órganos. Por ejemplo, los fibroblastos renales son más pequeños y crecen a densidades más altas que los fibroblastos cardíacos, pulmonares o hepáticos.
Los fibroblastos aislados muestran altas tasas de proliferación, alcanzando una confluencia óptica superior al 90% después de aproximadamente seis días. Aquí, se puede observar un miofibroblast diferenciado con microfilamentos distintivos de actina muscular lisa alfa. Estas células se encuentran en abundancia en el corazón, riñón, hígado, y cultivos de células pulmonares.
Mientras que sólo alrededor de 20 a 30 por ciento de las células aisladas y cultivadas expresan microfilamentos de fuerzas de acción muscular lisas ordenadas, dispuestas, prácticamente todas las células son positivas para Vimentin y El Receptor de Dominio Discoidin 2 después de siete días en el cultivo. Lo más importante a recordar es utilizar la técnica correcta durante todo el procedimiento, ya que se debe evitar la contaminación bacteriana. Después del aislamiento primario de fibroblastos, las células se pueden utilizar para todo tipo de experimentos de psiquiatría y caracterización.
Como la proliferación de la química inmunocítica o ensayos de cicatrización de heridas, o evaluaciones biológicas moleculares.
