authors gratefully acknowledge funding support from the Molly Towell Perinatal Research Foundation, Canadian Institutes of Health Research (CIHR), and Fonds de Recherche du Qu&#233;bec &#8211; Sant&#233; (FRQS) (to MGF) and CIHR-Quebec Training Network in Perinatal Research (QTNPR) (to LDD).
The authors wish to thank Esther Simard, Marco Bosa, Carl Bernard and Carmen Movila for technical assistance.

Cuidado de los animales a las directrices del Consejo Canadiense de los Animales y la aprobación por el Consejo de Montréal Universidad de los Animales (protocolo nº 10-Rech-1560). La información detallada sobre los materiales y métodos utilizados se proporciona en la Tabla 1. 1. Anestesia <ol><li> Insertar un catéter de un solo lumen en una vena yugular. </li><li> Sedate la oveja usando acepromacina (Atravet 10 mg / mL) 2 mg por vía intravenosa aproximadamente 30 min antes de la inducción de la anestesia con el fin de reducir el estrés asociado con el procedimiento que a su vez reduce los niveles de cortisol. </li><li> Administrar diazepam (Diazepam 5 mg / ml) 20 mg, ketamina (Ketalar 100 mg / mL) 4-5 mg / kg y propofol (Propofol 10 mg / ml) 0,5 a 1 mg / kg por vía intravenosa para inducir la anestesia general. </li><li> Inserte un catéter de intercambio de la vía aérea en la tráquea utilizando un laringoscopio con un tipo de hoja de Wisconsin (extralargas 350 mm Zurdo hoja) para ayudar con la intubación. Deslizar el tubo endotraqueal de silicio (diámetro de 9 a 12 mm Interior) fuera del catéter de cambio y de las vías respiratorias dentro de la tráquea. Esta técnica facilita el proceso de intubación. Inflar el manguito del tubo endotraqueal con cuidado para evitar la ulceración inducida por la presión de la tráquea y fijar el tubo en la cabeza de la oveja. </li><li> Conecte el tubo endotraqueal al circuito respiratorio de la máquina de anestesia y comenzar la ventilación mecánica inmediatamente. Ajustar la configuración de ventilador para mantener una P a CO 2 dentro de los límites normales de 35 a 45 mmHg. </li><li> Insertar un catéter en la arteria auricular (22 a 20 G; 1 en [0,9 x 25 mm] a 1,16 en [1,1 x 30 mm]) y conectarse a la tubería no conforme para supervisar la presión sanguínea arterial directa. </li><li> Utilice un monitor fisiológico multiparamétrico para registrar el electrocardiograma, presión arterial directa, la saturación de oxígeno (SpO 2), capnografía (PETCO2), y la temperatura cada 5 minutos. Transferir todas phdatos ysiologic a través de un cable serie a un equipo de recolección de datos fisiológicos central. Mantenga la temperatura normal del cuerpo utilizando una manta de agua circulante. </li><li> Administrar una solución de poli-iónico equilibrada a 10 ml / kg para la primera hora de la anestesia general y luego reducir a 5 mL / kg / h. </li><li> Administrar trimetoprim-sulfadoxina 5 mg / kg IV de la oveja justo antes de la incisión de la piel como la profilaxis antibiótica. </li><li> Utilizar técnicas asépticas estándar con todas las manipulaciones quirúrgicas de la oveja y el feto. </li><li> Barrera enfermera las ovejas en todo momento. Esto incluye también el personal no quirúrgicos. Esto minimizará el potencial enzoótica para, por ejemplo, Coxiella burnetii. Utilice guantes y máscaras (N-95 tipo) en todo momento. </li></ol> 2. Descripción del Procedimiento Quirúrgico <ol><li> Haga una 20 cm incisión a través de la pared abdominal inferior inmediatamente craneal a la ubre a través de la línea alba para minimizar el daño del músculo abdominal. <ol><li> Retract epiplón mayor craneal y los cuernos uterinos se palpan manualmente. Palpar cada cuerno del cuerpo del útero a la punta del cuerno notar el número de fetos y su tamaño. Si hay más de un feto, elegir el feto más grande mediante la evaluación manualmente el tamaño de la cabeza y la anchura entre las órbitas. </li><li> Sostenga la cabeza del feto elegido firmemente a través del útero parcialmente exteriorizado. Realice una histerotomía 10 cm en la gran curvatura con tijeras Metzenbaum. Poner inmediatamente sobre la cabeza de un guante quirúrgico estéril sin látex lleno con solución salina estéril como si fuera una mano. Como alternativa, utilice los 4x4 humedecidas para mantener la cabeza del feto húmedo. Asegure el útero a la pared abdominal. <ol><li> Exteriorizar los derecho e izquierdo miembros torácicos y tire suavemente el feto fuera del útero hasta el proceso xifoides. </li></ol></li><li> Inserte catéteres de polivinilo en la vena braquial derecha y la izquierda y las arterias utilizando una técnica de corte hacia abajo estándar. Inserte another de polivinilo catéter en la cavidad amniótica por fijando su extremo con el esternón del feto. <ol><li> Utilice sólo catéteres estériles. Se recomienda la esterilización de gas en su instalación estándar. Adjuntar cada catéter a una aguja y la aguja a una doble llave de paso para permitir el muestreo de sangre posterior o monitorización de la presión. </li></ol></li><li> Sutura electrodos de acero inoxidable a la manubrio, apéndice xifoides y para cada punto del hombro para vigilar el electrocardiograma (ECG). </li><li> Volver al feto en el útero. Todos los catéteres y electrodos de salida a través de una pequeña incisión en el flanco izquierdo. </li><li> Cierre la incisión de laparotomía usando un cierre de tres capas. Suturar la pared abdominal con una sutura de monofilamento sintético absorbible USP 2 en una manera simple continua. Cierre el espacio subcutáneo con una sutura trenzada absorbible sintético USP 0 en una sencilla forma continua. Utilice grapas de acero inoxidable quirúrgicas para cerrar la incisión de la piel. </li></ol></li><li&gt; Descripción detallada del procedimiento quirúrgico <ol><li> Retire la lana por el afeitado el proceso xifoides a la glándula mamaria y largo del pliegue del flanco en cada lado con una hoja # 40. Limpie el abdomen ventral a continuación a fondo con un gluconato de clorhexidina al 4% y un cepillo suave durante 3 min. <ol><li> Realizar un lavado estéril estándar con gluconato de clorhexidina al 4% a partir del centro del abdomen y progresando de manera centrífuga durante 3 min. Vierta solución salina estéril en el abdomen para quitar el jabón desinfectante. Para la etapa final de la preparación quirúrgica, realizar tres pasajes alternos de solución de gluconato de clorhexidina al 2% y alcohol isopropílico al 70%. </li></ol></li><li> Asegúrese de que la profundidad de la anestesia es la adecuada antes de la incisión. Hacer una incisión de laparotomía estándar desde el ombligo hasta justo craneal a la ubre a través de la línea alba para minimizar el daño del músculo abdominal. </li><li> Inserte un largo fórceps de esponja en el abdomen a lo largo de la pared abdominal izquierda arribaal sitio de salida prevista para los catéteres en la región paracostal. <ol><li> Empuje la punta de la pinza contra la pared hasta que un asistente puede localizarlo y confirmar el lugar apropiado. Abra ligeramente (1 cm) las mandíbulas de las pinzas y dejar que el asistente crea un 2 cm incisión de espesor total. </li><li> Exteriorizar las puntas de las pinzas a través de la incisión, abrirá de nuevo, y agarre suavemente los catéteres con las pinzas que finalmente se retiró del abdomen a través de la incisión abdominal ventral. Es de destacar que algunos grupos implantan los catéteres y luego exteriorizan ellos. Esto tiene el inconveniente de que la monitorización del ECG fetal intraoperatorio no es posible. </li></ol></li><li> Palpar el útero para determinar la posición y los números fetal. Determinar el mayor feto utilizando la distancia inter-aural. Incisión en la pared uterina en la gran curvatura sobre el dorso de la cabeza, evitando los cotiledones. <ol><li> Inserte una cánula de extremo romo a través de las membranas de la placenta para obtener un ammuestra gratis por hemorragia fluido niotic. Incisión en las membranas de la placenta con unas tijeras. </li></ol></li><li> Exteriorizar la media craneal del feto a través de esta incisión. Coloque un guante quirúrgico de látex no estéril lleno de solución salina estéril a 37 ° C sobre la cabeza del feto para ayudar a mantener la normotermia. <ol><li> Durante la retirada de la parte superior del cuerpo del feto desde el útero, tienen el asistente que mantenga arriba de la Babcock para evitar la pérdida de líquido amniótico. Entonces, de nuevo utilizando fórceps Babcock, sujetar las membranas fetales y pared uterina a la piel para evitar la contaminación abdominal con líquido amniótico. </li><li> Expose sólo las partes del cuerpo fetal que necesitan ser instrumentado y mantener las partes restantes dentro del útero o cubiertos por paños estériles húmedas y calientes (37 ° C), respectivamente. </li></ol></li><li> Secuestrar a ambos miembros torácicos para facilitar la exposición a la arteria braquial y la vena bilateralmente. Una incisión a lo largo de la cara medial de ambos antebrachium y cuidadodiseccionar completamente alrededor de la arteria braquial y la vena. </li><li> Inserte catéteres de polivinilo en el derecho y las arterias braquial izquierda y el brazo izquierdo de la vena utilizando una técnica de corte hacia abajo estándar. <ol><li> Libertad para los buques que se cateterizó del tejido adyacente más de 1 cm. Ligar la porción distal del vaso con un trenzado de sutura absorbible sintética de 2-0 USP. Preplace una ligadura en el aspecto proximal del vaso pero mantenerlo no condicionada. <ol><li> Con unas tijeras Castroviejo, cortar transversalmente el recipiente a aproximadamente el 30% de su diámetro. Detenga el flujo de sangre parcialmente tirando de la sutura proximal. Insertar el catéter en una dirección proximal. </li></ol></li><li> Inserte el catéter de polivinilo hasta 8 cm proximal o hasta que se detecta la resistencia y luego tire un poco hacia atrás. Temporalmente asegurar el aspecto proximal del catéter utilizando una pinza vascular. Coloque otra sutura alrededor tanto en el aspecto proximal y distal del catéter. Un asistente está continuamente aspirating y el lavado del catéter para asegurar la permeabilidad del catéter. </li><li> Cierre la piel fetal utilizando una sutura sintética absorbible trenzada USP 2-0, con un patrón de sutura continua. </li></ol></li><li> A la derecha y el hombro izquierdo, manubrio y el proceso xifoides, fijar un electrodo de acero inoxidable aislado para facilitar el seguimiento del ECG fetal. </li><li> Suturar la presión amniótico y el catéter de muestreo hasta el esternón. Este catéter está fenestrado en su extremidad. </li><li> Asegure todos los catéteres en el dorso del feto usando un material trenzado sutura sintética absorbible USP 2-0. </li><li> Antes de la sustitución del feto de nuevo en el útero, administrar clenbuterol 30 mg IV lentamente durante 15 min para evitar la hipotensión y para proporcionar relajación uterina. </li><li> Suturar las membranas fetales usando USP 4-0 material de sutura absorbible sintética trenzada con un patrón continuo. Incorporar un solo catéter o electrodo a la vez en los closure para asegurar un cierre estanco. Utilice un patrón de doble capa de Cushing respetando principios Halsted para cerrar la capa muscular del útero mediante un trenzado de material de sutura absorbible sintética USP 0. Denunciar los nudos quirúrgicos con cuidado. </li><li> El uso de un patrón de sutura en bolsa de tabaco, asegurar todos los catéteres y cables de ECG cuando se aproximan a la incisión paracostal izquierda. </li><li> El uso de un monofilamento sintético material de sutura absorbible USP 2 asegurar la línea alba con un patrón continuo. Cierre los tejidos subcutáneos utilizando USP 2-0 trenzado material de sutura absorbible sintética con un patrón continuo. Asegure la capa de la piel con grapas quirúrgicas. </li><li> Administrar 250 mg de ampicilina por vía intravenosa y de nuevo a través del catéter amniótico en la cavidad amniótica. Reemplazar los líquidos perdidos amniótico con solución salina tibia. </li><li> Coloque todos los catéteres exteriorizados y electrodos de ECG en una bolsa de lugar para mantener la esterilidad. Coloque un jersey alrededor del torso de la oveja para asegurar toda la una catéteresd electrodos en el cuerpo de la oveja. </li><li> Deje de anestesia general, y retirar la intubación la oveja vez reflejos laríngeos han vuelto a la normalidad. </li><li> Volver a la oveja a una jaula metabólica una vez que ella es estable después de la anestesia general. La oveja residirá en la jaula metabólica durante la duración del experimento. La oveja debe ser capaz de pararse, acostarse y comer a voluntad mientras se controla el feto no anestesiados sin sedante a la madre. </li><li> Para los siguientes tres días, administrar antibióticos de forma profiláctica a la oveja (Trimetoprim sulfadoxina 5 mg / kg) y el feto (250 mg de ampicilina por vía intravenosa y de nuevo a través del catéter amniótico). </li><li> Evaluar el estado metabólico de tanto oveja y el feto mediante análisis de sangre de gas. </li><li> Lave todos los catéteres con el volumen mínimo de solución salina heparinizada posible. Precaución - no exceda la dosis diaria de heparina y fluidos permisible para el feto. Es posible fluido sobrecargar el feto. Flush lentamente una vezun día ~ 5 ml de NaCl por línea después de la profilaxis antibiótica. </li></ol></li><li> Grabación y análisis de datos <ol><li> Durante la cirugía, opcionalmente registrar las tasas de ECG y del corazón de la madre y del feto, así como la presión arterial de la madre y la presión de la vía aérea (Paw) de forma continua (Figura 1). Utilice la ventana Monitor de vida para adquirir todos los datos maternos excepto ECG. Alimente estos datos en convertidor analógico-digital, junto con las señales de ECG fetal y materna; pasar ECG materno y fetal por primera vez en 1,901 mil pre-amplificador. Grabar y visualizar todos los datos en el software del fabricante. </li><li> Tomar una muestra arterial 1 ml al mismo tiempo de la oveja y el feto para el análisis de gases en sangre arterial, lactato, glucosa y basar el exceso de determinación (en el plasma) en el inicio de la cirugía fetal (inmediatamente después de insertar el primer catéter arterial) y después de cerrar el útero . </li><li> Durante la recuperación postoperatoria, tomar un 3 ml de muestra de sangre fetal para medir la IL-6 y TNF-α inflammperfiles Atory. Centrifugar el plasma a 4 ° C (4 min, 4000 xg), se decanta y almacenar el plasma a -80 ° C para la prueba de ELISA subsiguiente. Nota: A los efectos de los resultados representativos reportados, seis días después de la cirugía los animales fueron sacrificados mediante la inyección intravenosa de pentobarbital sódico 20 ml. El crecimiento fetal se evaluó por el cuerpo, el cerebro, el hígado y pesos maternas. La duración del período experimental, obviamente, varían en función del diseño elegido para la pregunta de investigación particular y puede alcanzar ~ 6 semanas. </li></ol></li><li> Análisis de citoquinas (paso opcional) <ol><li> Determinar las concentraciones de citoquinas (IL-6, TNF-alfa) en el plasma utilizando un sándwich ELISA específico ovina. Anticuerpos monoclonales anti-oveja Pre-capa de ratón (anticuerpo de captura IL-6) o anticuerpo monoclonal de ratón anti-bovina (TNF-α) a una concentración 4 g / ml en la placa de ELISA a 4 ° C para O / N, después 3 veces lavar con tampón de lavado (0,05% Tween 20 en PBS, PBST). </li><li>Bloquear las placas durante 1 h con 1% de BSA en PBST. Lavar las placas con tampón de lavado 3 veces. </li><li> Utilice proteínas recombinantes ovejas (IL-6, TNF-alfa) como estándar ELISA, se preparan unas diluciones seriadas van desde estándar de 1 de 2.000 ng / ml a nivel 7 de 31,25 pg / ml. </li><li> Carga de 50 l de estándares de proteína diluidas en serie y muestras por pocillo e incubar durante 2 horas a RT, se lavan las placas 3 veces. Ejecutar todos los estándares y las muestras por duplicado. </li><li> Aplicar 50 l de anticuerpos policlonales de conejo anti-oveja (anticuerpo de detección IL-6) o anticuerpo policlonal de conejo anti-bovina (TNF-a) a una dilución de 1: 250 en pocillos e incubar durante 30 min a TA. Lavar las placas con tampón de lavado 5 veces. </li><li> Añadir 50 l de la cabra anti-IgG de conejo conjugado con HRP (dilución 1: 5000) durante 30 min. </li><li> Incubar con 50 l de solución de sustrato TMB por pocillo. </li><li> Detener la reacción desarrollo de color a tiempo deseado con 25 l de 2 N de ácido sulfúrico. </li><li> Lea la plates en ELISA lector de placas a 450 nm, con una corrección de longitud de onda 570 nm. Nota: En nuestros ensayos, la sensibilidad de IL-6 ELISA fue de 16 pg / ml, la sensibilidad de TNF-ELISA fue de 13,9 pg / ml, respectivamente. Para todos los ensayos, los intra-ensayo e inter-ensayo coeficientes de variación fue &lt;5% y &lt;10%, respectivamente. </li></ol></li><li> Análisis estadístico Nota: Los métodos estadísticos exactos dependerán de la pregunta de investigación. Aquí mostramos los métodos utilizados para la prueba de diferencias significativas en los gases en sangre reportados en la Tabla 2. <ol><li> Pon a prueba la distribución normal de datos mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov, seguido de pruebas paramétricas o no paramétricas con ajuste para comparaciones múltiples, según corresponda. </li><li> Use K-means análisis de conglomerados para identificar los fetos en la cohorte que eran espontáneamente hipóxica y determinar los respectivos valores de pO 2 y O 2 Sab (considere pO2 &lt;20 mmHg o O 2 sáb &lt;55% como fetal hipoxia). 44-48 de </li><li> Utilice el software estadístico como SPSS para el análisis. </li><li> Los datos actuales como media ± SD con diferencias estadísticas en p &lt;0,05 consideró significativo. </li></ol></li></ol>

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El anestésico y los procedimientos quirúrgicos se presentan que son necesarios para el establecimiento de un modelo animal para el estudio de la fisiología y la fisiopatología fetal: la oveja fetal no anestesiado instrumentado crónicamente. Cuatro pasos críticos en el protocolo debe hacerse hincapié. En primer lugar, pasar los catéteres y electrodos a través del flanco materna: es importante que esto se hace a la vez para evitar cualquier lesión de órganos internos. En segundo lug...

Una variedad de modelos animales existe para el estudio de ambos embarazos normales y comprometidos, incluyendo roedores de laboratorio, primates no humanos y los rumiantes domésticos. 1,2,3,4,5 El ovejas gestantes instrumentado crónicamente ha sido ampliamente utilizado durante 50 años como un modelo de desarrollo fetal humano y las respuestas a los estímulos fisiopatológicos tales como lipopolisacárido (LPS). 10.06 Las lesiones después de la exposición LPS imitan exactamente lo que se ve en los recién nacidos prematuros con leucomalacia periventricular, que se debe a un perfil de maduración similar de ambas especies. 11, 12 Otras complicaciones del embarazo también se han estudiado con gran detalle, como el descubrimiento de que los glucocorticoides prenatales promueven el desarrollo pulmonar 13-15 y comprender el impacto de la restricción del crecimiento intrauterino (RCIU) en el feto 16,17. El uso extensivo del modelo de oveja fetal se debe a la unique amenability de la oveja fetal no anestesiado a la colocación y el mantenimiento de catéteres y electrodos quirúrgica, lo que permite el muestreo de sangre repetitivo, registro de la actividad bioeléctrica, la aplicación de la estimulación eléctrica y en imágenes del cerebro vivo. 18 de telemetría también es posible, aunque se usa con menos frecuencia sin embargo, debido a la sofisticación más alta para establecer, así como el coste inicial y de mantenimiento. 19 Por otra parte, el modelo de oveja fetal es muy versátil ya que son posibles muchas variaciones de la instrumentación en función de las medidas de interés. Por ejemplo, es posible grabar más de días a semanas señales multivariados en tiempo real tales como los movimientos fetales de respiración, la actividad eléctrica cerebral, respuestas cardiovasculares, electrocardiograma, el flujo sanguíneo regional a una serie de órganos usando sondas de flujo o microesferas, etc. Gracias a esta versatilidad, se han llevado a cabo una amplia gama de estudios que incluye el desarrollo de la cardisistema medades 20,21, (HPA) del eje hipotálamo-pituitario-adrenal 22, el desarrollo del cerebro y el desarrollo de 23 estados del sueño, en particular, de 24 años, los efectos de la hipoxia / asfixia 25, la hipotermia terapéutica 26, inflamación 6-11, combinación de ambos de 27 años, los glucocorticoides 28,29, antidepresivos 30, displasia broncopulmonar (DBP) 31,32, la programación fetal 33,34,35,36,37,38,39 o el desarrollo de modalidades de monitoreo fetal novela antes y durante el parto, por nombrar sólo pocas áreas de investigación. 40,41,42,43 El objetivo general del método presentado es mostrar la aplicación básica de este modelo versátil. Permite establecer una amplia variedad de protocolos experimentales agudos y crónicos que estudian la fisiología y la fisiopatología fetal en el integrador, órgano, los niveles celular y molecular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE Light source</td>
			<td>Schott-Fostec</td>
			<td>A20500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060 - 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006 - 09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003 - 12</td>
			<td>alternating dissecting tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scalpel blades #12</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10012 - 00</td>
			<td>alternating dissecting tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16044 - 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S &#38; T suture tying forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00272 - 13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont SS forceps - angled</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203 - 25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided silk suture size 6-0</td>
			<td>Teleflex Medical</td>
			<td>07 - 30&#160; - 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Tape</td>
			<td>transpore</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride 100 mg/ml</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409 - 2051 - 05</td>
			<td>Final Does is 80 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tranqui Ved Injection (xylazine 100 mg/ml)</td>
			<td>Vecdo</td>
			<td>NDC 50989 - 234 - 11</td>
			<td>Final Does is 10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive orange 14</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R - 8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers Solution Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% Co2, final pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Final Concentration: 118 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217 - 3</td>
			<td>Final Concentration: 4.7 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79 - 500</td>
			<td>Final Concentration: 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P -285</td>
			<td>Final Concentration: 1.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>Jan-00</td>
			<td>Final Concentration: 0.57 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 310 - 500</td>
			<td>Final Concentration: 5.95 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Final Concentration: 5.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifeWindow</td>
			<td>Digicare Biomedical Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CED bioamplifier and ADC units</td>
			<td>Cambridge Electronic Design Limited, 
			Unit 4, Science Park, 
			Milton Road, 
			Cambridge CB4 0FE 
			ENGLAND.</td>
			<td>Bioamp: 1902; ADC: micro1401; Data acquisition software: Spike 2, V7.13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurolog analog signal bioamplifier</td>
			<td>Digitimer Ltd 
			37 Hydeway 
			Welwyn Garden City 
			Hertfordshire, AL7 3BE, England</td>
			<td>NL108A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABL800Flex</td>
			<td>Radiometer Canada; 200 Aberdeen Dr, London, ON N5V 4N2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5804R</td>
			<td>Eppendorf Canada; 2810 Argentia Road, #2 
			Mississauga, Ontario, L5N 8L2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrow Jugular Catheterization Set</td>
			<td>Arrow International, Inc., 2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atravet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazepam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketalar</td>
			<td></td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propofol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SurgiVeT</td>
			<td>Endotracheal Tubes; Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cook Airway Exchange Catheter with RAPI-FIT Adapters</td>
			<td>Cook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispomed Ventilator</td>
			<td>Dispomed Ltd., 745 Nazaire-Laurin, Joliette, Quebec J6E 0L6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte-W</td>
			<td>Becton Dickinson, Infusion Therapy Systems Inc., 9450 S State St, Sandy Utah 84070 USA</td>
			<td></td>
			<td>22 to 20 G; 1 in [0.9 x 25 mm] to 1.16 in [1.1 x 30 mm]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edwards Lifesciences Ref: PX272 Pressure monitoring kit with TruWave Disposable Pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifeWindow LW6000</td>
			<td>Digicare Biomedical Technology 107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaymar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Babcock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl catheters</td>
			<td>SCI (Scientific Commodities Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>2 meters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-0 Vicryl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrocardiogram (ECG)</td>
			<td>LIFYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>four copper electrodes in single sheath, 2 meters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-O Vicryl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Vicryl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDS II USP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim sulfadoxine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Argon Medical, Cat&#160;041220001A</td>
			<td></td>
			<td>Double 4-way Stopcock with male luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Tyco Healthcare 8881202389</td>
			<td></td>
			<td>Monoject aluminum hub blunt needles, 22Gx, 0.7mmx 38.1mm: for fetal arterial and venous catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Tyco Healthcare 8881202322</td>
			<td></td>
			<td>Monoject aluminum hub blunt needles, 16Gx, 1.6mmx38.1mm: for amniotic catheters</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

instrumentation of near-term fetal sheep for multivariate chronic non-anesthetized recordings

The chronically instrumented pregnant sheep has been used as a model of human fetal development and responses to pathophysiologic stimuli such as endotoxins, bacteria, umbilical cord occlusions, hypoxia and various pharmacological treatments. The life-saving clinical practices of glucocorticoid treatment in fetuses at risk of premature birth and the therapeutic hypothermia have been developed in this model. This is due to the unique amenability of the non-anesthetized fetal sheep to the surgical placement and maintenance of catheters and electrodes, allowing repetitive blood sampling, substance injection, recording of bioelectrical activity, application of electric stimulation and in vivo organ imaging. Here we describe the surgical instrumentation procedure required to achieve a stable chronically instrumented non-anesthetized fetal sheep model including characterization of the post-operative recovery from blood gas, metabolic and inflammation standpoints.

38 ovejas con plazos de fecha embarazadas fueron instrumentados a 128 ± 2 días de gestación (DGA, ~ 0,88 gestación, plazo 145 DGA) con arterial, venosa y catéteres amniótico y el electrocardiograma (ECG) electrodos con una técnica estéril bajo anestesia general (tanto oveja y el feto ). En caso de embarazo gemelar feto grande fue elegido en base a la palpación y estimar el diámetro intertemporal; alternativamente, el feto a ser instrumentada puede ser seleccionado al azar para evitar cualquier sesgo potencial ...

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Instrumentation of Near-term Fetal Sheep for Multivariate Chronic Non-anesthetized Recordings

El modelo de oveja fetal no anestesiado instrumentado crónicamente se utiliza para estudiar el desarrollo del feto humano en la salud y la enfermedad, ya que permite la colocación quirúrgica y el mantenimiento de los catéteres y electrodos, muestreo de sangre repetitivo, la inyección de sustancias, registro de la actividad bioeléctrica, y de imágenes in vivo. Se describen los procedimientos necesarios para establecer este modelo.

Instrumentación de Ovejas fetal Cerca plazo para multivariados Grabaciones no anestesiados crónicas

The chronically instrumented pregnant sheep has been used as a model of human fetal development and responses to pathophysiologic stimuli such as ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K vistas.  CHUV, Université de Montréal, St-Hyacinthe, QC.  El modelo de oveja fetal no anestesiado instrumentado crónicamente se utiliza para estudiar el desarrollo del feto humano en la salud y la enfermedad, ya que permite la colocación quirúrgica y el mantenimiento de los catéteres y electrodos, muestreo de sangre repetitivo, la inyección de sustancias, registro de la actividad bioeléctrica, y de imágenes in vivo. Se describen los procedimientos necesarios para establecer este modelo. 

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Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Preparación y cultivo de células precursoras miogénica / mioblastos primarios de músculo esquelético de los seres humanos adultos y envejecidos

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

Grabaciones de parche de sujeción de células enteras de células epiteliales primarias aisladas del epidídimo

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

Infección por el Virus Zika de células madre neurales de cerebro Fetal humano cultivadas para análisis de Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

Intravenosa y Intra-amniótico en el útero el trasplante en el modelo murino

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and painless, and the application is easy, fast, and can be done anywhere, even with mobile devices. During pregnancy, ultrasound imaging is standardly used to closely monitor fetal development. The technique is important to assess intrauterine growth restriction (IUGR), a pregnancy complication with short- and long-term health consequences for both the mother and fetus. Understanding the process of IUGR is indispensable for developing effective therapeutic strategies. 
The ultrasound system used in this manuscript is an ultrasound device produced for the analysis of small animals and can be used in various research fields, including pregnancy research. Here we describe the usage of the system for in vivo analysis of fetuses from natural killer (NK) cell/mast cell (MC)-deficient mothers that give birth to growth-restricted pups. The protocol includes preparation of the system, handling of the mice before and during measurements, and the usage of the B-mode, color doppler mode, and pulse-wave doppler mode. Fetal size, placental size, and blood supply to the fetus were analyzed. We found reduced implantation sizes and smaller placentas in NK/MC-deficient mice from mid-gestation onwards. In addition, MC/NK-deficiency was associated with absent and reversed end diastolic flow in the fetal Arteria umbilicalis(UmA) and an elevated resistance index. The methods described in the protocol can easily be used for related and non-related research topics.

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Here we describe the technique of high frequency ultrasound for in vivo analysis of fetuses in mice. This method allows the follow-up of fetuses and the analysis of placental parameters as well as maternal and fetal blood flow throughout pregnancy.

Ultrasonido de alta frecuencia para el análisis del desarrollo Fetal y placentario en Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy human bones makes particularly valuable the use of mammalian models, such as mouse and rat, to look into different aspects of bone growth and homeostasis. Additionally, the development of sophisticated genetic tools in mice allows more complex studies of long bone growth and asks for an expansion of techniques used to study bone growth. Here, we present a detailed protocol for ex vivo murine bone culture, which allows the study of bone and cartilage in a tightly controlled manner while recapitulating most of the in vivo process. The method described allows the culture of a range of bones, including tibia, femur, and metatarsal bones, but we have focused mainly on tibial culture here. Moreover, it can be used in combination with other techniques, such as time-lapse live imaging or drug treatment.

Here, we present a method for ex vivo culture of long murine bones at both fetal and newborn stages, suitable for analyzing bone and cartilage development and homeostasis in controlled conditions while recapitulating the in vivo process.

Cultivo y medición de huesos largos del feto y del recién nacido murino

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

Transición recapitulante de lechón a destete In Vitro usando organoides intestinales fetales

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). Following TO, retention of the secreted epithelial fluid increases luminal pressure and induces lung growth. Various animal models have been defined to understand the pathophysiology of CDH and TO. All have their own advantages and disadvantages such as the difficulty of the technique, the size of the animal, cost, high mortality rates, and the availability of genetic tools. Herein, a novel transuterine model of murine fetal TO is described. Pregnant mice were anesthetized, and the uterus exposed via a midline laparotomy. The trachea of selected fetuses were ligated with a single transuterine suture placed behind the trachea, one carotid artery, and one jugular vein. The dam was closed and allowed to recover. Fetuses were collected just before parturition. Lung to body weight ratio in TO fetuses was higher than that in control fetuses. This model provides researchers with a new tool to study the impact of both TO and increased luminal pressure on lung development.

Various animal models of congenital diaphragmatic hernia and fetal tracheal occlusion present advantages and disadvantages regarding ethical issues, cost, surgical difficulty, size, survival rates, and availability of genetic tools. This model provides a new tool to study the impact of both tracheal occlusion and increased luminal pressure on lung development.

Modelo de oclusión traqueal fetal transuterina en ratones

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). ...

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily obtained from a slaughterhouse. Adult ovaries always bear several antral follicles, while in pre-pubertal donors the maximal numbers of oocytes are available at 4 weeks of age, when ovaries bear peak numbers of antral follicles. Thus, 4 weeks old lambs are considered good donors, even if the developmental competence of prepubertal oocytes is lower compared to their adult counterpart. 
Basic research and commercial applications would be boosted by the possibility of successfully cryopreserving vitrified oocytes obtained from both adult and prepubertal donors. The vitrification of oocyte collected from prepubertal donors would also allow shortening the generation interval and thus increasing the genetic gain in breeding programs. However, the loss of developmental potential after cryopreservation makes mammalian oocytes probably one of the most difficult cell types to cryopreserve. Among the available cryopreservation techniques, vitrification is widely applied to animal and human oocytes. Despite recent advancements in the technique, exposures to high concentrations of cryoprotective agents as well as chilling injury and osmotic stress still induce several structural and molecular alterations and reduce the developmental potential of mammalian oocytes. Here, we describe a protocol for the vitrification of sheep oocytes collected from juvenile and adult donors and matured in vitro prior to cryopreservation. The protocol includes all the procedures from oocyte in vitro maturation to vitrification, warming and post-warming incubation period. Oocytes vitrified at the MII stage can indeed be fertilized following warming, but they need extra time prior to fertilization to restore damage due to cryopreservation procedures and to increase their developmental potential. Thus, post-warming culture conditions and timing are crucial steps for the restoration of oocyte developmental potential, especially when oocyte are collected from juvenile donors.

The protocol aims at providing a standard method for the vitrification of adult and juvenile sheep oocytes. It includes all the steps from the preparation of the in vitro maturation media to the post-warming culture. Oocytes are vitrified at the MII stage using Cryotop to ensure the minimum essential volume.

Vitrificación De Ovocitos Maduros In Vitro Recogidos De Ovarios Adultos Y Prepúrromos En Ovejas

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...