Este método adapta el protocolo de cultivo metatarsiano a huesos más grandes, permitiendo combinar la manipulación ósea directa con modelos genéticos complejos para abordar procesos relacionados con el desarrollo óseo. Esta técnica permite la manipulación y el análisis del crecimiento óseo que no son posibles in vivo, como imágenes en vivo o manipulación física y farmacológica directa. Este método de cultivo ex vivo permite el estudio específico de los efectos locales de la inserción genética en el hueso separándolo del efecto sistémico que el tratamiento tiene sobre el organismo.
Comience esterilizando la región abdominal de un día gestacional embarazada 14.5 a 18.5 ratón con 80%etanol y usando tijeras pequeñas para abrir la piel y los músculos abdominales para acceder a los cuernos uterinos. Para extraer el útero de la cavidad abdominal, retire el mesometrio y corte la base de los cuernos. Luego, transfiera el útero a un plato de petri de 60 milímetros que contenga un medio de disección helada sobre hielo.
En un gabinete de bioseguridad cortar entre los sacos con tijeras para separar los fetos individuales, y transferir un saco individual en un nuevo plato de 60 milímetros con medio de disección fresca bajo un microscopio estereo de disección. Utilice pinzas para separar los fetos de las placentas y para limpiar los fetos de las membranas. Utilice una pipeta de plástico recortada para transferir el cuerpo a una nueva placa de 60 milímetros, y decapitar el embrión antes de una disección adicional.
Luego usa pinzas para quitar la piel, comenzando por la espalda y despegando hasta los dedos de los dedos de los dedos. Utilice las pinzas para cortar cerca de la columna vertebral y separar las extremidades posteriores del cuerpo. Transfiera las extremidades posteriores a un plato limpio que contenga un medio de disección helada e inserte las pinzas entre el cartílago superficial del fémur distal y la tibia proximal para separar la tibia del fémur.
Retire los huesos de la cadera del fémur proximal y del hueso calcáneo y del peroné de la tibia. Cortar y tirar con cuidado de los tejidos blandos de los fémures y tibias y utilizar una pipeta estéril de un mililitro para transferir los cuatro huesos de las piernas en el primer poero de una placa de 24 pocillos que contiene un medio de disección fresca. Es importante mostrar que se extrae el tejido blando que conecta el pulso del hueso.
De lo contrario, el hueso se doblará y no logrará un crecimiento adecuado. Cuando los huesos han sido diseccionados del número experimental apropiado de fetos, imagine los huesos de cada pozo a veces cero bajo un microscopio de luz con un buen contraste y reemplace el medio de disección en cada pozo con un mililitro de medio de cultivo por bien teniendo cuidado de no aspirar los huesos. Para observar el efecto de la inhibición del crecimiento en las condiciones de cultivo, tratar las tibias izquierdas con 500 ácido retinoico nanomolar e incubar las tibias derechas con un volumen equivalente de vehículo como control.
A continuación, coloque la placa en una incubadora de cultivo celular en condiciones de cultivo celular estándar. Después de dos días, tratar los huesos con un análogo de timidina apropiado durante una o dos horas para evaluar la proliferación de células óseas antes de transferir los huesos a tubos individuales de dos mililitros de 4%paraformaldehído durante 10 minutos. Luego, transfiera los huesos a PBS para obtener una imagen de los huesos en el punto de tiempo final antes de devolver las muestras al paraformaldehído para la fijación durante la noche a cuatro grados centígrados.
Para medir la longitud y la región mineralizada de los huesos, abra un programa de software de imágenes adecuado y, teniendo en cuenta la escala de la imagen, mida tanto la longitud total del hueso como la región mineralizada. Comenzando las mediciones desde las primeras celdas oscuras en un extremo hasta las últimas celdas oscuras en el otro extremo. Para calcular la tasa de crecimiento que se define como el aumento medio de la longitud por día, divida la diferencia entre la longitud final del hueso y la longitud inicial por el número de días en cultivo.
Aquí, se muestra una comparación entre la tibia cultivada y la tibia recién extraída en etapas equivalentes. Después de hasta dos días de cultivo, el tamaño alcanzado es comparable al crecimiento óseo in vivo tanto para el cartílago como para el hueso mineralizado. Los períodos de cultivo más largos conducen a mayores diferencias entre los huesos cultivados y los huesos recién extraídos.
Tenga en cuenta, la tibia cultivada con una eliminación incompleta del tejido blando puede resultar en la flexión de la tibia cultivada. El tratamiento con ácido retinoico tiene un efecto robusto en el crecimiento tibial ya después de dos días de tratamiento. Aunque hay un aumento constante en la longitud total de la tibia después de dos días en el cultivo, este crecimiento corresponde a un aumento aproximado de sólo nueve a 29% desde la longitud inicial.
Menos que el aumento del crecimiento óseo que se observaría in vivo. De hecho, el etiquetado analógico de timidina muestra menos células positivas en esta región después del cultivo en comparación con los huesos recién extraídos de una etapa equivalente. Además, en la tibia cultivada in vitro, la longitud total del elemento esquelético aumenta sustancialmente, mientras que casi no se observa ningún aumento en la región mineralizada.
Además del análisis histológico y molecular, la limpieza y la imagen 3D se pueden realizar después del cultivo para caracterizar el efecto celular de los tratamientos aplicados a los huesos cultivados. La técnica nos permite abordar cuestiones relacionadas con la comunicación interorgan. Por ejemplo, mediante el co-cultivo de huesos de los diferentes modelos genéticos en algún tipo de experimento de parabiosis sin dolor.
