The authors have no acknowledgements.

NOTA: Todos los procedimientos que implican el uso de animales se llevan a cabo de acuerdo con la legislación local. Nuestro trabajo es aprobado por el Distrito de Salud del Comité de Protección de los Animales Sydney Local. Los procedimientos permitidos se describen en la documentación de la licencia del proyecto y siguen las pautas que aseguren el bienestar de los animales en todo momento. Garantizar el cumplimiento de la legislación sobre la experimentación animal del país donde se realiza el trabajo. 1. Protocolo para la preparación de EM fijador <ol><li> Para 100 ml de fijador, de paraformaldehído preparar mediante la adición de 2 g de polvo de paraformaldehído a 25 ml de agua destilada en un matraz cónico, calentar a 65 ºC, revolviendo constantemente con un agitador magnético. NOTA: El glutaraldehído, paraformaldehído y tampón cacodilato de sodio son todas las sustancias peligrosas y siempre deben ser manejados en campana de humos. </li><li> Se calienta a 65 ° C durante 2 minutos, dejar enfriar. Si es necesario, agregar una solución de hidróxido de sodio dropwise mientras se agita para despejar solución completamente. NOTA: hidróxido de sodio es peligroso, manejar con cuidado. </li><li> Añadir 10 ml de EM de grado social glutaraldehído, 50 ml de tampón cacodilato 0,2 M de sodio y 2 g de sacarosa y remover con un agitador magnético. Añadir 2 ml de 1,0 M de CaCl2. </li><li> Ajustar el pH a 7,4 antes de hacer la solución hasta 100 ml con agua destilada. El fijador final contiene 2,5% de glutaraldehído, 2% de paraformaldehído, 2 mmol CaCl 2, 2% de sacarosa en tampón cacodilato 0,1 M. Asegúrese de que la osmolalidad total es de 440 mOsmol / l. Utilizar dentro de las 24 horas de preparación. </li></ol> 2. Fijación de perfusión hepática <ol><li> Tampón de perfusión Cálido y fijador a 35-37 ºC. La temperatura correcta de la memoria intermedia de la exanguinación y fijador ayuda a asegurar la integridad del tejido. </li><li> Anestesiar al animal con una sola inyección intraperitoneal de 50 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina. </li><li> Una vez que el animal es bajoanestesia profunda, evaluada por la retirada de las extremidades posteriores y de pinzamiento del rabo, una incisión en Y se hace con extremos romos tijeras en el abdomen del animal para exponer la vena hepática y portal. NOTA: Asegúrese de que el equipo esté limpia para evitar la contaminación de las muestras con microorganismos y restos general que se verán fácilmente en SEM. </li><li> Atar dos suturas muy sueltos alrededor de la vena portal uno proximal al hígado, el otro más distalmente al hígado. </li><li> Canular la vena porta con una cánula de tamaño apropiado IV (18 G para las ratas, 22 G para los ratones) .Apriete suturas para asegurar cánula. </li><li> Comenzar la perfusión con solución salina tamponada con fosfato se calentó a 37 ºC, y a una presión de 10 cm de H 2 0. Entre 5 y 20 ml de PBS se requiere generalmente para Exsanguinate el hígado. NOTA: Por favor no permita que las burbujas de aire que entran en el hígado a través de los tubos conectados a la cánula ya que inducen artefactos secundarios a la embolización y la presión; El daño a los hepatocitos, sinusoids y fenestraciones CESH ocurre si la presión de perfusión es demasiado alto. </li><li> Cortar la vena cava abdominal y torácica para permitir que el tampón para salir libremente desde el hígado. Esto evita daños alta contrapresión a LSECs. </li><li> Una vez que el hígado es libre de sangre, reemplace PBS con fijador EM y perfundir durante aproximadamente 5 minutos, hasta que el hígado se endurece y muy pálido. </li><li> Suspender la perfusión y cortar el hígado fija en 1 - 2 mm 3 bloques con un bisturí afilado. </li><li> Tejido post-fix en EM fijador durante 24 a 72 horas a 4 ºC. NOTA: En general, underfixation causa más artefactos que overfixation. </li><li> Cambie fijador siguiente período post-fix a 0,1 M tampón cacodilato de sodio para el almacenamiento a 4 ºC. NOTA: Las muestras almacenadas de esta manera se conservarán durante un período significativo de tiempo (hasta 12 meses), la fijación secundaria sin embargo oportuno y se recomienda un examen para obtener mejores resultados. </li></ol> 3. Aguja Perfusion NOTA: la fijación de la aguja es una variante de la fijación de perfusión que implica la inyección de fijador directamente en el tejido de hígado biopsia. El objetivo es que el fijador a ser lavada a través de los vasos sanguíneos con el fin de Exsanguinate ellas y exponer todo el bloque de tejido de fijador. Se debe tener cuidado para mantener la presión de inyección de baja presión para evitar lesiones 18,19. <ol><li> Retirar un pequeño trozo de hígado del animal o sujeto y enjuague con solución salina para eliminar la sangre y escombros. </li><li> Dibuje la solución salina normal en jeringa equipada con una aguja de calibre fino (normalmente una jeringa de insulina). </li><li> Se inyecta la solución salina muy lentamente en el hígado hasta que la sangre se vacía fuera del tejido. Se pueden requerir múltiples inyecciones. </li><li> Dibuje el fijador EM en otra jeringa equipada con una aguja de calibre fino (típicamente una jeringa de insulina). </li><li> Inyectar el fijador muy lentamente en el hígado hasta que se vuelve dura y de color canela. Inyección múltiples puede ser necesaria. </li><li> Cortar el hígado fija en 1 - 2 mm 3 bloques con un bisturí afilado. Incubar en fijador EM de 24 a 72 horas 4 ° C. Lavar 3 veces en tampón cacodilato de sodio 0,1 M antes de comenzar la fijación secundaria. </li></ol> 4. Preparación para Microscopía Electrónica de Barrido <ol><li> Lavar la muestra 3 veces en tampón cacodilato 0,1 M de sodio. Para solucionar los lípidos, puesto fijar la muestra en el 2% de tetróxido de osmio en tampón cacodilato sódico 0,1 M durante 2 horas. NOTA: Completa el lavado es muy importante como cruz glutaraldehido y tetróxido de osmio reaccionan y generan artefactos en SEM. </li><li> Enjuagar las muestras en concentraciones crecientes de etanol para iniciar la deshidratación. En primer enjuague en etanol al 50% durante 5 minutos; luego 3 veces durante 5 min con etanol al 70%; enjuagar 3 veces durante 5 min con etanol al 90%; enjuague 2 veces durante 5 min en etanol al 100%; y finalmente enjuague 2 veces durante 10 min en etanol 100% (tamiz molecular). </li><li> Retire todo el etanol a partir de las muestras<html> y reemplazar con hexametildisilazano (HMDS) en campana de humos y dejar actuar durante 10 minutos. Retire HMDS de las muestras de tejido y dejar que se evapore. NOTA: HMDS es altamente higroscópico en frío, por lo tanto permitirá alcanzar RT antes de utilizar para la etapa de deshidratación final. </li><li> Opcionalmente, montar las muestras inmediatamente o colocarlos en un desecador hasta el momento de montar para SEM. </li></ol> 5. Montaje NOTA: montaje de muestras correcta maximizará el número de sinusoides claramente delineadas disponibles para el análisis bajo SEM. <ol><li> Etiquetar la base de los metales talones de SEM y aplique cinta de carbón conductor de doble cara a la parte superior de los talones. </li><li> Visualizar las muestras usando un microscopio de disección para identificar la superficie con las mejores sinusoides para su posterior SEM. Coloque la superficie hacia arriba sobre la superficie de la cinta de carbono del trozo. </li><li> Especímenes palillo firmemente el talón, las muestras ya están listos para el recubrimiento por pulverización catódica. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Recubrimiento NOTA: El recubrimiento de la muestra con una fina película de metal conductor (oro o platino) en unos terrenos revestidor de bombardeo iónico el espécimen y lo protege de los daños causados ​​por el haz de electrones. Si el revestimiento es demasiado gruesas estructuras de interés pueden ser oscurecidos. <ol><li> Colocar los trozos en la cámara de vacío del aparato de revestimiento por pulverización catódica automática fina, el modo de rotación y recubrimiento por pulverización catódica automática establecen durante 45 segundos. Utilice revestimiento de platino para más fina que detalla, sin embargo oro también es adecuado. </li><li> Aplicar una capa fina de pintura de carbono a las superficies externas de las muestras de hígado montados, teniendo cuidado de no recubrir las superficies sinusoidales. </li><li> Una vez que las muestras están recubiertos con platino y la pintura se ha secado de carbono que están listos para la observación en la SEM. Las muestras se pueden almacenar en un desecador. </li></ol> 7. Uso del microscopio electrónico de barrido <ol><li> Lugar especímenes en el microscopio electrónico de barrido y volver microscopio para vacío. &lt;/ Li&gt; <li> El uso de procedimientos operativos microscopio estándar para la visualización de las muestras por comenzar con una ampliación baja, aumentando gradualmente la ampliación. </li><li> Asegúrese de que el microscopio se ajusta adecuadamente para trabajar a distancia, tamaño de punto y el astigmatismo. </li><li> Compruebe la integridad de la fijación. Si el CESH es sobre todo libre de huecos y contiene fenestraciones de medición 30-250 nm de diámetro por regla general, indicaría que la preparación de muestras ha sido un éxito. </li><li> Si los sinusoides están llenas de lagunas o carente de fenestraciones la preparación de la muestra no ha tenido éxito o no hay patología significativa. En este caso, cortar la muestra con una cuchilla de afeitar muy fino, y recubrir las superficies de corte y se analizaron para sinusoides fijos con éxito. </li><li> Aproximadamente a las 15.000-20.000 × magnificación seleccionar superficies planas CESH que están libres de escombros con una buena fijación y donde las fenestraciones son claramente visibles (que contiene típicamente al menos 10 fenestraciones). </li><li> Guardar imágenes de al menos 10 por sinusoides del hígado, de diferentes áreas de los bloques, utilizando al menos dos bloques por el hígado. Muestreo 10 micrografías a 15.000 - 20.000 × magnificación por animal es generalmente suficiente para la cuantificación de fenestraciones sea representativo de todo el hígado. </li></ol> 8. Análisis NOTA: El software ImageJ que se puede descargar gratis desde el NIH se utiliza para cuantificar diámetro fenestración y frecuencia ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij">www.imagej.nih.gov/ij</a> ). <ol><li> Abrir imagen J y establecer la escala utilizando la barra de escala incrustado en la imagen (Screen shot 1). </li><li> Con la herramienta polígono en ImageJ, vestigios alrededor de toda la zona plana de la CESH incluyendo áreas fenestradas y defenestrado. No se limite a rastrear las placas de tamiz ya que esto falsamente inflar porosidad. Excluir cualquier grandes piezas de desechos que se encuentran en la superficie celular que podrían ser Obscuriofenestraciones NG. </li><li> Para medir el diámetro fenestración, trazar una línea a través del diámetro más largo de cada fenestración mediante la selección de la herramienta de línea, y presione &quot;m&quot; para medir la línea, y &quot;d&quot; (empate) para dibujar de forma permanente la línea en la imagen. Esta línea se define como el diámetro de la fenestración. La longitud de la línea estará disponible en el cuadro de resultados de ImageJ (Screen shot 2). </li><li> Mida todos los huecos que son agujeros más grandes en el citoplasma CESH más de 250 nm, así como fenestraciones. Las lagunas son a menudo objetos que reflejan mala perfusión o fijación, sin embargo lagunas también pueden ocurrir como resultado de la enfermedad y la toxicidad. Los datos de las lagunas será excluido de cálculo de los parámetros del hueco más adelante en el análisis. </li><li> La zona de las lagunas que no son circulares debe calcularse mediante el trazado alrededor de las lagunas y el cálculo de su área en ImageJ. </li><li> Pegue los datos del cuadro de resultados en ImageJ en una hoja de cálculo Excel para furtheanálisis r. </li></ol> 9. Cálculos <ol><li> Promedio fenestración diámetro = promedio de todos los diámetros de fenestración (sin incluir las lagunas, donde las brechas son ≥ 250 nm). </li><li> Área Fenestración = πr 2, donde r, el radio, se calcula a partir del diámetro fenestraciones individuo (r = d / 2), sin incluir huecos. </li><li> Porosidad (%) = (Σ (πr 2) / área total analizada - Σ (área de huecos =)) (m 2)) × 100. </li><li> Frecuencia Fenestration = número total de fenestraciones / (área total analizada-Σ (área de las lagunas) (m 2). </li></ol> 10. Presentación de Fenestration datos NOTA: Siempre que sea posible, las publicaciones, incluyendo la cuantificación de los datos de fenestración deben incluir la siguiente información <ol><li> Diámetro Fenestration, con una declaración confirmando lo diámetros de frontera donde se utilizan para definir fenestraciones (típicamenteentre 50 a 250 nm), la frecuencia fenestración (número / m 2) y la porosidad (%). </li><li> Una declaración que confirme si las brechas se han incluido en el análisis, gráfico de distribución de frecuencia de diámetro fenestración y el número de hígados, bloques, imágenes y fenestraciones debe incluirse en el análisis. </li></ol>

<ol>
	<li>Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., Arias, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Liver: Biology and Pathobiology. , 387-404 (2009).</li><li>Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+and+the+liver+sieve:+the+role+of+fenestrated+sinusoidal+endothelium+in+lipoprotein+metabolism,+atherosclerosis,+and+cirrhosis.">Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis.</a> Hepatology. 21, 863-874 (1995).</li><li>Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+sieve:+considerations+concerning+the+structure+and+function+of+endothelial+fenestrae,+the+sinusoidal+wall+and+the+space+of+Disse.">The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse.</a> Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).</li><li>Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+feeding+and+fasting+on+fenestrations+in+the+liver+sinusoidal+endothelial+cell.">The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell.</a> Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+serotonin+receptor-2B+rescues+small-for-size+liver+graft+failure+in+mice.">Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice.</a> Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).</li><li>Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Loss+of+Responsiveness+to+2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine+in+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells.">Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).</li><li>Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+age+is+associated+with+ultrastructural+changes+in+isolated+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).</li><li>Le Couteur, D. G., Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calorie Restriction, Aging and Longevity. , 191-216 (2010).</li><li>McLean, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+pseudocapillarization+of+the+human+liver.">Age-related pseudocapillarization of the human liver.</a> J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).</li><li>Le Couteur, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudocapillarization+and+associated+energy+limitation+in+the+aged+rat+liver.">Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver.</a> Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+acute+oxidative+stress+on+the+ultrastructure+of+the+perfused+rat+liver.">The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver.</a> Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).</li><li>Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcoholic+liver+injury:+defenestration+in+noncirrhotic+livers-a+scanning+electron+microscopic+study.">Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study.</a> Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).</li><li>Jamieson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+liver+sinusoidal+endothelium+in+a+baboon+model+of+type+1+diabetes.">Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).</li><li>Fraser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+perfusion+pressure+damages+the+sieving+ability+of+sinusoidal+endothelium+in+rat+livers.">High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers.</a> Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).</li><li>Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electron+microscopic+study+of+the+fenestrated+endothelial+lining+of+rat+liver+sinusoids.">An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids.</a> J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).</li><li>Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+characterization+of+the+endothelial+cell+in+the+rat+liver+sinusoid+under+normal+and+various+experimental+conditions,+as+a+contribution+to+the+distinction+between+endothelial+and+Kupffer+cells.">An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells.</a> J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).</li><li>Fahimi, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+and+immersion+fixation+of+rat+liver+with+glutaraldehyde.">Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde.</a> Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).</li><li>Wisse, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+electron+microscopy+of+human+and+other+liver.">Fixation methods for electron microscopy of human and other liver.</a> World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).</li><li>Vreuls, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jet-fixation:+a+novel+method+to+improve+microscopy+of+human+liver+needle+biopsies.">Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies.</a> Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).</li><li>Furrer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+reverts+age-related+capillarization+and+failure+of+regeneration+in+the+liver+through+a+VEGF-dependent+pathway.">Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OxLDL+induced+injury+and+defenestration+of+HLSECs+via+LOX-1.">OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1.</a> J Mol Endocrinol. , (2014).</li><li>May, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+model+for+conditional+induction+and+rescue+of+portal+hypertension+reveals+a+role+of+VEGF-mediated+regulation+of+sinusoidal+fenestrations.">A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations.</a> PLoS One. 6 (7), e21478 (2011).</li><li>Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+can+act+as+vascular+permeability+factor+in+the+hepatic+sinusoids+through+upregulation+of+porosity+of+endothelial+cells.">VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).</li><li>Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD47-binding+peptide+of+thrombospondin-1+induces+defenestration+of+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells.</a> Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).</li><li>Wack, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+ultrastructure+evaluated+during+the+revascularization+of+regenerating+rat+liver.">Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver.</a> Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).</li><li>Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sinusoidal+wall+permeability+and+liver+fatty+change+after+two-thirds+hepatectomy:+An+ultrastructural+study+in+the+rat.">Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat.</a> Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).</li><li>Straub, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic-stimulated+liver+sinusoidal+capillarization+in+mice+requires+NADPH+oxidase&#8211;generated+superoxide.">Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase&#8211;generated superoxide.</a> J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).</li><li>Barber&#225;-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+endothelial+cells+of+developing+rat+liver+in+the+transition+from+fetal+to+postnatal+life.">Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life.</a> JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).</li><li>Jamieson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caloric+restriction+reduces+age-related+pseudocapillarization+of+the+hepatic+sinusoid.">Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid.</a> Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperlipidemia+and+surfactants:+the+liver+sieve+is+a+link.">Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link.</a> Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+oxidative+stress+on+the+liver+sieve.">The effects of oxidative stress on the liver sieve.</a> J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells.">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li><li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy.">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La capacidad de medir con precisión y de manera reproducible el estado del hígado endotelio sinusoidal es un paso importante en la comprensión de la biología de estas células altamente especializadas. Las nuevas técnicas como la microscopía iluminación estructurada 32, microscopía de fuerza atómica y 33 d-STORM (estocástico óptica directa reconstrución Microscopy) 34 impartirán información importante sobre la morfología de estas células in vitro, pero SEM sigue ...

Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSECs) son altamente células endoteliales diferenciadas que recubren la pared de la sinusoide hepático. LSECs están perforadas con fenestraciones que no son diaphragmed, transcelular poros de 50-250 nm de diámetro. Hasta el 20% de la superficie de LSECs está cubierto por fenestraciones, que son por lo general en grupos de decenas a cientos llamadas placas de tamiz 1-3 (Figura 1). Fenestraciones permiten la transferencia de plasma y nanosubstrates entre la sangre y los hepatocitos, la creación de un sistema de ultrafiltración altamente eficiente. Fenestraciones son estructuras dinámicas - tanto por su tamaño y / o el número puede ser alterado en respuesta a diversos estados fisiológicos, las drogas y las enfermedades. Por ejemplo, fenestraciones son más grandes en el ayunas que en el estado alimentado 4; 2-di-iodoamphetamine aumenta número fenestración; 5,6 y una reducción en el tamaño y número de fenestraciones por célula se produce en el envejecimiento y muchos estados de enfermedad 7-13 </sup&gt;. La medida exacta del tamaño y número de fenestraciones es importante para la comprensión de cómo las CESH morfología está influenciada por diversas enfermedades, tóxicas, y los estados fisiológicos; su impacto en la función hepática; y para el desarrollo de la fenestración de modulación de las intervenciones terapéuticas 1. El estudio de fenestraciones es difícil. El diámetro de fenestraciones se encuentra por debajo de la resolución de la microscopía de luz convencional, por lo que antes sólo la observación mediante microscopía electrónica tanto en tejido hepático o cultivadas LSECs intactas ha sido posible. El microscopio electrónico de barrido (SEM) con más frecuencia ha sido utilizado para estudiar el tamaño de la fenestración, la frecuencia y la porosidad (el porcentaje de membrana CESH que está perforada por fenestraciones) porque SEM permite la observación de grandes áreas de la superficie endotelial y la medición de miles, si no decenas de miles de fenestraciones. A pesar de su utilidad, los resultados que se informan de los estudios SEM-basados ​​paraCESH parámetros tales como el tamaño fenestración, número, la frecuencia y la porosidad varían ampliamente en la literatura (Tabla 1). Fenestraciones y placas de tamiz son estructuras frágiles que contrato, rompen, dilatan o se unen durante la preparación de la muestra, se requiere procesamiento tanto cuidado para preservar su integridad. La presión de perfusión elevada 14; osmolaridad incorrecta del fijador y tampones de 15; fijación inadecuada o la fijación del tiempo; y la velocidad de deshidratación post-fijación y secado son todas las áreas de procesamiento para SEM que pueden producir artefactos que interfieren con la preservación de la ultraestructura (Figura 2). Pérdida de fenestraciones (&#39;defenestration&#39;) y la contracción fenestración puede ocurrir como resultado de una mala fijación, lo que resulta en una reducción de diámetro fenestración y la porosidad de la célula. Métodos para mejorar la conservación de muestras para el análisis SEM se han descrito anteriormente 15-17 y se discuteaquí con consejos adicionales sobre cómo mejorar la conservación de muestras. Los principales objetivos de la conservación de muestras son para eliminar la sangre de los sinusoides de modo que la superficie de la CESH puede ser visualizada y para evitar daños CESH de cualquiera alta presión o retrasada de fijación. La perfusión del hígado entero de fijador a través de la vena portal es el método preferido para la fijación de hígado. Como se describe en detalle en otra parte 16,18 perfusión debe llevarse a cabo a baja presión (por ejemplo 10 cm de H 2 0) para evitar artefactos relacionados con la presión de perfusión-y el daño al CESH, típicamente manifiestan como grandes lagunas dentro de la membrana celular. Sin embargo, la fijación razonable a menudo se puede obtener usando la perfusión de la aguja de biopsias de hígado de seres humanos y animales, como se describe en detalle en otra parte 19. Esta técnica consiste en inyectar directamente fijador en el tejido hasta que la sangre es expulsado de la muestra y el tejido es firme y fija. Fijación de muestras para microscopía electrónica necesita ser perfORMED lo más rápidamente posible después del cese del flujo sanguíneo para evitar cambios ultraestructurales que ocurren como resultado de los hígados procesos autolíticos extremadamente rápidos. También presentamos un método de análisis de imagen que minimiza la inclusión de artefactos, y normaliza la medición de fenestraciones. La variación en la selección de sinusoides para micrografías, análisis de imágenes de artefactos, y la medición de área de la célula para la porosidad y la fenestración frecuencia han dado lugar a grandes discrepancias en los resultados publicados. Un enfoque estandarizado para la evaluación y medición de fenestraciones y los requisitos mínimos para la presentación de los datos no se han abordado con claridad en la literatura previamente 4,10,20-31.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Name of material</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:93px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:311px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">EM grade Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:93px;">C001</td>
			<td style="width:311px;">Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:311px;">Always prepare Paraformaldehyde fresh</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:155px;">Sodium Cacodylate powder</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">C0250</td>
			<td style="width:311px;">Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:155px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">C1016</td>
			<td style="width:311px;">Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:155px;">Osmium tretroxide</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:93px;">C011</td>
			<td style="width:311px;">Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Ethanol- Absolute</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>459836&#160;</td>
			<td style="width:311px;">100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Other grades of Ethanol</td>
			<td style="width:100px;">Labtech</td>
			<td style="width:93px;">EL5</td>
			<td style="width:311px;">Prepare graded Ethanols with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Hexamethyldisilazane</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>52619&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Allow to reach room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:155px;">Cannulas</td>
			<td style="width:100px;">Terumo</td>
			<td style="width:93px;">TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C</td>
			<td style="width:311px;">18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Conductive Carbon tape</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td>IA0201</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Carbon Paint</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td>I003</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Ketamine</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:311px;">Must be optained under licence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Xylazine</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:311px;">Must be obtained under licence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Molecular Sieve</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">208647</td>
			<td style="width:311px;">Removes water from the 100 % Ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized method for the analysis of liver sinusoidal endothelial cells and their fenestrations by scanning electron microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

Visualización inicial a bajo aumento por microscopía electrónica de barrido revela una superficie plana de la muestra de hígado con un área expuesta suficientemente grande como para observar muchas grandes vasos hepáticos y sinusoides (Figura 1A). Asegurar la colocación de bloques de hígado correcta en el talón de montaje es esencial para la obtención de imágenes claras de los sinusoides y la cápsula de Glisson del hígado se debe evitar por este motivo (Figura 1B). El aumen...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Un método estandarizado para el análisis de las células del hígado sinusoidal endoteliales y sus Fenestraciones por Microscopía Electrónica de Barrido

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

a-standardized-method-for-analysis-liver-sinusoidal-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K vistas.  University of Sydney and Concord Hospital. The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Video: A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Investigación

Biología

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

El estudio de la Organización Supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-Freeze por Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Escaneado de Protocolos de Microscopía Electrónica (SEM) para la Problemática de la planta, Oomycete, y muestras de hongos

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

Preparación de los organismos procarióticos y eucarióticos con secado químico para análisis morfológico en microscopía electrónica de barrido (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

Flujo de trabajo de tomografía de matriz para la adquisición dirigida de información de volumen mediante microscopía electrónica de barrido

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

Microscopía Electrónica De Barrido Bloque-Cara Serial (SBF-SEM) De Muestras De Tejido Biológico

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...