Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud otorga 1K22AI097291-01 y por el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación de los Institutos Nacionales de la Salud con el Número Premio UL1TR000433. También reconocemos Prof. Darrell Irvine en el MIT y profesor Matthias Stephan en el Centro del Cáncer Fred Hutchinson por su contribución en el trabajo inicial sobre las nanopartículas de vacunas y ratones transgénicos OT-I / Luc.

Todos los experimentos descritos en este protocolo fue aprobado por el Comité Universitario de Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA) de la Universidad de Michigan y realizaron de acuerdo con las políticas y directrices establecidas. 1. Síntesis y caracterización de ICMVs Co-cargado con proteína de antígeno y adyuvante Moléculas <ol><li> Mezclar 1: 1 relación molar de 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3-fosfocolina (DOPC) y 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butiramida] (MPB) en cloroformo, manteniendo la cantidad total de lípidos en 1,26 mol por lotes (es decir, 500 g de DOPC y 630 g de MPB) en un vial de vidrio de 20 ml (diámetro = 28 mm y la altura = 61 mm). </li><li> Añadir fármacos lipófilos, como monofosforil lípido A (MPLA), o colorantes lipófilos (por ejemplo, DiD), a la solución de los lípidos en la concentración deseada. Eliminar completamente el disolvente orgánico purgando con nitroge extra secon gas y la colocación de las muestras al vacío O / N. </li><li> Hidratar la película lipídica mediante la adición de 200 l de 10 mM de propano bis-tris (BTP, pH 7,0) que contiene fármacos solubles en agua (por ejemplo, antígenos de proteína). Vortex durante 10 s cada 10 min durante 1 hora a RT. </li><li> Transferir el contenido del frasco de vidrio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, colocar las muestras en un baño de agua helada, y sonicar continuamente durante 5 min usando la intensidad del 40% en un ajuste / 20 kHz sonicador de sonda de punta de 125 W. </li><li> Añadir 4 l de ditiotreitol 150 mM (DTT) a cada lote (trabajando concentración 2,4 mM), vórtice, y centrifugar brevemente utilizando una microcentrífuga de mesa. </li><li> Añadir 40 l de 200 mM CaCl 2 y mezclar con la pipeta (trabajando concentración 33 mM). Incubar las muestras a 37 ° C durante 1 hora para permitir la reticulación de MPB-que contiene capas de lípidos con DTT. </li><li> Centrifugar las muestras a 20.000 xg durante 15 minutos, retire el sobrenadante y resuspender en 200 l de ddiH 2 O. </li><li> Repita el paso 1.7 y centrifugar de nuevo después de la segunda ddiH 2 O de lavado para eliminar CaCl 2, DTT sin reaccionar, y materiales de carga no encapsuladas a partir del sobrenadante. </li><li> Preparar 10 mg / ml de 2 kDa polietilenglicol-tiol (PEG-SH) en ddiH 2 O. Resuspender cada muestra ICMV en 100 l de solución de PEG-SH y se incuba a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Realice dos ddiH 2 O lavados (paso 1.7) y resuspender el botón ICMV final en PBS y se almacena a 4 ° C. Antes de usar, mezclar la suspensión ICMV, como partículas pueden depositarse en el fondo después de un almacenamiento prolongado. </li><li> Para la caracterización de partículas, extraer una pequeña alícuota (~ 10%) de ICMVs de cada lote y diluir individualmente en un volumen total de 1 ml de ddiH 2 O. Coloque una sola muestra en un tamaño de partícula Zetasizer celular y medida, índice de polidispersidad, y el potencial zeta de las muestras usando un DLS y sistema de medición potencial zeta (de acuerdo con el protocolo del fabricante). </li></ol> 2. El examen de Nódulo Linfático Drenaje de ICMVs fluorescencia etiquetada con Microscopía Confocal <ol><li> Preparación de ICMVs cargado con antígeno-fluoróforo etiquetado y colorante fluorescente lipofílico <ol><li> Preparar proteína fluoróforo de etiquetado, tales como ovoalbúmina hace reaccionar con Alexa Fluor 555-éster de succinimidilo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Para preparar ICMVs etiquetados con fluoróforo en la cáscara de los lípidos, añadir colorante fluorescente lipofílica, (por ejemplo, 1,1-dioctadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, (DiD)) durante la preparación de la película lipídica (Paso 1.2) en 0,05% de lípidos cantidad molar. Para lípidos hidratación película (Paso 1.3), tampón uso que contiene el antígeno fluoróforo etiquetado, y la síntesis ICMV completa tal como se describe en los pasos 1.4 a 1.11. </li></ol></li><li> La administración subcutánea de nanopartículas a base de la cola <ol><li> Anestesiar ratón usando un vaporizador flujo controlado equipado con una cámara de inducción utilizing 3% isoflurano y 1,5 l / min de flujo de oxígeno de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC animal. Una vez que el ratón está inconsciente, realice los siguientes pasos con rapidez antes de la anestesia que desaparecen para permitir un acceso óptimo a el sitio de la inyección y minimizar las molestias al animal. También puede utilizar un buen cono de la nariz apropiado para mantener la anestesia. Si los ratones se anestesiaron durante más de 5 min, aplicar lubricante necesario para minimizar la irritación del ojo después del procedimiento. </li><li> Pulverizar la base de la cola con etanol al 70% para desinfectar y humedecer la parte de piel el pelo mojado para exponer un pequeño parche de piel visible, que puede ser utilizado para visualizar la aguja bajo la piel. </li><li> Prepare suspensión inyección de partículas que contiene la cantidad deseada de antígeno y adyuvante por 100 l de dosis de vacunación en PBS (por ejemplo, 10 g OVA y 0,3 g MPLA por 100 l de dosis de inyección se ha utilizado en el pasado 6,9). </li><li> Dibujar el int suspensión de partículasjeringuilla oa una aguja 27-29 G e insertar la aguja en la base de la cola (~ 5 mm de la línea del cabello) con el bisel hacia arriba e inyectar 50 l de la suspensión de partículas 22. </li><li> Espere unos segundos para que la presión de igualar para evitar excesiva de reflujo y tire de la aguja. Repetir la inyección en el otro lado de la base de la cola para dirigirse tanto que drenan los LN inguinales. </li></ol></li><li> Preparación de cryosections ganglios linfáticos y el examen con el microscopio confocal. <ol><li> La eutanasia del ratón con asfixia con CO2, seguido por neumotórax inducida de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC animal. Extraer los LN inguinales, según el protocolo demostrado en Bedoya 23 y lavar la sangre mediante la colocación de los tejidos en 1 ml de PBS 4 ° C. </li><li> Absorbe el PBS de los tejidos con tejidos y colocar el tejido en criomoldes de tejido (10 x 10 x 5 mm 3) precargada a la cima con 24 octubre medio de congelación. Snap congelar la tisdemandar bloque en nitrógeno líquido durante 30 segundos. Como alternativa, coloque bloque de tejido en hielo seco durante 30 minutos. Almacenar tejido congelado en -80 ° C congelador. </li><li> Cortar secciones de tejido de 5-10 m de espesor en un criostato fijado en -20 ° C 24. </li><li> Si es necesario, lleve a cabo el etiquetado de inmunofluorescencia, y examinar el tejido con la microscopía confocal como previamente demostrada 24. </li></ol></li></ol> 3. Monitoreo de expansión de antígeno-específica, luciferasa que expresan las células T CD8 + después de nanopartículas vacunación con Whole Animal Imaging <ol><li> Aislamiento de OVA 257-264 específico de, las células T CD8 + que expresan luciferasa de OT-I / Luc ratones transgénicos <ol><li> La eutanasia a un ratón transgénico OT-I / Luc con asfixia de CO 2 e inducir un neumotórax de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC animal. Se recoge el bazo de una manera estéril mediante el acceso a la cavidad peritoneal y con cuidado de extraer el tejido del páncreas 23, ylugar en 5 ml de 4 ° C PBS + FBS al 2% para la transferencia a la campana de cultivo de tejidos. </li><li> Coloque el bazo en un colador de nylon 70 micras sobre un tubo de centrífuga cónico de 50 ml (hasta 3 bazos a la vez). El uso de un émbolo de una jeringa de 3 ml, moler las células a través del colador. </li><li> Lave el émbolo y el filtro con PBS + FBS al 2% y deseche. Llevar el volumen total a 10 ml / bazo en el tubo de 50 ml, tomar una pequeña muestra de la suspensión celular a contar con un hemocitómetro, y se centrifuga durante 10 min a 300 x g. </li><li> El uso de un kit de selección negativa magnético disponible comercialmente, aislar la población de células T CD8 +, siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Después de lavar las células con PBS, contar el número de células T CD8 + aisladas. Para evaluar la pureza de las células T CD8 + aisladas, incubar ~ 20.000-30.000 células en 20 l de CD16 de ratón / 32 anticuerpo (0,025 mg / ml) durante 10 min, a continuación, añadir 20 l de anticuerpo αCD8-APC (0,005 mg / ml) y se incuba durante 30 min. Performa todas las incubaciones a 4 ° C en PBS + 1% w / v BSA. Realizar análisis de citometría de flujo 25. </li></ol></li><li> La transferencia adoptiva de células T CD8 + aisladas y la visualización de su expansión después de la vacunación <ol><li> Realice la transferencia adoptiva de células T aisladas OT-I / Luc CD8 + en ingenuo C57BL / 6 ratones mediante la administración de 1-10 × 10 5 células en un volumen de 200 l de PBS mediante inyección intravenosa vena de la cola 22 (día -1). Teniendo en cuenta que los parches de piel y de la piel negro en ratones C57BL / 6 puede interferir con la señal bioluminiscente, albinos afeitado C57BL / 6 ratones son ideales para estos estudios. </li><li> Después de un día (día 0), administrar la vacuna como se describe anteriormente (sección 2.2). </li><li> Administrar 150 mg de luciferina por kg de peso corporal del ratón por vía intraperitoneal en un volumen de 300 l de PBS. Después de 10 min, anestesiar los ratones con isoflurano (como en el paso 2.2.1) y visualizar las células T OT-I / Luc CD8 + mediante la adquisición de la señal de la bioluminiscencia durante 5-10 min won un sistema de imágenes de animales conjunto (IVIS; consulte Wilson 26 para obtener instrucciones detalladas). Repita según sea necesario para los estudios longitudinales. </li></ol></li></ol> Las células 4. péptido-MHC de tetrámeros La tinción de PBMCs de Análisis del antígeno T CD8 + específicas Nota: El procedimiento siguiente protocolo se puede realizar utilizando cualquiera de ratones C57BL / 6 adoptiva transferidos con las células T OT-I / Luc CD8 + o C57BL / 6 ratones sin la transferencia adoptiva. <ol><li> En un punto de tiempo deseado después de la vacunación, recoger aproximadamente 100 l de sangre (4-6 gotas) de los ratones a través de la técnica de sangrado submandibular 27 en un tubo revestido con K 2 EDTA y se invierte varias veces para prevenir la coagulación. </li><li> Transferir 100 l de sangre a un tubo de microcentrífuga, añadir 1 ml de tampón de lisis, y se incuba durante 2 a 3 min con el fin de eliminar los glóbulos rojos (GR). Centrifugar las muestras durante 5 min a 1.500 xg y eliminar el sobrenadante. Si el pellet todavía unappears rojo (que indica eliminación incompleta de los glóbulos rojos), repetir la etapa de lisis con una breve incubación (&lt;1 min) de tampón de lisis. </li><li> Lavar las PBMCs restantes con 1 ml de tampón FACS (PBS + 1% p / v BSA) y centrifugar a 1500 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender la muestra en 20 l de ratón CD16 / 32 anticuerpo (0,025 mg / ml) para bloquear el anticuerpo no específica y mediada por FcR vinculante. Incubar durante 10 min a TA. </li><li> Transferir las células a partir de tubos de microcentrífuga en 4 ml de fondo redondo de tubos de FACS. Añadir 20 l de H-2K b solución OVA Tetramer-SIINFEKL-PE de acuerdo con las especificaciones del fabricante a cada muestra y se incuba durante 30 minutos en hielo. </li><li> Prepare el cóctel de anticuerpos (por ejemplo, αCD8-APC, αCD44-FITC y αCD62L-PECy7 anticuerpos (0.005, / ml de concentración 0.005 y 0.002 mg, respectivamente)). Añadir 20 l a cada muestra experimental, y se incuba durante 20 min en hielo. Preparar controles individuales fluoróforo por labeling células con cada tetrámero fluoróforo de etiquetado o anticuerpo a la concentración indicada anteriormente. </li><li> Lavar 2 veces con tampón FACS y resuspender el sedimento final en tampón FACS que contiene 2 mg / ml de DAPI. Las células están ahora listas para citometría de flujo (análisis de detalles y ejemplos se pueden encontrar en Scheffold 25). </li></ol>

Perkin Elmer siempre que el coste de producción incurridos durante la publicación de este artículo.

El protocolo previsto en este artículo se describe la síntesis y caracterización de un nuevo sistema de nanopartículas a base de lípidos, denominados ICMVs, y proporciona el proceso de validar la efectividad de las formulaciones vacunales basados ​​en nanopartículas para inducir respuestas de células T CD8 + específicas de antígeno. ICMV síntesis se completa en todas las condiciones acuosa, que es una importante ventaja en comparación con otros sistemas de nanopartículas poliméricas comúnmente utilizad...

Desarrollo de la vacuna tradicional ha empleado principalmente el enfoque empírico de ensayo y error. Sin embargo, con el reciente desarrollo de una amplia variedad de biomateriales y descubrimiento de los determinantes moleculares de la activación inmune, ahora es posible diseñar racionalmente formulaciones de vacunas con señales biofísicos y bioquímicos derivados de patógenos 1,2. En particular, varias plataformas de administración de fármacos de partículas han sido examinadas como portadores de vacuna, ya que pueden ser co-cargado con antígenos de subunidades y agentes inmunoestimulantes, proteger componentes de la vacuna de la degradación, y mejorar su co-entrega a células presentadoras de antígeno (APCs) que reside en la linfa nodos (LNS), maximizando así la estimulación inmune y la activación 3-5. En este informe, se describe la síntesis de un sistema de nanopartículas &quot;patógenos imitando&quot;, denominado vesículas multilamelares-interbilayer reticulado (ICMVs), que se han demostrado previamente como platfor vacuna potentem para elicitación de robusta de linfocitos T citotóxicos (CTL) y respuestas inmunes humorales en ambos compartimentos de tejido sistémicas y mucosas 6-9. En particular, la vacunación con ICMVs Conseguido mejorado sustancialmente los niveles de IgG en suero contra un antígeno de la malaria, en comparación con la vacunación con adyuvantes convencionales (por ejemplo, alumbre y Montanide) 7 y también suscitó respuestas CTL potentes contra las células tumorales y modelos de desafío virales en ratones 9. Aquí, utilizando ICMVs como un sistema de nanopartículas vacuna modelo, se describen los métodos para la caracterización de la vacuna nano-formulaciones, incluyendo el tamaño de las partículas y las mediciones de potencial zeta y el seguimiento de la trata de partículas para los LN de drenaje (dLNs) que utilizan la imagen confocal de tejidos cryosectioned 7. Además, se presenta un método basado en imágenes-toda-animales de analizar la expansión de las respuestas de CTL en ratones después de la transferencia adoptiva de células T CD8 + específicas de antígeno que expresan luciferasa 9,10. Finalmente, detinción de tetrámero escriba de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) para la cuantificación longitudinal de las respuestas de células T endógenas en ratones vacunados con nanopartículas de 6,9. ICMVs son una formulación de nanopartículas a base de lípidos sintetizados por fusión controlada de liposomas simples en estructuras multilaminares, que luego son estabilizadas químicamente por grupos de cabeza de fosfolípidos de maleimida-funcionalizado de reticulación dentro de las capas de lípidos con ditiol reticulantes 6. Una vez ICMVs se sintetizan, una pequeña fracción de nanopartículas se puede utilizar para determinar el tamaño de partícula y el potencial zeta (es decir, la carga superficial de las partículas) con un sistema de dispersión de luz dinámica (DLS) y un analizador de potencial zeta. DLS mide los cambios en la dispersión de luz en suspensiones de partículas, lo que permite la determinación del coeficiente de difusión y el tamaño hidrodinámico de partículas 11. El logro de tamaño de partícula consistente de lote a lote síntesis es críticoya que el tamaño de partícula es uno de los principales factores que influyen en el drenaje linfático de partículas de vacunas para dLNs y captación celular posterior por APCs 12,13. Además, el potencial zeta puede obtenerse mediante la medición de la velocidad de las partículas cuando se aplica una corriente eléctrica, que permite la determinación de la movilidad electroforética de las partículas y superficie de las partículas de carga 11. Garantizar valores de potencial zeta consistentes de partículas es importante ya que la carga superficial de las partículas determina la estabilidad coloidal, la cual tiene un impacto directo sobre la dispersión de partículas durante el almacenamiento y después de la administración in vivo 14,15. Con el fin de realizar un seguimiento de la localización de partículas para dLNs, ICMVs pueden ser etiquetados con fluoróforos deseados incluyendo colorantes lipófilos y antígenos covalentemente etiquetados. Después de la inmunización, los ratones pueden ser sacrificados en diversos puntos temporales, dLNs resecadas, cryosectioned, y se analizaron con microscopía confocal. Esta técnica permite la visualización de Desagüe linfáticoción tanto de los transportistas y el antígeno de la vacuna dLNs nanopartícula. Las secciones de tejido, además, se pueden teñir con anticuerpos marcados fluorescentemente y utilizado para obtener más información, tales como tipos de células asociadas con el antígeno y la formación de centros germinales como hemos demostrado previamente 7. Una vez que la síntesis de partículas está optimizado y el tráfico a las dLNs se confirma, es importante para validar la elicitación de expansión de CTL in vivo. Con el fin de analizar la elicitación de las células T CD8 + específicas de antígeno en respuesta a la vacunación de nanopartículas, hemos utilizado un antígeno modelo, ovoalbúmina (OVA), con OVA 257-264 péptido (SIINFEKL) inmunodominante epítopo de células T CD8 +, que permite análisis inmunológicos detalladas de las respuestas de células T específicas de antígeno de 16,17 inicial el desarrollo de vacunas. En particular, para interrogar a la dinámica de expansión y migración de las células T CD8 + específicas de antígeno, hemos generado unamodelo de doble ratón transgénico mediante el cruce de luciferasa de luciérnaga-expresión de ratones transgénicos (Luc) con OT-I ratones transgénicos que poseen las células T CD8 + con receptor de células T (TCR) específico para SIINFEKL (en asociación con H-2K b). A partir de estos ratones OT-I / Luc, luciferasa que expresan, las células T OT-I CD8 + pueden ser aislados y preparados para la transferencia adoptiva en ingenuas ratones C57BL / 6. Una vez sembrada, la inmunización con éxito con nanopartículas que contienen OVA-dará lugar a la expansión de las células T transferidas, que pueden ser rastreados mediante el control de la señal de bioluminiscencia con todo un sistema de imagen 9,10 animal. Esta técnica de formación de imágenes de todo el cuerpo no invasiva se ha utilizado con otros antígenos virales o tumorales en el pasado 18-20, revelando procesos implicados en la expansión de células T en los tejidos linfoides y difusión a los tejidos periféricos de una manera longitudinal. Complementario al análisis de adoptivamente células T CD8 + específicas de antígeno transferidos, endogenolas respuestas de células T después de la vacunación nos puede ser examinado con el complejo péptido-mayor de histocompatibilidad (MHC) de ensayo tetrámero 21, en ​​el que un complejo tetrámero MHC-péptido, que consta de cuatro fluoróforo de etiquetado MHC de clase I moléculas cargado con epítopos de péptidos, se emplea para unirse TCR y la etiqueta las células T CD8 + de una manera específica de antígeno. El ensayo de tetrámero de péptido-MHC se puede realizar ya sea en estudios de necropsia terminales para identificar las células T CD8 + específicas de antígeno en tejidos linfoides y periféricas o en estudios longitudinales con células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas a partir de extracciones de sangre en serie. Después de la tinción de los linfocitos con el péptido-MHC tetrámero, citometría de flujo análisis se realiza para los análisis detallados sobre el fenotipo de los CTL o cuantificación de su frecuencia entre las células T CD8 +.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>870012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&#8482;) (MPLA)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>699800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>0334125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symphny Vacuum Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris Propane (BTP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator (125W/20kHz)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SH-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer Cuvettes</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A37571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT freezing medium&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albino C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-1 C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep&#8482; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; whole animal imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 Fc Block</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>14-0161-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-2Kb OVA Tetramer</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-5001-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8-APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44-FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L-PECy7</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>25-0621-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8417-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

Los pasos implicados en la síntesis de ICMVs se ilustran en la Figura 1 6. En resumen, una película lipídica que contiene cualquier fármacos lipófilos o colorantes fluorescentes se hidrata en presencia de fármacos hidrófilos. Los cationes divalentes, tales como Ca 2+, se añaden a conducir fusión de liposomas aniónicos en vesículas multilamelares. Ditiol agente de reticulación, tales como la TDT, se añade a los lípidos de maleimida-funcionalizado &quot;grapas&quot; en ...

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Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

whole-animal-imaging-flow-cytometric-techniques-for-analysis-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K vistas.  University of Michigan. We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Video: Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Investigación

Inmunología e Infección

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Optimizado de interferón-gamma ELISpot análisis a las respuestas de la célula de T de medida en el modelo de conejillo de Indias después de la vacunación

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

Cuantificación simultánea de CD8 anti-vector y Anti-transgénicos-específico+ T células vía MHC Tetramer tinción después de la vacunación con un Vector Viral

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Confección de ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar inmunodominancia en respuestas de células T CD8+ específicas de tumores

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Aislamiento de células CD8 + T residentes en el riñón delratón para el análisis de citometría de flujo

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine (BrdU) marks cells that are in or recently completed S-phase, and carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) detects daughter cells after division. However, these dyes do not allow identification of the cell cycle phase at the time of analysis. An alternative approach is to exploit Ki67, a marker that is highly expressed by cells in all phases of the cell cycle except the quiescent phase G0. Unfortunately, Ki67 does not allow further differentiation as it does not separate cells in S-phase that are committed to mitosis from those in G1 that can remain in this phase, proceed into cycling, or move into G0.
Here, we describe a flow cytometric method for capturing a &#34;snapshot&#34; of T cells in different cell cycle phases in mouse secondary lymphoid organs. The method combines Ki67 and DNA staining with major histocompatibility complex (MHC)-peptide-multimer staining and an innovative gating strategy, allowing us to successfully differentiate between antigen-specific CD8 T cells in G0, in G1 and in S-G2/M phases of the cell cycle in the spleen&#160;and draining lymph nodes of mice after vaccination with viral vectors carrying the model antigen gag of human immunodeficiency virus (HIV)-1.
Critical steps of the method were the choice of the DNA dye and the gating strategy to increase the assay sensitivity and to include highly activated/proliferating antigen-specific T cells that would have been missed by current criteria of analysis. The DNA dye, Hoechst 33342, enabled us to obtain a high-quality discrimination&#160;of the G0/G1 and G2/M DNA peaks, while preserving membrane and intracellular staining. The method has great potential to increase knowledge about T cell response in vivo and to improve immuno-monitoring analysis.

Clonal expansion is a key feature of antigen-specific T cell response. However, the cell cycle of antigen-responding T cells has been poorly investigated, partly because of technical limitations. We describe a flow cytometric method to analyze clonally expanding antigen-specific CD8 T cells in spleen and lymph nodes of vaccinated mice.

Un ensayo de citometría de flujo basado en ADN/Ki67 para el análisis del ciclo celular de células T CD8 específicas de antígeno en ratones vacunados

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...