Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü 1K22AI097291-01 hibe tarafından desteklenen ve Ödül Numarası UL1TR000433 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Translasyonel Bilimler ilerlemek için Ulusal Merkezi tarafından yapıldı. Biz de aşı nanopartiküller ve OT-I / Luc transgenik fareler üzerinde ilk çalışmaları katkılarından dolayı Fred Hutchinson Kanser Merkezi&#39;nde MİT ve Prof. Matthias Stephan Prof. Darrell Irvine kabul etmiş sayılırsınız.

Bu protokol açıklanan tüm deneyler belirlenen politika ve kurallarına göre Kullanımı ve Michigan Üniversitesi&#39;nde Hayvanlarının Bakımı (UCUCA) Üniversite Komitesi tarafından onaylandı ve yapıldı. 1. Sentezi ve Karakterizasyonu Protein ICMVs Antijen ve Adjuvan Moleküller ile Co-yüklü <ol><li> Karışım 1: 1,2-dioleoil-sn--glisero-3-fosfokolin (DOPC) ve 1,2-dioleoil-sn--glisero-3-phosphoethanolamine- N 1 mol oranı - [4- (p -maleimidophenyl) bütiramit] kloroform (MPB), yığın başına 1.26 umol toplam lipit miktarı tutulması (örneğin, DOPC, 500 ug ve MPB 630 ug) 20 ml bir cam şişe (çap = 28 mm, yükseklik = 61 mm). </li><li> Istenilen konsantrasyonda lipit solüsyonuna, örneğin monofosforil lipid A (MPLA) ya da lipofilik boyalar (örneğin, yaptığımız) gibi lipofilik ilaçlar, ekleyin. İyice ekstra kuru nitroge ile tasfiye ederek organik çözücü kaldırmakn gaz ve vakum O / N altında örnekler yerleştirerek. </li><li> Suda çözünür ilaçlar (örneğin, protein antijenleri) ihtiva eden 10 mM Bis-Tris propan (BTP, pH 7.0), 200 ul ekleyerek lipid filminin hidratı. 10 saniye oda sıcaklığında 1 saat süre ile, her 10 dakika vorteksleyin. </li><li> Cam içeriği, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine ufak şişe yer örnekleri, bir buz-su banyosu içinde, 125 W / 20 kHz prob ucu sonikatör ayarı% 40 yoğunluk kullanılarak 5 dakika boyunca sürekli olarak sonikasyon aktarın. </li><li> Her parti (çalışma konsantrasyonu 2.4 mM), girdap ve masa mikro santrifüj kullanılarak kısa bir süre santrifüje 150 mM ditiyotreitol (DTT), 4 ul ekle. </li><li> 200 mM CaCI2 40 ul ekleyin ve pipet (çalışma konsantrasyonu 33 mM) ile karıştırın. DTT ile lipit katman MPB-ihtiva eden çapraz bağlanmasını sağlamak için 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Santrifüj numuneleri 15 dakika için 20,000 x g&#39;de, ddiH 2 O 200 ul supernatant, ve tekrar süspansiyon kaldırma </li><li> Adımı yineleyin 1.7 ve santrifüj yeniden ikinci ddiH 2 O yıkamadan sonra süpernatanından CaCl 2, reaksiyona girmemiş DTT ve kapsüllenmemiş kargo malzemelerini çıkarmak için. </li><li> DdiH 2 O 2 kDa polietilen glikol-tiol (PEG-SH), 10 mg / ml hazırlayın PEG-SH çözeltisi 100 ul her bir ICMV örnek yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İki ddiH 2 O yıkar (adım 1.7) gerçekleştirin ve 4 ° C&#39;de son ICMV PBS pelet ve mağaza tekrar süspansiyon. Parçacıklar uzun süreli depolamadan sonra dibe olabilir önce ICMV süspansiyonu karıştırmak, kullanmak için. </li><li> Partiküllerin karakterizasyonu için, her partiden ICMVs küçük bir kısım (~% 10) kaldırıp ddiH 2 O, 1 ml bir toplam hacim içinde ayrı ayrı seyreltik Bir Zetasizer hücresi ve ölçü parçacık boyutu, polidispersite indeksi ve DLS ve (imalatçının protokolüne göre) zeta potansiyeli ölçüm sistemi kullanılarak numunelerin zeta potansiyeli tek bir örnek yerleştirin. </li></ol> Ve Lenf Nodu Boşaltma 2. Sınav Konfokal Mikroskopi ile ICMVs Floresan-etiketli <ol><li> ICMVs hazırlanması florofor-etiketli antijen ve lipofilik bir floresan boya ile yüklenir <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, ovalbümin Alexa Fluor 555-süksinimidil ester ile reaksiyona sokulmaktadır gibi florofor-etiketli protein, hazırlayın. </li><li> Lipid kabuk fluorofor ile etiketlenmiş ICMVs hazırlamak için, lipofilik floresan boya (örneğin, 1,1-dioktadesil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, () yaptı) (lipit filmin hazırlanması sırasında Adım ekleme 1.2)% 0.05 molar lipid miktarda. Lipid filmi hidrasyon (Basamak 1.3), florofor etiketli antijen ihtiva eden kullanımı tamponu ve tam ICMV sentezi için adımlar 1,4-1,11 belirtildiği gibi. </li></ol></li><li> Kuyruk dibinde nanopartiküllerin deri altı uygulama <ol><li> Indüksiyon odasında u ile donatılmış kontrollü bir akış buharlaştırıcı kullanılarak fare anestezisiIACUC göre% 3 izofluran ve oksijen akışının 1.5 L / dak tilizing hayvan protokolü onayladı. Fare bilinçsiz sonra, enjeksiyon yerinde optimal erişime izin ve hayvan rahatsızlığı en aza indirmek için kapalı giyen anestezi hızlı bir şekilde önce aşağıdaki adımları uygulayın. Alternatif olarak, anestezi korumak için uygun bir uydurma burun konisi kullanın. Farenin uzunluğu 5 dakika için anestezi uygulanır ise, işlemden sonra tahrişi en aza indirgemek için gerekli olan göz madeni uygulanır. </li><li> Sterilize ve deri altına iğne görselleştirmek için kullanılabilir görebilir deri, küçük bir yama ortaya çıkarmak için kürk Bölüm ıslak saç ıslak% 70 etanol ile kuyruğun tabanına püskürtün. </li><li> Istenen antijen miktarı ve PBS içinde aşı dozu, 100 ul başına yardımcı madde ihtiva eden parçacık püskürtme süspansiyonu hazırlayın (örneğin, 10 ug OVA ve enjeksiyon doz 100 ul başına 0,3 ug MPLA son 6,9 kullanılmıştır). </li><li> Parçacık süspansiyon int Beraberlikoa bir 27-29 G iğne ile şırınga ve kuyruk dibinde iğneyi (~ çizgisi 5 mm) eğim ile yukarı bakacak ve partikül süspansiyonu 22 50 ul enjekte edilir. </li><li> Aşırı geri akışı önlemek ve iğneyi çekin eşitlemek için baskı için birkaç saniye bekleyin. Her iki drenaj kasık LN hedef kuyruk tabanının diğer tarafta enjeksiyon tekrarlayın. </li></ol></li><li> Konfokal mikroskobu ile lenf nodu cryosections hazırlanması ve incelenmesi. <ol><li> Bir IACUC hayvan protokolü onayladı göre uyarılan pnömotoraks ardından CO 2 boğulma ile fare, Euthanize. Bedoya 23 gösterilen protokole uygun olarak kasık lenf nodları ekstrakte edin ve 4 ° C&#39;de PBS içinde 1 ml dokuları yerleştirerek kan yıkayın. </li><li> Dokularıyla dokulardan PBS emilmesini ve doku cryomolds doku yer (10 x 10 x 5 mm3) Ekim ortamı 24 donan üstüne önceden doldurulmuş. Yapış tis dondurmak30 saniye için sıvı azot içinde blok dava. Seçenek olarak ise, 30 dakika boyunca kuru buz üzerinde doku bloğu yerleştirin. ° C derin dondurucuda -80 dondurulmuş doku saklayın. </li><li> -20 ° C&#39;de 24 ayarlanmış bir kriyostat 5-10 mikron kalınlığında doku bölümleri kesin. </li><li> Gerekirse, immunofloresan etiketleme gerçekleştirmek ve daha önce 24 gösterildiği gibi konfokal mikroskobu ile doku inceleyin. </li></ol></li></ol> Antijen-spesifik 3. İzleme Genişleme, Tüm Hayvan Görüntüleme ile Nanopartikül Aşı sonrası CD8 + T Hücreleri Lusiferaz-ifade <ol><li> OT-I / Luc transgenik farelerden OVA257-264-spesifik, lusiferaz sentezleyen CD8 + T hücrelerinin izolasyonu <ol><li> CO 2 boğulma ile bir OT-I / Luc transgenik fare Euthanize ve bir IACUC göre pnömotoraks hayvan protokolü onayladı neden olur. Pankreas 23 doku ayrılmakta dikkatle periton boşluğuna erişim ve steril bir şekilde dalak Hasat vedoku kültürü kaputu transferi için 4 ° C PBS +% 2 FBS içinde 5 ml bir yer. </li><li> (Bir seferde 3 dalak kadar) 50 ml konik santrifüj tüpü üzerinde 70 mikron naylon süzgeç üzerinde dalak yerleştirin. 3 ml şırınga bir dalgıç kullanarak, süzgeç vasıtasıyla hücrelere eziyet. </li><li> Piston ve PBS +% 2 FBS ile süzgeç yıkayın ve atın. 300 x g, 10 dakika boyunca, 10 ml / 50 ml tüp içinde dalak toplam hacmi getirmek hemositometre ile saymak için hücre süspansiyonu küçük bir örnek alır ve santrifüjlenir. </li><li> Ticari olarak mevcut olan manyetik negatif seçim seti kullanılarak, imalatçının talimatları izlenerek CD8 + T hücre popülasyonu izole eder. </li><li> Hücrelerin PBS ile yıkandıktan sonra, izole edilmiş CD8 + T hücrelerinin sayısı. Izole edilmiş CD8 + T hücrelerinin saflığını değerlendirmek için, daha sonra αCD8 APC antikorun 20 ul, 10 dakika süre ile, fare CD16 / 32 antikoru (0.025 mg / ml) 20 ul ~ 20.000-30.000 hücrelerin inkübe (0.005 mg / ml) ve 30 dakika boyunca inkübe edin. PeBSA a / h PBS içinde 4 ° C&#39;de +% 1 Bütün inkübasyonlar, rform. Akım sitometri analizi 25 gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Genişleme sonrası aşılama evlatlık izole CD8 + T hücrelerinin transferi ve görselleştirme <ol><li> Intravenöz kuyruk damarından 22 (gün -1) ile PBS içinde 200 ul hacim içinde 1-10 x 10 5 hücre uygulanmasıyla saf C57BL / 6 farelerine izole OT-I / Luc CD8 + T hücrelerinin adoptif transferini gerçekleştirir. C57BL / 6 farelerde bu kürk ve siyah deri yamaları dikkate alındığında bioluminescent sinyal engel olabilir, traş albino C57BL / 6 fareler bu çalışmalar için idealdir. </li><li> Daha önce (bölüm 2.2) açıklandığı gibi bir gün (gün 0) sonra aşı yönetmek. </li><li> Intraperitonal PBS 300 ul hacim içinde kg fare vücut ağırlığı başına luciferase 150 mg uygulayın. 10 dakika sonra, (aşama 2.2.1 gibi) izofluran fareler anestezi ve 5-10 dakika w biyoışıldama sinyali alarak OT-I / Luc CD8 + T hücreleri görselleştirmekBir bütün hayvan görüntüleme sistemi i (IVIS, detaylı talimat Wilson 26 bakınız). Uzunlamasına çalışmalar için gerekli tekrarlayın. </li></ol></li></ol> Analiz PBMC&#39;ler 4. Peptid-MHC tetramer boyama antijene özgü CD8 + T hücreleri, Not: Aşağıdaki protokol prosedürü adoptif adoptif transfer olmadan OT-I / Luc CD8 + T hücreleri ya da C57BL / 6 fareler ile transfer C57BL / 6 fareleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. <ol><li> Aşılamadan sonra, arzu edilen bir zaman noktasında, K 2 EDTA ile kaplanmış bir tüp içine submandibuler kanama tekniği 27 vasıtasıyla farelerden kan yaklaşık 100 ul (4-6 damla) toplamak ve pıhtılaşmayı önlemek için birkaç kez ters çevirin. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüpüne kan 100 ul aktarma liziz tamponu için 1 ml ekleyin ve kırmızı kan hücrelerini (RBC) ortadan kaldırmak amacıyla 2 dakika ila 3 inkübe edin. Santrifüj örnekleri 1,500 xg&#39;de 5 dakika boyunca ve supernatant çıkarın. Yine de pelet halinde(RBCs eksik kaldırılmasını belirtir) kırmızı ppears, lizis tamponu kısa bir inkübasyon (&lt;1 dakika) ile parçalama adımı tekrarlayın. </li><li> 5 dakika boyunca 1,500 x g&#39;de 1 (/ hac BSA, PBS +% 1) FACS tamponu ilave edildi ve santrifüj ile geriye kalan PBMC&#39;ler yıkayın. </li><li> Aspire süpernatan ve spesifik olmayan ve FcR aracılı antikor engellemek için fare CD16 / 32 antikorunun 20 ul örnek (0.025 mg / ml) yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 4 ml yuvarlak dipli FACS tüpler içine mikrosantrifüj tüpler hücreleri aktarın. Her bir örnek için, üreticinin spesifikasyonlarına göre OVA Tetramer-SIINFEKL-PE çözelti B, H-2K 20 ul eklenir ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Antikor kokteyli hazırlayın (örneğin, αCD8-APC, αCD44-FITC ve αCD62L-PECy7 antikorlar (sırasıyla 0.005, 0.005, ve 0.002 mg / ml konsantrasyon)). Her bir deney örneği 20 ul ekleyin ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir. La tarafından tek fluorofor kontrolleri hazırlayınYukarıda belirtilen konsantrasyonda her florofor ile işaretlenmiş tetramer veya antikor ile hücreler Beling. </li><li> FACS tamponu ile 2 kez yıkanır ve DAPI 2 ug / ml ihtiva eden FACS tamponu nihai pelletini. analizi (ayrıntılar ve örnekler Scheffold 25 bulunabilir) sitometri hücreleri artık akışı için hazırız. </li></ol>

Perkin Elmer, bu makalenin yayınlanması sırasında katlanılan üretim maliyeti sağladı.

Bu makalede sağlanan protokol ICMVs olarak adlandırılan sentezi ve yeni bir lipid bazlı nanopartikül sisteminin karakterizasyonu açıklanmaktadır, ve antijene spesifik CD8 + T hücresi tepkilerini indükleme nanopartikül bazlı aşı formülasyonlarının etkinliğinin doğrulanması için bir işlem sağlar. ICMV sentezi genellikle kaybı ile sonuçlanan, tipik olarak hazırlanması için, organik çözücüler gerektiren diğer yaygın olarak kullanılan polimer nano partikül sistemleri (örneğin, p...

Geleneksel aşı geliştirme ağırlıklı deneme-yanılma ampirik bir yaklaşım uygulamaktadır. Ancak, biyomalzeme ve immün aktivasyon moleküler belirleyicileri keşif geniş bir yelpazeye son gelişme ile, bu rasyonel patojenlerin 1,2 türetilen biyofiziksel ve biyokimyasal ipuçları ile aşı formülasyonları tasarlamak artık mümkün. Özellikle, çeşitli parçacık halinde ilaç iletim platformları, lenf içinde bulunan bozunmadan, aşı bileşenleri korumak ve antijen sağlayan hücrelere (APC) kendi eş sevkini iyileştirmek, bu alt birim antijen ve immünostimülatör maddelerle birlikte yüklenebilecek aşı taşıyıcıları olarak incelenmiştir düğümler (LN), böylece bağışıklık uyarımı ve aktivasyonunu 3-5 maksimize. Daha önce güçlü bir aşı platfor olarak gösterilmiştir, bu yazıda, bir &quot;patojen taklit eden&quot; nanopartikül sisteminin sentezini tarif adlandırılan interbilayer-çapraz bağlanmış çok-lamelli veziküller (ICMVs),Sağlam sitotoksik T lenfosit (CTL) ve sistemik ve mukoza dokusu bölümlerinde 6-9 hem de humoral bağışıklık karşılıklarının ortaya çıkartıldığını m. Özellikle, ICMVs ile aşılama büyük oranda geleneksel yardımcı maddeler (örneğin, şap ve Montanide) 7 ile aşılama ile karşılaştırıldığında, bir sıtma antijene karşı serum IgG düzeyleri gelişmiş ve aynı zamanda tümör hücreleri ve fareler 9 viral meydan modellerine karşı güçlü CTL yanıtları ortaya başararak. Burada bir model aşı nanoparçacık sistemi olarak ICMVs kullanarak, biz partikül büyüklüğü ve zeta potansiyeli ölçümleri ve boşaltma LN parçacık ticareti izleme cryosectioned dokuların 7 konfokal görüntüleme kullanan (dLNs dahil) aşı nano-formülasyonlar karakterizasyonu için yöntemler açıklanmaktadır. Buna ek olarak, lusiferaz sentezleyen bir antijen-özgül CD8 + T hücrelerinin 9,10 adoptif nakli sonrasında farelerde CTL yanıtlarının genişleme analiz bir bütün hayvan görüntüleme tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. Son olarak biz denanopartiküller 6,9 ile aşılanmış farelerde endojen T hücresi tepkilerinin uzunlamasına ölçümü için periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), çizici tetramer boyaması. ICMVs daha sonra kimyasal olarak çapraz bağlayıcı ditiyol 6 lipid tabakaları içinde çapraz bağlama maleimid-işlevselleştirilmiş fosfolipid baş grupları tarafından stabilize edilir çok katmanlı yapılar, içine basit lipozomlar kontrol füzyon tarafından sentezlenen bir lipid bazlı nanopartikül formülasyonu vardır. ICMVs sentez edildikten sonra, nano partiküllerin küçük bir kısmı parçacık boyutuna ve zeta potansiyeli, dinamik ışık saçılımı (DLS) sistemi ve zeta potansiyeli analizcisi ile (parçacıkların, yani, yüzey yükü) belirlemek için kullanılabilir. Difüzyon katsayısı belirlenmesi ve parçacıkların 11 hidrodinamik boyutu izin parçacık süspansiyonları ışık saçılması DLS ölçer değişiklikler. Toplu sentezine toplu tutarlı parçacık büyüklüğü sağlanması önemlidirparçacık boyutu yana APCler 12,13 tarafından dLNs ve daha sonra hücre içine kabul edilmesine aşı parçacıkların lenf boşaltma etkileyen ana faktörlerden biridir. Buna ek olarak, zeta potansiyeli partikülleri ve partikül yüzey yükünün 11 elektroforetik hareketlilik belirlenmesini sağlayan bir elektrik akımı uygulanır parçacık hızını ölçerek elde edilebilir. Parçacıkların yüzey yükü depolama sırasında ve in vivo uygulama 14,15 sonra parçacık dağılım üzerinde doğrudan etkisi vardır koloidal istikrarı belirler çünkü parçacıkların tutarlı zeta potansiyeli değerlerin sağlanmasında çok önemlidir. DLNs partikül yerelleştirme izlemek amacıyla, ICMVs lipofilik boyalar ve kovalent etiketli antijenler de dahil olmak üzere istenilen floroforlar ile etiketli olabilir. Aşılamadan sonra, fareler, dLNs rezeke, çeşitli zaman noktalarında ötenazi cryosectioned ve konfokal mikroskobu ile analiz edilebilir. Bu teknik lenfatik DraI görselleştirme sağlarnanoparçacık aşı taşıyıcıları ve dLNs antijenin hem eğirme. Daha önce 7 gösterildiği gibi doku bölümleri ilave olarak antijen ve germinal merkezlerin oluşumu ile bağlantılı hücre türleri gibi floresan etiketli antikorlar ve daha fazla bilgi elde etmek için kullanılan ile boyanmış olabilir. Parçacık sentezi optimize edilmiştir ve dLNs insan ticareti onaylandıktan sonra, in vivo CTL genişleme aydınlatılması doğrulamak için önemlidir. Nanoparçacık aşılamaya verdikleri yanıt olarak antijene özgü CD8 + T hücrelerinin ortaya konmasını analiz etmek amacıyla, detaylı bir immünolojik analizler sağlar OVA 257-264 peptit (SIINFEKL) immünodominant CD8 + T hücre epitopu ile bir model antijen, ovalbümin (OVA) kullanmıştır Başlangıç ​​aşı geliştirme 16,17 için antijen-spesifik T hücresi tepkilerinin. Özel olarak, genleşme ve antijene özgü CD8 + T hücrelerinin göç dinamiklerini sorgulamak için, biz oluşturulan adresT-hücresi reseptörü (H-2K ile birlikte b) SIINFEKL için spesifik (TCR) ile CD8 + T hücreleri sahip OT-I transgenik farelerin transgenik fareler (Luc), lusiferaz sentezleyen ateşböceği geçerek çift transgenik fare modeli. Bu OT-I / Luc Farelerden, lusiferaz sentezleyen, OT-I, CD8 + T hücreleri, izole edilebilir ve saf C57BL / 6 farelerine adoptif transfer için hazırlanmıştır. Tohumlanmış sonra, OVA-içeren nanopartiküller ile başarılı bir aşı, bir bütün hayvan görüntüleme sistemi 9,10 ile biyoışıldama sinyalinin izlenmesi ile takip edilebilir şekilde nakledilen T hücrelerinin genişlemesine neden olur. Bu non-invazif tüm vücut görüntüleme tekniği uzunlamasına bir şekilde periferal dokularda T hücresi lenfoid dokularda genişleme ve yayılması ilgili işlemleri ifşa son 18-20 diğer viral veya tümör antijenleri ile kullanılmıştır. Adoptif transfer antijene özgü CD8 + T hücre analizi, tamamlayıcı, endogenoBize T hücresi tepkileri kullanıldığında, aşılama dört florofor ile işaretlenmiş MHC-sınıf I molekülleri içeren bir peptit-MHC kompleksi tetramer, peptit epitopları ile yüklü olan peptid ana histokompatibilite kompleksi (MHC) tetramer denemesi 21 ile incelenebilir yayınlamak bir antijen-spesifik bir şekilde, TCR ve etiket, CD8 + T hücrelerini bağlamak için. peptid-MHC tetramer denemesi lenfoid ve periferik dokularda antijen spesifik CD8 + T hücrelerini teşhis etmek için, terminal Otopsi çalışmaları ya da seri kan çekilir elde edilen periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC) ile uzunlamasına çalışmalarda da gerçekleştirilebilir. Peptid-MHC tetrameri ile lenfositlerin boyama sonra, akış sitometri analizine CD8 + T-hücreleri arasında kendi frekans CTL&#39;lerin fenotipinde veya nicelenmesine detaylı analizler için gerçekleştirilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>870012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&#8482;) (MPLA)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>699800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>0334125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symphny Vacuum Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris Propane (BTP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator (125W/20kHz)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SH-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer Cuvettes</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A37571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT freezing medium&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albino C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-1 C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep&#8482; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; whole animal imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 Fc Block</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>14-0161-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-2Kb OVA Tetramer</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-5001-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8-APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44-FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L-PECy7</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>25-0621-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8417-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

ICMVs sentezinde yer alan basamaklar, Şekil 1 &#39;6&#39;da tasvir edilmiştir. Kısaca, bir lipofilik ilaçlar ya da floresan boyalar ihtiva eden bir lipid filmi hidrofilik ilaçların mevcudiyetinde hidratlanır. Örneğin Ca2 + gibi iki değerli katyonlar, çok katmanlı vezikülleri içine anyonik lipozomların füzyon sürmek için ilave edilir. DTT gibi, yağ katmanları apposing, ve son olarak, dış maleimid grupları, kalan &quot;elyaf&quot; maleimid işlevselleştirilmi?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination at JoVE.com

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

whole-animal-imaging-flow-cytometric-techniques-for-analysis-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K Görüntüleme.  University of Michigan. We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.