This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

1. Ion selectivo autorreferencia Preparación microelectrodos <ol><li> Preparación de microelectrodos selectivo de iones <ol><li> Heat tire delgadas capilares de borosilicato de paredes sin filamento (1,5 mm de diámetro exterior, 1,12 mm de diámetro interior) con un extractor de microelectrodos. Nota: Esto le da consejos de 3-4 m de diámetro. Consejos más pequeñas tienen mayor resistencia que hace microelectrodos más susceptibles al ruido electrónico y también está asociado con una respuesta más lenta a un cambio en la concentración de iones. Información útil se puede encontrar en el documento publicado por Smith et al. 26. </li><li> Silanizar los electrodos para hacer que la superficie interior hidrófobo para ayudar a la retención del cóctel ionóforo lipófilo. Colocar los microelectrodos en un bastidor de metal y el calor O / N en un horno a&gt; 100 ° C para secarlos. El bastidor es una placa de metal con agujeros de diámetro 2 mm perforado parte del camino a través. Coloque los electrodos en los agujeros inclinar hacia arriba con una 250 ml gvaso de precipitados lass sobre ellos. </li><li> Por la mañana, apague el horno y con guantes aislados, retire con cuidado la rejilla de metal con los electrodos y vaso de precipitados en el lugar. Cierre la puerta del horno para retener el calor. </li><li> Use guantes de látex o nitrilo, bata de laboratorio y protección para los ojos. Con un plástico pipeta Pasteur, colocar una gota de solución de silanización I en la base de cada electrodo (mantener el vaso en su lugar, el uso del pico vertedor para acceder pipeta). La solución de silanización se vaporiza por la placa caliente y silanizes el interior de los electrodos. Use una campana de extracción de extracción química para esta etapa. Coloque la parrilla / vaso / electrodos de nuevo en el horno caliente durante un par de horas para permitir que cualquier solución silanización restante se evapore. Nota: Por razones de seguridad, no encienda el horno de nuevo. Coloque una etiqueta en el horno que indica que no debe estar encendido, ya que puede contener vapores nocivos e inflamables. </li><li> Después de enfriar, almacenar los microelectrodos en un frasco de almacenamiento insi microelectrodoDe a desecador de vidrio con 400 g de desecante. Los microelectrodos pueden ser almacenados por lo tanto durante muchas semanas. Nota: Un método alternativo silanización se describe en Smith et al 26. </li><li> Volver a llenar el microelectrodo con 50 a 100 l (una longitud de aproximadamente 1 cm) de una solución que contiene 100 mM de ion a medir (ver Tabla 1 y la Figura 1B). Use un Pasteur de plástico térmico pipeta desechable tirado en un mechero Bunsen a una multa de filamento. Enjuague la pipeta en dH 2 O después para evitar el bloqueo. Nota: Como alternativa, ajustar la concentración de iones de la solución de relleno para que coincida con la concentración de iones en la solución externa 27. </li><li> Observar el microelectrodo bajo un microscopio de disección para asegurar la ausencia de burbujas de aire. <ol><li> Si las burbujas están presentes toque el microelectrodo ligeramente con la uña del dedo mientras se mantiene el electrodo verticalmente (la punta hacia abajo) y / o empujar la burbujas la punta aplicando contrapresión usando una jeringa modificada con un tubo de silicona de cambiar la aguja. </li></ol></li><li> Tip-llenar el microelectrodo con 15 a 20 nl (una longitud de 30-50 micras) de cóctel ionóforo específico de iones (véase la Tabla 1). Coloque una pequeña gota de cóctel ionóforo en el borde corto de un portaobjetos de microscopio. Observe la punta de microelectrodos bajo un microscopio de disección y moverlo hacia el portaobjetos de microscopio hasta que la punta de microelectrodos toca el cóctel ionóforo sólo alrededor de la mitad de un segundo. Dibuje el cóctel ionóforo en el microelectrodo por la presión capilar. Nota: evite una larga columna de cóctel ionóforo ya que esto aumenta la resistencia eléctrica de la sonda que puede hacer que sea susceptible a la interferencia electrónica (ruido) y también ralentiza el tiempo de respuesta. </li><li> Monte el microelectrodo en un soporte de microelectrodos recta con un conector macho de 1 mm de oro y AgCl (Ag +) cable (Figura 1B). &lt;/ Li&gt; <li> Coloque el soporte de microelectrodos a la etapa de la cabeza montado en un microposicionador electrónico controlado por ordenador en tres dimensiones (Figura 1). </li><li> Coloque la punta microelectrodo en la medición de solución adecuada para la muestra a medir (solución salina fisiológica, medio de cultivo, etc.) para permitir el microelectrodo se estabilice durante una hora o dos, o incluso durante la noche. </li></ol></li><li> Preparación del electrodo de referencia <ol><li> Los electrodos de referencia (Figura 1C) son los mismos capilares como anteriormente. Cortar el capilar con un lápiz de diamante en 5 cm de longitud y pulido al fuego en cada extremo de 1.2 seg en una llama de Bunsen. </li><li> Llenar estos electrodos con ~ 200 l de una solución de NaCl 3 M, CH 3 CO 2 K (acetato de potasio) o KCl con 2% de agarosa. Elige la solución en función del ion que se desea medir (el electrodo de referencia no debe contener el ion que se está midiendo; véase la Tabla 1). Mezclarla agarosa y la solución y el calor a casi hirviendo en un microondas. Agitar para disolver la agarosa (la solución pasa claro). </li><li> Conecte el electrodo de referencia a una pipeta Pasteur de plástico y extraer la solución caliente en el capilar. </li><li> La caída de la electrodo en frío M NaCl 3, CH 3 CO 2 K o solución de KCl y almacenar en esta solución 3 M en tubos sellados antes de su uso. Deseche todos los electrodos de referencia con burbujas de aire. </li><li> Monte el electrodo de referencia en un soporte de microelectrodos recta con un AgCl (Ag +) de pellets (con solución 3 M llenas pre) en el interior y un oro 2 mm conector macho (Figura 1C) y conecte el electrodo y el soporte en un micro-posicionador manual de montado en un soporte magnético. </li></ol></li></ol> 2. Ion selectivo autorreferencia microelectrodos Calibración <ol><li> Preparación de las soluciones de calibración que contienen el ion de interés como en la solución de referencia; véase la Tabla 1 </strong&gt;. Soporte de la concentración que se encuentra en la solución de la muestra estará en (por ejemplo, medios de cultivo, solución salina fisiológica). Es decir, una solución de calibración debe contener una menor concentración de iones que en la solución de medición, y uno más alto. <ol><li> Por ejemplo, usar una solución salina que contiene 1 mM de K +. Para esta concentración entre paréntesis, disolver polvo de KCl en agua desionizada a una concentración de 10, 1 y 0,1 mM en diluciones seriadas. Utilice estas soluciones de calibración. Alternativamente, utilizar al menos dos de estas soluciones. </li></ol></li><li> Sumergir el microelectrodo selectiva de iones y el electrodo de referencia en cada solución de calibración y dejar que el valor de la tensión se estabilice durante 1 a 3 min antes de grabar el voltaje correspondiente usando el software dedicado (véase la Tabla 1). </li><li> A medida que el software guarda los datos (salida del amplificador) como un archivo txt, copie los datos en un archivo de hoja de cálculo. Trazar la salida microelectrodo (mV) contra el logaritmo dela concentración de iones molar (Figura 2A). </li><li> Aplicar una regresión lineal y calcular la pendiente de Nernst, interceptar y R 2 valor. Acepte el microelectrodo si la pendiente de Nernst es de 58 ± 11 mV / década para iones monovalentes y 29 ± 11 mV / década para iones divalentes (por cationes, la pendiente de Nernst es positivo, por aniones es negativo). Además, las buenas microelectrodos deberían tener una fuerte correlación lineal (R 2&gt; 0,9; Figura 2B). Nota: La salida de mV del amplificador utilizado aquí da lectura mV con una ganancia de diez veces. Los valores tienen que ser dividido por un factor de diez. </li><li> Utilice la fórmula de regresión lineal para convertir la salida mV en bruto de la microelectrodo en la concentración de iones real (Figura 2B). </li></ol> 3. Validación de la técnica de microelectrodos de ion selectivo <ol><li> Preparación de una fuente artificial <ol><li> Capilares de origen artificiales son los mismos capilares comoarriba. Heat tire el capilar usando un extractor de microelectrodo como en el paso 1.1.1. </li><li> Rellene estos capilares con 200 l de una solución de NaCl, KCl 1 M, CaCl 2 2 H 2 O o tampón pH 4. Elija la solución fuente artificial en función del ion que se desea medir (véase la Tabla 1). Nota: Como alternativa, tire de electrodos con mayor diámetro de la punta (~ 20 m) y la punta de relleno con las mismas soluciones, pero que contiene 0,5 a 1% de agarosa (agarosa evitará cualquier flujo mayor de solución). </li><li> Montar el capilar fuente artificial en un micromanipulador y sumergirlo en la solución utilizada para medir el flujo de los iones en las muestras. Deja la fuente artificial en la solución durante 30 min a 1 h para permitir la estabilización del gradiente. </li></ol></li><li> Validación de la microelectrodo selectivo de iones <ol><li> Sumerja el microelectrodo selectivo de iones alrededor de un centímetro de distancia de la fuente artificial capilar en la solución utilizada para Measure el flujo de iones en las muestras y cerrar el circuito con el electrodo de referencia como antes. Que el valor de la tensión se estabilice durante 1 a 3 min antes de grabar el voltaje correspondiente usando el software dedicado para 1 a 2 min. Este valor corresponde al valor del buffer (en la literatura también se refirió como referencia, el fondo o valor en blanco). </li><li> Mueva el microelectrodo selectiva de iones a aproximadamente 5 micras de la fuente artificial y dejar que el valor de la tensión se estabilice durante 1 a 3 min antes de grabar el voltaje correspondiente utilizando el software durante 1 a 2 min. </li><li> Repetir el procedimiento anterior colocando el microelectrodo selectivo de iones en 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 y 1280 m de distancia de la fuente capilar artificial. </li><li> Extraer los datos como un archivo txt y copiar los valores en un archivo de hoja de cálculo. </li></ol></li><li> Calcular la concentración de iones correspondiente a los valores mV en la misma forma que para los valores de calibración. Trazar el valor. Note: Si un flujo de iones está presente, el microelectrodo detecta una diferencia en la concentración de iones entre las dos posiciones (Figura 3B). Si la fuente artificial contiene más iones de la especie medidos de la solución, la concentración debe ser más alta cerca de la fuente de lejos, la validación de la capacidad de la microelectrodo selectiva de iones para detectar correctamente la dirección de un flujo de iones (en este caso eflujo; para un fregadero artificial, con la concentración de iones específica más baja que la medición de medio, debe ser afluencia). <ol><li> Calcular el flujo de iones usando la ley de difusión de Fick: J = c μ (dc / dx) donde c es la concentración de iones en la solución (mol cm -3), μ es la movilidad de iones (mol cm N -1 s -1) , y DC es la diferencia de concentración a través de la distancia dx (cm) (Figura 2C). Datos de flujo de iones se presentan habitualmente en pmol cm -2 s-1 O -2 nmol cm seg -1. Nota:.. Un método alternativo de cálculo de flujo de iones descrito por Smith et al 26 se puede utilizar. Principales diferencias incluyen el uso del coeficiente de difusión en lugar de la movilidad de iones y la resta del flujo de iones de fondo (también variación de la tensión o factor de corrección) calculada a partir de la medición del flujo de iones en solución salina sin muestra. </li><li> Trazar la media de los flujos de iones de cada paso en contra de la distancia de la fuente (Figura 2D). Alejándose de la fuente, observar una disminución exponencial del valor de flujo de la validación de la capacidad de la microelectrodo selectiva de iones para detectar diferente magnitud de los flujos de iones. </li><li> Realice la validación fuente artificial una vez para cada ion específico destinado a ser grabada con el fin de validar sus mediciones de dirección y magnitud correctas con una gran relación señal-nrelación oise. Nota: la medición de flujo de iones del tampón sin muestras indica el nivel o el ruido de fondo. Por lo general, la medición de amortiguación no muestra fluctuaciones clara de la concentración de iones conduce a muy pequeña de flujo que muestra las direcciones variables. </li></ol></li></ol> 4. Preparación de medición Cámara Nota: Antes de los experimentos, considere la muestra a medir y cómo la muestra se va a montar y se inmoviliza para mediciones de microelectrodos. <ol><li> Para Xenopus laevis mediciones ovocitos cortar un cuadrado de 1 cm de una malla de nylon de 800 micras (malla Nitex) y péguelo en una placa Petri de plástico (Figura 1E). </li></ol> 5. Ion Flux Medición <ol><li> Medir la concentración de iones presente en el tampón usado para realizar las mediciones sobre la muestra de la misma manera que para la solución de calibración. X. ovocitos laevis requieren Ringer Modificado de Mark (MMR). Dissolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl $ y HEPES en agua desionizada para alcanzar una concentración final de (mM): NaCl 100, KCl 2, CaCl 2, 1 de MgCl y 5 HEPES. Ajuste el pH del tampón a 7,5 utilizando NaOH. </li><li> Coloque la muestra en la cámara de medición y llevar el microelectrodo selectiva de iones cerca de la muestra (aproximadamente 10 m de distancia) utilizando el microposicionador para definir la posición de cierre de la microelectrodo (Figura 3A). </li><li> Iniciar la excursión de baja frecuencia (0,3 Hz) (100 m) de la microelectrodo entre la posición de cierre y una posición alejada de la muestra (distante) utilizando el software dedicado. Asegúrese de que el movimiento del microelectrodo es perpendicular a la superficie de la muestra. Nota: La excursión del microelectrodo se puede establecer en el software. Gran excursión aumenta el gradiente de leer lo que permite una detección más fácil de pequeños flujos durante la medición, mientras que alarga el intervalo de muestreo y disminuye la resolución temporal. Ver <strong&gt; Figura 3A para un ejemplo. </li><li> Inicie la grabación usando el software. El micro se detiene en cada posición y el potencial eléctrico en mV se registra en el equipo. Obtener mediciones durante al menos 2 min, lo que permite la estabilización de la señal. Para los experimentos de lapso de tiempo cortos, las variaciones posibles de registro en la posición de interés para todo el curso del tiempo. </li><li> Extraer los datos como un archivo txt y copiar los valores en un archivo de hoja de cálculo. </li><li> Calcular la concentración de iones correspondiente a los valores mV en la misma forma que para los valores de calibración. Trazar el valor. Nota: Si un flujo de iones está presente, el microelectrodo detecta una diferencia en la concentración de iones entre las dos posiciones (Figura 3B). </li><li> Calcular el flujo de iones usando la ley de Fick de la difusión como antes (etapa 3.3.1). </li><li> Repita la medición búfer antes de medir una nueva muestra y repita el procedimiento de medición de flujo y el cálculo para cada nuevomuestra. </li></ol> 6. Análisis Estadístico y Data Presentación <ol><li> Pon a prueba los efectos independientes de la posición y / o parte del tiempo en los flujos de iones bajo la condición de control utilizando un modelo ANCOVA con efectos mixtos 28. Nota: análisis de covarianza (ANCOVA) es un modelo lineal general que mezcla ANOVA regular y regresión permitiendo medidas tanto categóricas y continuas para ser utilizados como variables independientes. Además, en presencia de errores correlacionados inducidas por medidas repetidas por efectos anidados individuales y eventuales, se utilizan modelos de efectos mixtos para modelar estimaciones precisas de ambos efectos fijos y aleatorios. </li><li> Calcula las comparaciones por pares utilizando la t de Student-test entre los niveles de grupo con la corrección de Bonferroni para múltiples pruebas 28. </li><li> Generar diagramas de caja para resumir las mediciones de flujo de iones de acuerdo a la posición y el tiempo. Incluir los valores de p de la t de Student por pares descritaanteriormente (Figura 3D) e indican que los niveles de significación de los valores de p de la siguiente manera: *: p &lt;0,05; **: P &lt;0,01; ***: P &lt;0,001 29 </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Los pasos más críticos para la medición exitosa de los flujos de iones extracelulares in vivo son: la reducción del ruido, la fabricación correcta de los microelectrodos y referencia selectivos de iones del electrodo, y el posicionamiento de la muestra y ambos electrodos. Con el fin de minimizar el ruido, el sistema de grabación debe estar en una puesta a tierra (puesta a tierra) jaula de Faraday preferiblemente con una mesa (aislamiento de vibraciones) de metal-rematada que t...

<html> Todas las células animales están rodeadas por una membrana de bicapa lipídica que separa el citoplasma del ambiente exterior. La célula mantiene un potencial de membrana eléctrica, negativa en el interior, por el transporte activo de iones 1. El potencial de membrana es una fuente de energía almacenada que la célula puede utilizar para operar diversos dispositivos moleculares en la membrana 2. Las neuronas y otras células excitables tienen grandes potenciales de membrana. Apertura rápida de los canales de sodio se colapsa el potencial de membrana (despolarización) y produce el potencial de acción que es transportado a lo largo de la longitud de la neurona 2. Aparte de estos rápidos cambios eléctricos, muchos tejidos y órganos generan y mantienen los potenciales eléctricos significativos a largo plazo. Por ejemplo, la piel y el epitelio corneal generar y mantener los potenciales de trans-epiteliales y corrientes eléctricas extracelulares por bombeo direccional de iones (principalmente sodio y cloruro) 3. tienda de campaña &quot;&gt; Mientras que las mediciones de corriente eléctrica extracelular endógena usando la sonda vibrante 4-6 y mediciones de la membrana o trans-epiteliales potenciales utilizando el sistema de microelectrodo 7-10 permitir la medición de los parámetros eléctricos de las membranas celulares y capas de células epiteliales, no dan indicación de las especies de iones implicados. Microelectrodos con ionóforo selectivo pueden medir la concentración de iones específicos en solución. Gradientes de iones o de flujo podrían ser medidos con dos o más electrodos en diferentes posiciones. Sin embargo, la variación de la tensión intrínseca de cada sonda sería diferente, provocando mediciones inexactas o incluso la detección de un gradiente de que no estaba presente. Un único electrodo utilizado en el modo de &quot;auto-referenciación&quot; por la cual se mueve a baja frecuencia entre dos puntos resuelve este problema. Ahora el flujo de iones puede ser visto en el contexto de una deriva de señal relativamente lento y estable (véase la Figura 3B). </p&gt; El sistema de medición sensible a los iones utiliza microelectrodos de autorreferencia selectivos de iones para detectar pequeños flujos extracelulares de iones cerca de los tejidos o células individuales. El sistema consta de un amplificador que procesa la señal desde el microelectrodo y un motor paso a paso y micro controlador para controlar el movimiento de la microelectrodo. El microelectrodo selectiva de iones y el electrodo de referencia que cerrar el circuito están conectados al amplificador a través de un cabezal de la platina pre-amplificador (Figura 1A). Software de ordenador determina los parámetros del movimiento microelectrodo (frecuencia, distancia) y también registra la salida del amplificador. El motor paso a paso controla el movimiento a través de un microelectrodo microposicionador tridimensional. Una baja frecuencia de vibración de microelectrodos selectivo de iones fue desarrollado por primera vez en 1990 para medir el flujo de calcio específico 11. Así como el calcio, cócteles ionóforos comercialmente accesibles ahora están disponibles para hacer microelectrodes sensible al sodio, cloruro, potasio, hidrógeno, magnesio, nitrato, amonio, fluoruro, litio o mercurio. Básicamente, la técnica de microelectrodo selectiva de iones de autorreferencia convierte la actividad de un ion específico disuelto en una solución en un potencial eléctrico, que puede ser medida por un voltímetro. El cóctel de ionóforo es un líquido inmiscible fase (orgánica, lipófilo) con propiedades de intercambio iónico. El ionóforo complejos selectivamente (se une) iones específicos reversible y los transfiere entre la solución acuosa contenida en el microelectrodo (electrolito) y la solución acuosa en la que se sumerge el microelectrodo (Figura 1D). Esta transferencia de iones conduce a un equilibrio electroquímico y una variación del potencial eléctrico entre el microelectrodo y el electrodo de referencia se mide por el voltímetro. El voltaje es proporcional al logaritmo de la actividad del ión específico de acuerdo con la Nernst equation permitiendo el cálculo de la concentración de iones (Figura 2A y B). En la actualidad, varios sistemas permiten la medición del flujo de iones usando un concepto o principio similar. Por ejemplo, la técnica de electrodo de exploración de ion selectivo (SIET) 12,13 o la técnica de microelectrodos Ion Flux Estimation (MIFE) desarrollado por Newman y Shabala 14-16 están comercialmente disponibles y ampliamente utilizados por la comunidad de investigación con el fin de determinar ion específica fundentes que ocurre en la membrana celular y el tejido a través de una variedad de modelos de células vivas individuales animal, vegetal y. Microelectrodos selectivos de iones se han utilizado para medir hidrógeno, potasio y flujo de calcio a través de raíces de la planta 17, cloruro de flujo en las arterias cerebrales de rata 18 y 19 en los tubos de polen, flujo de hidrógeno en células de la retina del patín 20, el flujo de calcio en el hueso del ratón 21, vario ion flujos de hifas fúngicas 22 y en ren la córnea 23, y finalmente el flujo de calcio en las células sola herida de curación 12,24. Ver también la siguiente revisión para obtener información detallada sobre autorreferencia microelectrodos selectivos de iones 25. El siguiente artículo describe con detalle cómo preparar y llevar a cabo la medición de los flujos de iones extracelulares endógenos mediante la técnica de microelectrodos autorreferencia selectivo de iones a nivel de células individuales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IonAmp&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonAmp32&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage pre-amplifier</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>INA116</td>
			<td>BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroStep Driver</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micropositioner&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>Model KITE-R</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Model M10</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table&#160;&#160;</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model VW-3036-OPT-023040</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90&#176;, slotted faces</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model 360-90</td>
			<td>Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>460PD-X</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel</td>
			<td>Newport Inc.</td>
			<td>460A-XY</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>&#160;PC-10</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal rack</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>none</td>
			<td>Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>QL</td>
			<td>Model 10 Lab Oven</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silanization solution I&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85126</td>
			<td>Hazardous, handle as recommended by provider&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish; Pyrex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode/micropipette storage jar</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>E215</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-595E</td>
			<td>Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11597722</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S97329</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>QSW-A15P</td>
			<td>with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3S</td>
			<td>with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60872-306</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh</td>
			<td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td>
			<td>NTX750</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue; Loctite epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>500043-451</td>
			<td>Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>99053</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>none</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode technique

Las células de animales, plantas y células individuales están encerradas por una barrera llamada la membrana celular que separa el citoplasma desde el exterior. Capas de células tales como epitelios también forman una barrera que separa el interior del exterior o diferentes compartimentos de organismos multicelulares. Una característica clave de estas barreras es la distribución diferencial de iones a través de membranas celulares o capas de células. Dos propiedades permiten esta distribución: 1) membranas y epitelios presentan permeabilidad selectiva a iones específicos; 2) iones son transportados a través de bombas a través de las membranas celulares y capas de células. Estas propiedades juegan un papel crucial en el mantenimiento de la fisiología del tejido y actúan como una señal de señales después de los daños, durante la reparación, o bajo condición patológica. La referencia a sí misma microelectrodo selectiva de iones permite mediciones de flujos específicos de iones tales como calcio, potasio o sodio en los niveles de células y tejidos individuales. El microelectrodo contiene un cóctel ionóforo que espermeable selectivamente a un ion específico. La solución de relleno interna contiene una concentración conjunto de los iones de interés. El potencial eléctrico de la microelectrodo se determina por la concentración fuera del ión. Como la concentración de iones varía, el potencial de la microelectrodo cambia como una función del logaritmo de la actividad de los iones. Cuando se mueve hacia atrás y adelante cerca de una fuente o sumidero del ion (es decir, en un gradiente de concentración debido a flujo de iones) el potencial microelectrodo fluctúa a una amplitud proporcional al flujo de iones / gradiente. El amplificador amplifica la señal de microelectrodos y la salida se registra en el ordenador. El flujo de iones se puede calcular entonces por la ley de difusión de Fick usando la fluctuación electrodo de potencial, la excursión de microelectrodo, y otros parámetros tales como la movilidad de iones específico. En este trabajo se describe en detalle la metodología para medir los flujos de iones extracelulares utilizando la autorreferencia microelectrodo un ion-selectivod presentar algunos resultados representativos.

Hemos demostrado anteriormente que la entrada de calcio aparece después de una sola célula hiriendo a 24. Por lo tanto, preguntamos si otros flujos de iones se producen en una sola herida celular. Utilizamos la X. laevis ovocito, un modelo bien establecido para celular herida única curación 30-34 y registro electrofisiológico 24,35-39. Curiosamente, los iones de potasio son más concentrada dentro de X. laevis (aproximadamente 110 mm) 40 que en la soluci...

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Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Medición de la extracelular Ion fundentes Uso del referencias Ion selectivo microelectrodos Técnica

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

measurement-extracellular-ion-fluxes-using-ion-selective-self

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K vistas.  University of California, Davis. Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Video: Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Investigación

Biología

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

Recapitulación de una curva de canal iónico IV Uso de componentes de frecuencia

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

La medición de flujos rápidos de calcio en los cardiomiocitos

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

La medición cuantitativa de invadopodios mediada por proteolisis de la matriz extracelular en contextos simples y multicelulares

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Caracterización funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Intercambiadores de compartimentos intracelular usando selección Protón-matanza para expresarlos a la membrana plasmática

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Técnicas para el Análisis de extracelular vesículas Usando citometría de flujo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Medición y Análisis de la producción de ácido extracelular para Determinar glicolítica Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Establecimiento de un pH extracelular ácido sistema de cultivo

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...